Encyclopedia of Experiments: Biology
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- El Monitor de Actividad Drosophila, o DAM, contiene tubos de actividad centrados equipados con alimentos para moscas en un extremo y un aire permeable más cerca del otro.
Coloque la PRESA en un entorno controlado como una incubadora con temperatura establecida, humedad y ciclo de luz. Realice el experimento en una habitación oscura y, si es necesario, utilice una fuente de luz infrarroja para manejar el dispositivo, que a diferencia de la luz brillante, no influye en el sistema circadiano de la mosca.
Para registrar la actividad locomotora, conecte el aparato a un sistema informático que almacena las lecturas de los detectores de la PRESA.
A medida que la mosca camina de un lado a otro dentro del tubo, cruza el haz infrarrojo.
En el siguiente protocolo, utilizaremos el sistema DAM para estudiar los ritmos circadianos en machos adultos de Drosophila.
- Antes de cargar moscas en tubos de actividad, encienda las incubadoras que se utilizarán para albergar los monitores de actividad. Ajuste la temperatura utilizando los controles de incubadora y establezca el régimen de luz/oscuridad utilizando el controlador de luz del sistema DAM o el propio sistema de control de luz de la incubadora, según el diseño experimental deseado.
A continuación, anestesia las moscas con dióxido de carbono. Luego, usando un pincel fino, transfiere suavemente una sola mosca a un tubo de actividad. Coge el medio de una sola pieza de hilo que es alrededor de media pulgada con fórceps finos e inserta el hilo en el extremo no alimentario del tubo de actividad para conectar la abertura y evitar que la mosca escape durante el experimento, al mismo tiempo que permite el flujo de aire en el tubo.
Mantenga el tubo colocado en su lado hasta que la mosca despierte para evitar que la mosca se atasque en el alimento. Inserte los tubos en los monitores de actividad.
Por último, coloque los monitores de actividad en las incubadoras y conéctelos al sistema de recogida de datos a través de los cables telefónicos.
Ahora que las moscas se han cargado en los tubos de actividad y el sistema de monitoreo de actividad locomotora está listo, los datos ahora se pueden registrar.
Para el estudio de los ritmos circadianos en relación con este protocolo, el momento en que las luces se encienden en la incubadora se define como zeitgeber tiempo 0 y todas las demás veces son relativos a ese valor. Bajo las condiciones estándar de 12:12 LD, tipo salvaje Drosophila melanogaster típicamente exhiben dos episodios de actividad; uno centrado alrededor de ZT0, llamado pico matutino, y otro alrededor de ZT12, llamado pico nocturno.
Los ritmos de actividad locomotora de funcionamiento libre se miden en condiciones constantes de oscuridad y temperatura después del período de entrenamiento. El ajuste para el ciclo de luz se puede cambiar en cualquier momento en la fase oscura en el último día de LD, de modo que el día siguiente del experimento representa el primer día de DD. Siete días de recolección de datos DD es suficiente para calcular el período circadiano y amplitud o fuerza de ritmo de las moscas.
En general, un tamaño de muestra de al menos 16 moscas es necesario para obtener períodos de ejecución libre fiables para un genotipo en particular. Al finalizar el experimento, los datos binarios sin procesar recopilados con el software del sistema DAM se descargan en un dispositivo de almacenamiento de datos portátil, por ejemplo, una clave USB.
Los datos binarios sin procesar se procesan utilizando DAM Filescan102X y se suman a contenedores de 15 y 30 minutos al analizar parámetros circadianos, o contenedores de 1 a 5 minutos al analizar parámetros de suspensión/descanso.
