Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Для начала добавьте карбенициллин и один миллимолярный IPTG для контроля и тестирования культуры колб, содержащих S базальные медиа. Закрутьте трубку, содержащую личинки на первой стадии роста, также называемую личинками L1, в течение нескольких минут. Теперь удалите супернатант и поместите два микролитера L1s на агарную пластину. Поместите пластину под рассеченный микроскоп и подсчитайте количество личинок.
Добавить РНК бактерий, несущих неспецифические РНК плазмиды для контроля колбы и бактерий с геном ориентации РНК в тестовой колбе. Количество добавленных бактерий должно быть пропорционально количеству червей.
Пусть личинки растут с непрерывной тряской, чтобы обеспечить надлежащую оксигенацию. Личинки питаются бактериями. Внутри личинки, небольшая интервентная РНК связывается с дополнительной мРНК, вырабатываемой целевым геном, и подавляет экспрессию белка.
В примере протокола мы будем лечить личинки L1 с ПОМОЩЬю РНК, нацеленных на ген daf-2, в жидкой культуре.
- Чтобы начать лечение, добавьте 207,45 миллилитров базальных средств массовой информации S с дополнительными реагентами, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, к колбе культуры Фернбаха 2800 миллилитров. Добавьте окончательную концентрацию 50 микрограмм на миллилитр карбенициллина и 1 миллимолара IPTG и закройте колбу мембранной крышкой винта.
Возьмите L1s из 25 градусов по Цельсию инкубатора и передать их в 15 миллилитров труб. Центрифуга L1s на 1900 раз г в течение трех минут. После вращения, удалить супернатант. Под микроскопом, подсчитайте L1s на два микролитера, и в среднем номера, полученные от по крайней мере девять капель.
Далее добавьте 50 000 червей для сбора молодых червей и 100 000 червей для коллекции червей в четыре колбы культуры Фернбаха, подготовленные на предыдущем этапе. Затем добавьте контрольные бактерии РНК и бактерии РНК для гена, представляющих интерес пропорционально количеству червей.
После добавления бактерий, полная культура червя с S базальным довести общий объем до 300 миллилитров. Incubate червя культуры на 25 градусов по Цельсию в встряхивания инкубатора с 150 об /мин до сбора.
