Encyclopedia of Experiments: Biology
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- C. elegans se utiliza como modelo experimental de infección por patógenos intestinales que causan enfermedad, en parte, alterando la barrera intestinal, aumentando su permeabilidad. Para cuantificar la integridad de la barrera después de la exposición a una bacteria o compuesto químico de interés, recoger gusanos lavándolos de sus placas.
A continuación, coloque estos gusanos en placas de agar con alimentos etiquetados compuestos de E. coli matados por calor mezclados con FITC-dextran, un polisacárido de alto peso molecular con una etiqueta fluorescente.
Permita que los gusanos coman las bacterias etiquetadas.
Transferir gusanos a una solución de formaldehído para fijar los animales. Después de 1 a 2 minutos, reemplace el formaldehído con medios de montaje.
Por último, imagine los gusanos por microscopía fluorescente. Tenga en cuenta que los gránulos intestinales C. elegans son autofluorescentes, por lo que habrá señal de fondo. Pero en general, más fluorescencia intestinal indica una mayor permeabilidad.
En el protocolo de ejemplo, analizaremos el efecto del tratamiento con la biomolécula DIM sobre la permeabilidad intestinal de los gusanos infectados con bacterias patógenas Pseudomonas aeruginosa.
- Preparar las placas suplementadas con FITC-dextran mezclando 2 mililitros de E desactivado por calor. Coli con 4 miligramos de FITC-dextran. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada una de las 20 placas de agar NGM frescas y permita que las placas se sequen durante una hora en un banco de laboratorio limpio. Después de 48 horas de tratamiento, lave los gusanos con S Buffer. Transfiéralos a placas suplementadas fitc-dextran y a placas NGM sin FITC-dextran e incubar las placas durante la noche.
Al día siguiente, lave los gusanos con S Buffer y déjalos arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante una hora. Añade 50 microlitros de formaldehído al 4% de cada pozo de una placa negra de 96 pozo de fondo plano y transfiere aproximadamente 50 gusanos a cada pozo.
- El formaldehído es un químico tóxico y debe manipularse con cuidado.
