Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Drosophila Activity Monitor, eller DAM, har sentrerte aktivitetsrør utstyrt med flymat i den ene enden og en luftgjennomtrengelig nærmere på den andre. Dette oppsettet har plass til enkeltfluer under eksperimenter som varer flere dager eller til og med uker.
Plasser DAM i et kontrollert miljø som en inkubator med innstilt temperatur, fuktighet og lyssyklus. Utfør eksperimentet i et mørkt rom, og bruk om nødvendig en infrarød lyskilde for å håndtere enheten, som i motsetning til sterkt lys ikke påvirker flyets sirkadiske system.
For å registrere lokomotorisk aktivitet, koble apparatet til et datasystem som lagrer avlesningene fra DAM-detektorene. DAM-ens elektronikk oppdager kontinuerlig integriteten til en infrarød stråle som sendes ut gjennom midtpunktet på hvert rør og laster regelmessig opp data til datasystemet.
Når flyet går frem og tilbake inne i røret, krysser den den infrarøde strålen. Disse avbruddene telles av DAM over tid for hvert rør og fungerer som et mål på flyaktivitet.
I følgende protokoll vil vi bruke DAM-systemet til å studere døgnrytmer hos drosophila voksne menn.
- Før lasting av fluer inn i aktivitetsrør, slå på inkubatorene som skal brukes til å huse aktivitetsmonitorene. Juster temperaturen ved hjelp av inkubatorkontrollene og still inn lys/mørk-regimet ved hjelp av DAM-systemlysregulatoren eller inkubatorens eget lyskontrollsystem, i henhold til ønsket eksperimentell design.
Deretter bedøver du fluene med karbondioksid. Deretter, ved hjelp av en fin pensel, overfør forsiktig en enkelt flue inn i et aktivitetsrør. Ta tak i midten av et enkelt stykke garn som er rundt en halv tomme med fine tang og sett garnet inn i den ikke-mat enden av aktivitetsrøret for å koble til åpningen og forhindre at flyet rømmer under eksperimentet, samtidig som luftstrømmen slippes inn i røret.
Hold røret lagt på siden til flyet våkner for å hindre at flyet setter seg fast i maten. Sett rørene inn i aktivitetsmonitorene. Med den nyere, mer kompakte modellen til TriKinetics-skjermene, er det nødvendig å holde rørene på plass med gummibånd for å sikre at den infrarøde strålen passerer røret i midtstilling.
Til slutt, sett aktivitetsmonitorene inn i inkubatorene og koble dem til datainnsamlingssystemet via telefonledningene. Sjekk, ved hjelp av DAM-systeminnsamlingsprogramvaren, at alle skjermene er koblet riktig, og at data blir samlet inn fra hver av dem.
Nå som fluene er lastet inn i aktivitetsrørene og det lokomotoriske aktivitetsovervåkingssystemet er klart, kan dataene nå registreres. Fluer synkroniseres og entraines ved å utsette dem for ønsket lys / mørk, eller LD, og temperaturregime i to til fem hele dager. Den mest brukte entrainmenttilstanden er en lys / mørk syklus på 12 timer lys / 12 timer mørkt ved 25 grader Celsius.
For studiet av døgnrytmer i forhold til denne protokollen, er tiden når lysene tennes i inkubatoren definert som zeitgebertid 0 og alle andre ganger er i forhold til den verdien. Under standard 12:12 LD forhold, vilt type Drosophila melanogaster viser vanligvis to utbrudd av aktivitet; en sentrert rundt ZT0, betegnet morgentopp, og en annen rundt ZT12, betegnet kveldstopp.
Frittgående lokomotoriske aktivitetsrytmer måles under konstante mørke og temperaturforhold etter innlæringsperioden. Innstillingen for lyssyklusen kan endres når som helst i den mørke fasen på den siste dagen av LD, slik at den påfølgende dagen av eksperimentet representerer den første dagen i DD. Syv dager med DD-datainnsamling er tilstrekkelig til å beregne døgnperioden og amplituden eller styrken av fluenes rytme.
Generelt er en prøvestørrelse på minst 16 fluer nødvendig for å oppnå pålitelige frittgående perioder for en bestemt genotype. Ved avslutningen av eksperimentet lastes rå binære data som samles inn ved hjelp av DAM-systemprogramvaren, ned til en bærbar datalagringsenhet, for eksempel en USB-nøkkel.
De rå binære dataene behandles ved hjelp av DAM Filescan102X, og summeres i 15 og 30 minutters skuffer når du analyserer circadian parametere, eller 1 til 5 minutters skuffer når du analyserer søvn / hvileparametere. For tiden er fem sammenhengende minutter med inaktivitet standarddefinisjonen av søvn / hvile i Drosophila.
