Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- C. elegans wordt gebruikt als een experimenteel infectiemodel door darmpathogenen die ziekten veroorzaken, deels door de darmbarrière te verstoren, waardoor de permeabiliteit ervan toeneemt. Om de integriteit van de barrière te kwantificeren na blootstelling aan een bacterie of chemische verbinding van belang, verzamel wormen door ze van hun platen te wassen.
Plaats vervolgens deze wormen op agarplaten met gelabeld voedsel dat bestaat uit hittedodende E. coli gemengd met FITC-dextran, een polysacharide met een hoog molecuulgewicht met een fluorescerend label.
Laat de wormen de gelabelde bacteriën eten. Degenen met intacte darmbarrières zullen het voedsel snel opruimen, terwijl bij wormen met meer doorlatende darmen de fluorescerende marker voorbij het lumen van het orgaan zal doordringen.
Breng wormen over naar een formaldehyde-oplossing om de dieren te fixeren. Vervang na 1 tot 2 minuten het formaldehyde door montagemedia.
Stel ten slotte de wormen in beeld door fluorescerende microscopie. Merk op dat C. elegans darmkorrels autofluorescent zijn, dus er zal een achtergrondsignaal zijn. Maar over het algemeen duidt meer intestinale fluorescentie op een hogere permeabiliteit.
In het voorbeeldprotocol zullen we het effect van behandeling met het biomolecule DIM op de darmdoorlaatbaarheid van wormen die besmet zijn met pathogene Pseudomonas aeruginosa-bacteriën, evalueren.
- Bereid de FITC-dextran-aangevulde platen door 2 milliliter warmte-geïnactiveerde E. coli te mengen met 4 milligram FITC-dextran. Voeg 100 microliters van het mengsel toe aan elk van de 20 verse NGM-agarplaten en laat de platen een uur drogen op een schone laboratoriumbank. Was na 48 uur behandeling de wormen met S Buffer. Breng ze over naar FITC-dextran aangevulde platen en naar NGM-platen.
Was de volgende dag de wormen met S Buffer en laat ze een uur in de verse NGM-agarplaat kruipen. Voeg 50 microliters van 4% formaldehyde toe aan elke put van een zwarte 96-put platbodemplaat en breng ongeveer 50 wormen in elke put over. Verwijder na 1 tot 2 minuten alle formaldehyde en voeg 100 microliter montagemedium toe aan elke put.
- Formaldehyde is een giftige chemische stof en moet met zorg worden behandeld.
