Vi presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale delle biblioteche unico sito di saturazione di mutagenesi complete di proteine che utilizzano high-throughput sequencing. È importante sottolineare che questo approccio utilizza coppie di primer ortogonali al multiplex di costruzione di biblioteche e sequenziamento. Risultati rappresentativi utilizzando TEM-1 β-lattamasi selezionato ad un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina sono forniti.