Encyclopedia of Experiments: Biology
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- ज़ेब्राफ़िश लार्वा में, एक दृश्य उत्तेजना सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स को सक्रिय कर सकती है और एस्केप रिस्पांस को ट्रिगर कर सकती है। लार्वा, ट्राइजेमिनल और रोहन-दाढ़ी न्यूरॉन्स में दो प्रकार के ऐसे न्यूरॉन्स पाए जाते हैं। हम ट्रांसजेनिक प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनलों को व्यक्त करने के लिए इन्हें संशोधित करके इन न्यूरॉन्स की गतिविधि में हेरफेर कर सकते हैं।
इस तकनीक को करने के लिए, एक ट्रांसजेनिक लार्वा को माउंट करें जिसमें पृष्ठीय पक्ष एगर उठे जेल में सामना करना पड़ता है और इसे विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखते हैं। जर्दी और पूंछ के चारों ओर से एग्रास के एक कील के आकार के हिस्से को अलग करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। इस क्षेत्र को अंडे के पानी से भरें। एग्रावा को ट्रंक और लार्वा की पूंछ से दूर खींचें।
ट्रंक के पास ऑप्टिक केबल की नोक को रखें जहां रोहन-दाढ़ी न्यूरॉन का सेल बॉडी स्थित है। नीली लेजर लाइट की पल्स डिलीवर करें। नीली रोशनी के संपर्क में आने पर, न्यूरॉन की झिल्ली में ट्रांसजेनिक लाइट-सेंसिटिव आयन चैनल खुले, आयनों को प्रवेश करने की अनुमति देते हैं, जिससे एक एक्शन क्षमता ट्रिगर होती है जो भागने की प्रतिक्रिया को प्राप्त करती है। हाई-स्पीड कैमरे का उपयोग करके लार्वा के व्यवहार को रिकॉर्ड करें।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम रोहन-दाढ़ी न्यूरॉन को सक्रिय करने के लिए लार्वा को माउंट करेंगे, एक चैनलरोडोप्सिन संस्करण व्यक्त करेंगे और व्यवहार प्रतिक्रिया का निरीक्षण करेंगे।
- डबल-डिस्टिल्ड पानी में 1.5% कम पिघला हुआ एगर उठे और इसे जमने से रोकने के लिए 42 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में स्टोर करें। एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, प्रीस्क्रीन लार्वा में से एक को 1.5% कम पिघलाए की ट्यूब में स्थानांतरित करें जितना संभव हो सके।
एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, लार्वा पृष्ठीय पक्ष को ऊपर की स्थिति में रखें। जब एगर उठे हुए हैं, तो लार्वा के दोनों किनारों से एग्वै को काटने के लिए एक पतले रेजर ब्लेड का उपयोग करें। agarose के आसपास के क्षेत्र को भ्रूण नीले पानी से भरें।
इसके बाद, जर्दी के दोनों किनारों के दो विकर्ण कटौती करें, सावधान रहें कि लार्वा को निक न करें। बाद में, एगरे को ट्रंक और लार्वा की पूंछ से दूर खींचें।
अब हाई-स्पीड कैमरे को विच्छेदन दायरे पर माउंट करें और कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें। इसके बाद कंप्यूटर और हाई-स्पीड कैमरा चालू करें। वीडियो इमेजिंग सॉफ्टवेयर को खोलें और कैमरा सेटिंग्स को एडजस्ट करें । इसके बाद ऑप्टिक केबल, लेजर और उत्तेजक को एक साथ कनेक्ट करें । फिर उत्तेजक को चालू करें और इसे अधिकतम 5 वोल्ट और 5 मिलीसेकंड की पल्स अवधि के लिए सेट करें ।
इसके बाद, फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक न्यूरॉन सेल बॉडी के पास ऑप्टिक केबल की नोक को ChEF-tdTomato अभिव्यक्ति के साथ रखें। संवेदी न्यूरॉन को सक्रिय करने के लिए नीली रोशनी की एक नाड़ी वितरित करें। 500 या 1,000 फ्रेम प्रति सेकंड पर सेट किए गए हाई-स्पीड कैमरे का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें और आदत से बचने के लिए सक्रियणों के बीच कम से कम 1 मिनट के साथ प्रयोगों को दोहराएं।
लार्वा को छोड़ने के लिए, जिज्ञासा के अलावा, संदंश के साथ agarose के अलावा और जानवर को घायल करने के लिए सावधान रहना । फिर इसे ताजा नीले भ्रूण के पानी में स्थानांतरित करें । जानवरों को और विकसित करने की अनुमति दी जा सकती है, और प्रक्रिया को पुराने चरणों में दोहराया जा सकता है । सेलुलर संरचना के साथ व्यवहार को सहसंबंधित करने के लिए सक्रिय कोशिका के उच्च संकल्प कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए भ्रूण को भी फिर से बढ़ाया जा सकता है ।
