Zebra Balığı Optogenetiği: Larva Davranışsal Yanıtlarını İncelemek için Genetiği Değiştirilmiş Somatosensör Nöron'un Etkinleştirilmesi

- Zebra balığı larvalarında, görsel bir uyaran somatosensör nöronları aktive edebilir ve bir kaçış yanıtını tetikleyebilir. Larvalarda bulunan bu tür nöronların iki türü vardır, trigeminal ve Rohon-Beard nöronları. Bu nöronların aktivitesini transgenik ışığa duyarlı iyon kanallarını ifade etmek için modifiye ederek manipüle edebiliriz. Bu yaklaşıma optogenetik denir.

Bu tekniği gerçekleştirmek için, sırt tarafı agarose jeline bakan transgenik bir larva monte edin ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Agarose'un kama şeklindeki bir kısmını yumurta sarısı ve kuyruğunun etrafından ayırmak için bir jilet kullanın. Bu alanı yumurta suyuyla doldurun. Agarose'u larva gövdesinden ve kuyruğundan çekin.

Bir optik kablonun ucunu Rohon-Beard nöronunun hücre gövdesinin bulunduğu gövdenin yakınına yerleştirin. Mavi lazer ışığı darbesi verin. Mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, nöronun zarındaki transgenik ışığa duyarlı iyon kanalları açık, iyonların girmesine izin vererek kaçış tepkisini ortaya çıkarmak için bir eylem potansiyelini tetikleyin. Larvaların davranışını yüksek hızlı bir kamera kullanarak kaydedin.

Örnek protokolde, bir channelrhodopsin varyantını ifade ederek Rohon-Beard nöronunu aktive etmek için larvaları monte edeceğiz ve davranışsal tepkiyi gözlemleyeceğiz.

- Çift damıtılmış suda% 1.5 düşük eriyik agarose yapın ve katılaşmasını önlemek için 42 santigrat derecelik bir ısı bloğunda saklayın. Cam pastör pipet kullanarak, ön ekran larvalarından birini mümkün olduğunca az mavi embriyo suyu ile% 1.5 düşük eriyik agarose tüpüne aktarın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, larva dorsal tarafını yukarı yerleştirin. Agarose katılaştırıldığında, larvanın her iki tarafındaki agaroseyu kesmek için ince bir jilet kullanın. Agarose'u çevreleyen alanı embriyo mavisi suyla doldurun.

Daha sonra, yumurta sarısının her iki tarafının iki çapraz kesimini yapın, larvaları çalmamaya dikkat edin. Daha sonra, agarose'u gövdeden ve larva kuyruğundan çekin.

Şimdi yüksek hızlı kamerayı diseksiyon kapsamına takın ve kamerayı bilgisayara bağlayın. Sonra bilgisayarı ve yüksek hızlı kamerayı açın. Video görüntüleme yazılımını açın ve kamera ayarlarını yapın. Sonra, optik kabloyu, lazeri ve uyarıcıyı birbirine bağlayın. Sonra uyarıcıyı açın ve maksimum 5 volt ve 5 milisaniye darbe süresine ayarlayın.

Daha sonra, optik kablonun ucunu ChEF-tdTomato ifadesiyle bir nöron hücre gövdesinin yakınına konumlandırmak için floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Duyusal nöronu etkinleştirmek için mavi ışık darbesi verin. Ardından saniyede 500 veya 1.000 kare olarak ayarlanmış yüksek hızlı bir kamera kullanarak yanıtları kaydedin ve alışkanlıktan kaçınmak için aktivasyonlar arasında en az 1 dakika ile deneyleri tekrarlayın.

Larvayı serbest bırakmak için, agaroseyu forsepslerle ayırmak ve hayvanı yaralamamaya dikkat edin. Sonra taze mavi embriyo suyuna aktarın. Hayvanların daha fazla gelişmesine izin verilebilir ve prosedür daha eski aşamalarda tekrarlanabilir. Embriyo, davranışı hücresel yapı ile ilişkilendirmek için aktif hücrenin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesi için de yeniden monte edilebilir.