Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- I sebrafisk larver, en visuell stimulans kan aktivere somatosensoriske nevroner og utløse en fluktrespons. Det finnes to typer slike nevroner som finnes i larven, trigeminale og Rohon-Beard nevroner. Vi kan manipulere aktiviteten til disse nevronene ved å modifisere dem til å uttrykke transgene lysfølsomme ionkanaler. Denne tilnærmingen kalles optogenetikk.
For å utføre denne teknikken, monter en transgen larve med dorsalsiden vendt opp i agarose gel og legg den under et dissekerende mikroskop. Bruk et barberblad for å løsne en kileformet del av agarose fra rundt eggeplommen og halen. Fyll dette området med eggvann. Trekk agarose bort fra stammen og halen av larven.
Plasser spissen av en optisk kabel nær bagasjerommet der cellekroppen til Rohon-Beard-nevronen er plassert. Lever en puls av blått laserlys. Ved eksponering for det blå lyset, de transgene lysfølsomme ionkanalene i nevronens membran åpen, slik at ioner kan komme inn, utløser et handlingspotensial som fremkaller rømningsresponsen. Registrer larvens oppførsel ved hjelp av et høyhastighetskamera.
I eksempelprotokollen vil vi montere larver for å aktivere Rohon-Beard-nevronen, uttrykke en channelrhodopsin-variant og observere atferdsresponsen.
- Lag 1,5% lavsmelting agarose i dobbeltdestillert vann og lagre i en 42 grader Celsius varmeblokk for å forhindre at den størkner. Bruk en glass Pasteur pipette, overfør en av prescreen larver til et rør på 1,5% lavsmelting agarose med så lite blått embryovann som mulig. Deretter overføre larven i en dråpe agarose til en liten Petri-tallerken.
Under et dissekerende mikroskop, plasser larvens dorsal side opp. Når agarose er størknet, bruk et tynt barberblad for å kutte bort agarose fra begge sider av larven. Fyll området rundt agarose med embryoblått vann.
Deretter gjør du to diagonale kutt på begge sider av eggeplommen, vær forsiktig så du ikke stjeler larven. Etterpå trekker du agarose bort fra stammen og halen av larven.
Monter nå høyhastighetskameraet på dissekeringsområdet og koble kameraet til datamaskinen. Slå deretter på datamaskinen og høyhastighetskameraet. Åpne videoavbildningsprogramvaren og juster kamerainnstillingene. Deretter kobler du til den optiske kabelen, laseren og stimulatoren sammen. Slå deretter på stimulatoren og sett den til maksimalt 5 volt og en pulsvarighet på 5 millisekunder.
Deretter bruker du det fluorescerende dissekeringsmikroskopet til å plassere spissen av den optiske kabelen nær en nevroncellekropp med ChEF-tdTomato-uttrykk. Lever en puls av blått lys for å aktivere den sensoriske nevronen. Deretter registrerer du svarene ved hjelp av et høyhastighetskamera satt til 500 eller 1000 bilder per sekund og gjentar forsøkene med minst 1 minutt mellom aktiveringer for å unngå habituation.
For å frigjøre larven, lirke fra hverandre agarose med tang og vær forsiktig så du ikke skader dyret. Deretter overføres det til friskt blått embryovann. Dyrene kan få lov til å utvikle seg videre, og prosedyren kan gjentas på eldre stadier. Embryoet kan også monteres på nytt for høyoppløselig konfokal avbildning av den aktiverte cellen for å korrelere oppførselen med cellulær struktur.
