Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Till att börja med, tillsätt karbinicillin och en millimolär IPTG för att styra och testa odlingsflaskor som innehåller S basala medier. Snurra ett rör som innehåller larver vid tillväxtstadium ett, även kallat L1-larver, i några minuter.
Tillsätt RNAi-bakterier som transporterar en icke-specifik RNAi-plasmid till kontrollkolven och bakterierna med geninriktad RNAi i testkolven.
Låt larverna växa med kontinuerlig skakning för att säkerställa korrekt syresättning. Larverna matar på bakterierna. Inuti larven binder det lilla störande RNA till det kompletterande mRNA som produceras av den riktade genen och hämmar proteinuttryck.
I exempelprotokollet behandlar vi L1-larver med RNAi som riktar in sig på daf-2-genen, i flytande kultur.
- För att påbörja behandlingen, tillsätt 207,45 milliliter S basala medier med ytterligare reagenser enligt beskrivningen i det medföljande textprotokollet till en 2 800 milliliter Fernbach odlingskolv.
Ta L1:an ur 25 graders Celsius inkubator och överför dem till 15 milliliterrör. Centrifuge L1:erna på 1 900 gånger g i tre minuter.
Lägg sedan till 50 000 maskar för den unga masksamlingen och 100 000 maskar för den åldrade masksamlingen i fyra Fernbach-odlingsflaskor som förberetts i föregående steg.
Efter tillsats av bakterier, komplett maskkultur med S basal för att få den totala volymen till 300 milliliter. Inkubera maskkulturen vid 25 grader Celsius i en skakande inkubator med 150 RPM fram till insamling.
