Name: Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a aislar células guarda de estomas intactas de tejido foliar vegetal mediante digestión enzimática y extracción con fenol. Este método mejora la calidad de muestras para estudios de señalización celular y análisis proteómicos.

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Agradecemos a Daniel Chen de la Digital Video producción equipo de Buchholz High School secundaria para la asistencia en la edición de vídeo. Esta investigación sobre las células estomáticos de guardia, la proteómica y la metabolómica en el laboratorio de Chen ha sido apoyada por becas de la Fundación Nacional de ciencia (0818051, 1158000 y 1412547). Wenwen Kong es apoyado por el Consejo de becas de China. Dr. Qiuying Pang es apoyado por el Consejo de becas de China y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31570396).

1. cultivo de plantas
<ol><li>Germinar las semillas en macetas la mezcla. Crecen las plantas en una cámara de crecimiento con una intensidad de luz de 140 μmol fotones m−2 s −1 y un fotoperíodo de luz de 8 h a 22 ° C y 16 h oscuro a 18 ° C durante 2 semanas.</li>
	<li>Trasplante de plántulas de tamaños similares individualmente macetas de 4" de diámetro que contiene el suelo y crecer para 3 semanas en las mismas condiciones adicionales describen en el paso 1.1. Nota: Regar plantas con agua del grifo dos veces a la semana para mantener el suelo húmedo.</li>
</ol>2. preparación de estomas enriquecidos
<ol><li>Quitar las hojas de las plantas de a. thaliana 5 - antiguas de semana individuales con un bisturí.</li>
	<li>Fije cada hoja a dos trozos de cinta Scotch transparente, con una sola pieza adhiriéndose a la abaxial (envés) y la otra pieza adhiriéndose al lado adaxial (superior) de la hoja. Deja la cinta en la hoja 5 s.</li>
	<li>Suave piel aparte los dos pedazos de cintas con el dedo índice y el pulgar en cada mano para separar el lado abaxial con pavimento y protector de las células y el lado adaxial con las células del mesófilo.</li>
	<li>Lugar la corteza desde el lado abaxial de las hojas en 60 mL de apertura de estomas tampón (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, ajustado a pH 6,2 con 1 M de KOH) en tamaño 40 × 12 mm Petri platos como son recolectados.<ol>
<li>Repita los pasos anteriores hasta que se recogen todos los peelings de muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los platos Petri que contienen las cáscaras en la cámara de crecimiento bajo condiciones de luz en el paso 1.1. Dejar las cáscaras a la luz por 2 h abrir completamente los estomas.</li>
	<li>Lugar pela en 150 mm x 20 mm placa de Petri que contenga 50 mL de digerir la mezcla de enzimas (celulasa 0,7% R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (p/v) polivinilpirrolidona-40 y albúmina de suero bovino 0.25% (p/v) en solución básica 55% (0,55 M sorbitol, 0,5 mM de la pared celular CaCl2, 0,5 mM MgCl2, el ácido ascórbico 0.5 mM, 10 μm KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic ácido (MES) a pH 5.7 ajustar con 1 M de KOH).</li>
	<li>Sacuda las cáscaras en un agitador recíproco en una placa Petri a 50 rpm por 20 min.</li>
	<li>Quitar cáscaras de solución enzimática con pinzas después de 20 minutos las cáscaras de transferencia a un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño 50 ml de agua.</li>
	<li>Usando una pipeta, enjuague cáscaras por 15 s dos veces con 10 mL de agua para eliminar cualquier solución enzimática residual.</li>
	<li>Utilice unas pinzas para colocar las cáscaras en un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño con 50 mL de estomas frescos apertura buffer como se utiliza en el paso 2.4. Incubar durante 1 h en condiciones de luz en paso 1.1 para permitir que los estomas recuperar.</li>
</ol>3. el ácido abscísico (ABA) tratamiento y análisis de movimiento de estomas
<ol><li>En un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño. Incubar las cáscaras estomas enriquecido a 30° C durante 15 minutos en 50 mL de la solución de la apertura estomática o en 50 mL de la solución de la apertura estomática con una concentración final de 10 μm ABA para el tiempo de tratamiento apropiado.</li>
	<li>Coloque cáscaras en un agitador a 50 rpm para 5, 15 y 30 min. Después de cada intervalo de tiempo un Quite con las pinzas y siga los pasos de la imagen en el paso 3.3.</li>
	<li>Tomar imágenes de estomas antes del tratamiento de la ABA y en los distintos puntos de tiempo después del tratamiento de ABA con un microscopio de luz.<ol>
<li>Tome una cáscara y colocarlo en un portaobjetos de vidrio.</li>
		<li>Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio y ajustar la etapa que se puede visualizar la imagen de la piel.</li>
		<li>Ajuste de la multa y curso de enfoque en el microscopio para obtener una imagen clara de las células del protector.</li>
		<li>Tomar varias imágenes de estomas múltiples en 40 aumentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir 60 aberturas stomatal con ImageJ8.</li>
	<li>Calcular el error estándar y la significación en un valor de p < 0,05 de las 60 medidas de la abertura estomática.</li>
</ol>4. proteína extracción y separación de SDS-Page
<ol><li>Moler las cáscaras de 15 s en suficiente nitrógeno líquido para cubrir las cáscaras con un frío mortero y una maja.</li>
	<li>Por 50 cáscaras, añadir 3 mL de fenol saturado de Tris (pH 8.8) y tampón de extracción de proteína de 3 mL (0.9 M sacarosa, 0.1 M Tris-HCl, EDTA de 0.01 M, 0.4% 2-Mercaptoetanol, 10 μl de inhibidor de proteasa y fosfatasa 1 mM) con una pipeta para el mortero y luego moler las cáscaras de 5 addi minutos adicionales en una campana de humos.</li>
	<li>El extracto utilizando una pipeta de transferencia y las cáscaras con unas pinzas metálicas para un Oakridge tubo de centrífuga y agitan en un agitador a 50 rpm por 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Quitar las cáscaras del tubo de centrífuga de Oakridge y centrifugue el extracto a 5.000 x g por 10 min. A continuación traslado de la fase fenólica superior a un tubo nuevo de microcentrífuga limpio utilizando una pipeta.</li>
	<li>Precipitado el fenol extrae las proteínas mediante la adición de 5 volúmenes de acetato de amonio de 0.1 M helada en metanol al 100%. Brevemente Vortex e incubar durante la noche a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugue a 20.000 x g a 4 ° C por 20 min, decantar el sobrenadante, vertiendo lentamente el tubo y retener el precipitado de la proteína en el tubo.</li>
	<li>Lavar el precipitado de proteínas dos veces con acetato de amonio de 0.1 M en metanol y luego dos veces con acetona al 80% y una vez con acetona fría al 100%. Nota: Se hacen lavados añadiendo 10 mL de reactivo especificada al tubo de proteína. Agitar en un agitador a 50 rpm por 5 min, seguido de centrifugación a 15.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos. Luego verter el reactivo del tubo de retención sólo el precipitado de proteína.</li>
	<li>Añadir 1 mL de acetona fría 100% a la pastilla y resuspender transfiriendo lentamente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Suspensión de proteína de transferencia a través de la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Eliminar la acetona por decantación del tubo y secar el pellet en campana durante 10 minutos.</li>
	<li>Disolver la proteína en un tubo de microcentrífuga con 200 μL de buffer de disolución (8 M urea, 0.5% SDS, 30 mM Tris-HCl a pH 8,5) y agitar durante 30 minutos la centrifugadora a 20.000 x g a 15 ° C por 20 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.</li>
	<li>Cuantificar la concentración de proteína siguiendo el protocolo de cuantificación de proteínas9.</li>
	<li>Utilizar muestras de proteína para separación de proteínas por electroforesis del gel siguiendo el protocolo10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Protector de las células son un sistema modelo para estudiar los mecanismos de transducción de señal en las plantas y es importante asegurar que la preparación de las muestras utilizadas en el estudio es el más apropiado para responder a cuestiones biológicas. A pesar del creciente interés en las células de guardia dentro de la comunidad de investigación de la planta, no hay ningún método universal de cómo preparar células estomáticos de protector que permita el movimiento estomático y la fisiología así como los cambios ...

Estomas juegan un papel importante en la fisiología general y la aptitud de plantas. Estas estructuras específicas de la pequeña planta están formadas por dos células epidérmicas especializadas conocidas como células de guardia y se encuentran más abundantemente en la superficie abaxial de las hojas. Estomas son necesarios para el intercambio de gases entre la planta y la atmósfera, así como el control de la pérdida de agua por transpiración. Protector de las células regulan la abertura de estomas a través de la integración de diferentes externo (por ejemplo, luz, humedad, contacto del patógeno, los niveles de dióxido de carbono) e internas (ej., las hormonas endógenas) estímulos1,2. En los últimos 20 años, este tipo de célula se ha convertido en un sistema modelo para estudiar la célula señalización de procesos en plantas. Estas células constituyen una pequeña fracción de las células totales en una hoja; por lo tanto, para investigar su celular único, propiedades bioquímicas y moleculares en forma unicelular, es necesario aislarlos de otros tipos de células de la hoja. En el pasado, protector celular estudios han implicado a menudo la preparación de guardia celular protoplastos (GCP)3,4,5. Esto normalmente requiere el uso de grandes cantidades de enzimas degradantes de la pared celular y o disrupción mecánica mediante mezcla y ha demostrado ser costosa y desperdiciadora de tiempo que generalmente toma muchas horas para preparar una muestra GCP, a menudo veces con poco rendimiento. Más importante aún, porque guarda células actúan como pares completados para regular la abertura de estomas, el uso de BPC puede verse como un sistema artificial para estudiar la señalización de las células del protector.
Aquí, hemos desarrollado un método para preparar los estomas en la que las células intactas de guardia se enriquecen y mantener respuestas fisiológicas a los estímulos. Este método fue inspirado por un método que se utilizó para aislar células de mesófilo protoplastos6,7. En nuestro método, los estomas se preparan con clara cinta Scotch primero separar la mayoría de las células del mesófilo acoplado a la capa adaxial de la hoja de la capa abaxial con el pavimento y las células de guardia. Esto se hace por poner un trozo de cinta a cada lado de la hoja y pelarlos aparte. Las células de la capa abaxial pueden recuperar bajo la luz en un búfer de apertura de estomas. Más tarde se eliminan las células restantes del pavimento con una pequeña cantidad de pared celular, degradación de las enzimas, dejando atrás el protector de la célula que se enriquecen en la cinta.
En este sencillo método, estomáticos protector células viables y sensible puede rápidamente y eficientemente Prepárate, toma menos de una hora para obtener células de guardia estomáticos enriquecidas de 50 cáscaras con un coste mínimo de. El método aquí impone menos daño a las células de la planta que los métodos anteriores donde se preparan los protoplastos. Además, los materiales recogieron de esta cantidad de proteína accesible método rendimiento. Lo más importante, porque la hoja no se somete a fusión o tiempos de digestión larga y protector de las células permanecen intactas, los resultados de estudios más de cerca será relevantes a la biología natural protector de la célula. Con este método, movimientos estomáticos pueden correlacionarse en tiempo real con cambios a nivel molecular. Así, el conocimiento obtenido de los estudios utilizando este método de preparación sería importante para una comprensión más completa de señalización celular de guardia.
Se utilizó la planta thaliana de Arabidopsis como modelo; sin embargo, este protocolo puede aplicarse para el enriquecimiento de células estomáticos de guardia en otras especies de plantas como Brassica napus con pequeñas modificaciones en el tiempo de digestión. Como una prueba de concepto, hemos demostrado que las células de guardia estomáticos enriquecidas a través de este método son viables y en respuesta a estímulos como se muestra por la fluoresceína diacetato (FDA) análisis y estudios de utilización del hormona de la planta el ácido abscísico (ABA), respectivamente. Además, hemos demostrado que las proteínas de alta calidad pueden ser aisladas de estas células del protector. Aquí, describimos un protocolo detallado de este proceso.

<table><tbody><tr><td>bisturí quirúrgico de acero inoxidable</td><td>Feather&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Cinta adhesiva (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult Industria Farmacéutica Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Industria Farmacéutica Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DM6000B</td>Cócteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa de <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Tubos de centrífuga PPCO de alta velocidad Oak Ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Kit de cuantificación de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Ácido abscísico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>empresas de BWI&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampón de muestra</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (2 ml)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Gel Prefabricado</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

cinta-cáscara de estomas: un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

El estudio de las células del protector es esencial para el conocimiento de las contribuciones específicas de este tipo de células a la función general de las plantas. Sin embargo, a menudo es difícil aislar y así estudiarlos a menudo proporciona un desafío.
Este estudio establece un método de enriquecimiento de célula estomática de guardia. El protocolo utiliza cinta adhesiva para aislar células de guardia y extracto de proteínas de las células. Este método mejora la integridad y el rendimiento de protector de la célula durante el aislamiento y ofrece una muestra fiable para el estudio de procesos de señalización celular y cómo correlacionan con fenotipos movimiento estomático. En este método, las hojas de la planta fueron repartidas entre dos porciones de la cinta y peladas aparte para quitar el lado abaxial. Este protocolo se aplicó en tejido foliar de Arabidopsis para aislar células del protector. Las células fueron tratadas con fluoresceína diacetato (FDA) para determinar la viabilidad y el ácido abscísico (ABA) para evaluar el movimiento de los estomas en respuesta a ABA. En conclusión, este protocolo resulta útil para la preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos y aislamiento de proteínas. La calidad de las células y las proteínas aquí obtenidos permiten fisiológico y otros estudios biológicos.

Una imagen representativa de Arabidopsis protector de las células antes y después de la digestión del mesófilo y las células epidérmicas se muestra en la figura 1. Viabilidad de las células del protector antes y después del retiro del mesófilo y las células epidérmicas puede observarse con la FDA para medir la actividad enzimática y la integridad de la membrana de la célula (figura 1B y 1D). ...

Este protocolo describe un método de preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos que es útil para estudios fisiológicos y otros biológicos.

Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

El objetivo general de este experimento es preparar células protectoras de estomas enriquecidas de alta calidad para análisis fisiológicos, bioquímicos y moleculares, como transcriptómica, proteómica y metabolómica. Hola, mi nombre es Sheldon Lawrence. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Chen en el Departamento de Biología de la Universidad de Florida.Hoy voy a mostrarte cómo aislar células protectoras del tejido de las hojas de las plantas que son material útil para estudiar tanto la fisiología como la biología de los estomas. Este método se considera un método novedoso para aislar las células protectoras. Permite específicamente el enriquecimiento de células protectoras intactas y proporciona muestras fiables para el estudio de los procesos de señalización de las células estomáticas.La aplicación de este método puede extenderse a las plantas de Brassicaceae y otras especies de plantas con solo una pequeña modificación en el protocolo. La demostración es importante, ya que el paso principal para enriquecer las celdas de guardia puede resultar un desafío. Para comenzar, seleccione plantas maduras de Arabidopsis de cinco semanas de edad.Retire con cuidado una hoja con un bisturí, cortando la hoja en la base. Tome dos pedazos de cinta adhesiva y coloque la hoja extirpada entre ellos. Aplique presión suavemente en ambos lados mientras se asegura de que el extremo de las piezas de cinta no se adhiera.Esto se puede hacer insertando un dedo entre ellos. Retire suavemente los dos trozos de cinta adhesiva entre sí e inmediatamente haga flotar la cáscara tomada del lado abaxial de la hoja en el tampón de apertura de los estomas. Una vez que se hayan recogido todas las cáscaras, colóquelas bajo la luz.Déjalos allí durante dos horas. Tome varias cáscaras y colóquelas en portaobjetos de microscopio. Con un microscopio óptico, ajuste las lentes para ver las células protectoras y asegúrese de que estén abiertas.Coloque las cáscaras en 50 ml de la solución enzimática de digestión de la pared celular. Flotar e incubarlos a 26 grados centígrados. Después de 20 minutos, retire las cáscaras de la solución enzimática y enjuague brevemente dos veces con agua desionizada, y colóquelas en un tampón de apertura de estomas fresco.Triturar las cáscaras en un mortero con nitrógeno líquido, con un mortero. A continuación, realice la extracción de fenol como se describe en el texto. Después de moler las cáscaras en un mortero con un mortero, transfiera el extracto, junto con las cáscaras a un tubo de centrífuga Oak Ridge, y agite en una coctelera durante una hora a cuatro grados centígrados.Precipitar las proteínas extraídas con fenol añadiendo cinco volúmenes de acetato de amonio de 0,1 mol helado en metanol al 100%. Después de precipitar la proteína durante la noche a 20 grados centígrados, coseche la proteína por centrifugación y realice lavados de pellets como se describe en el texto. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de acetona fría y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante de acetona y seque el pellet durante diez minutos. Disuelva la muestra de proteína en un tampón de disolución. Después del vórtice y la centrifugación, recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteínas.Ejecute un gel SDS-PAGE. Visualice las bandas de proteínas separadas y observe la calidad relativa de las proteínas. Esta es una imagen representativa de las células protectoras de Arabidopsis antes y después de la digestión enzimática del mesófilo y las células epidérmicas.La viabilidad de las células protectoras antes y después de la extirpación de las células mesófilas y epidérmicas se puede observar utilizando diacetato de fluoresceína, que mide la actividad enzimática y la integridad de la membrana celular. Como puede ver, las células protectoras siguen siendo viables después del peeling y la digestión enzimática. Este ejemplo ilustra el movimiento de los estomas de Arabidopsis en respuesta al tratamiento con ABA.Las células protectoras responden al tratamiento y la apertura de los estomas disminuye más del 50% después de 30 minutos de tratamiento con ABA. Aquí hay un curso de tiempo del movimiento de los estomas. Además, se muestra una imagen representativa de la apertura de los estomas en cada punto de tiempo.La detección, separación y abundancia relativa de proteínas es observada por SDS-PAGE. Las bandas son claras y distintas. Se incluyen cuatro réplicas biológicas para enfatizar la reproducibilidad de la extracción de proteínas a partir de este método.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentamos correlacionar los cambios moleculares de las células protectoras en tiempo real con el movimiento de los estomas. Una vez dominada, se puede preparar una muestra de proteína de las células protectoras de los estomas en unas pocas horas y se puede utilizar en múltiples experimentos. Es importante recordar que no debe infligir una gran cantidad de daño a las celdas protectoras mientras se pelan y manipulan.Siguiendo este método, se pueden aplicar otras técnicas para investigar la señalización de las células protectoras, como el marcaje isobárico para estudiar la respuesta redux de las proteínas en las plantas en condiciones normales y de estrés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y enriquecer células protectoras intactas y viables, así como extraer proteínas de alta calidad apropiadas para estudios posteriores.

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Investigación

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Biología

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Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.

Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana

Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.

Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Aquí, presentamos un método simple para la observación directa y la medición automatizada de las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana. Este método aprovecha un dispositivo portátil de imágenes estomáticas, junto con una canalización de análisis de imágenes diseñada para imágenes foliares capturadas por el dispositivo.

Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Este protocolo presenta un método comparativo para evaluar rasgos estomales y epidérmicos en dos especies distintas utilizando peelings epidérmicos, técnicas de limpieza y análisis de imágenes asistido por IA. El objetivo es permitir la cuantificación reproducible y de alto rendimiento de las estructuras celulares que subyacen a la función estomática para aplicaciones agrícolas y para la investigación vegetal en general.

Caracterización de rasgos estomales y epidérmicos mediante peelings, limpieza y análisis de imágenes basados en IA

Aprenda a aislar células guarda de estomas intactas de tejido foliar vegetal mediante digestión enzimática y extracción con fenol. Este método mejora la calidad de muestras para estudios de señalización celular y análisis proteómicos.

Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula

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