Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri
Chapters
Summary October 9th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Forsøgsmetoden på Immunofænotypning af murine orthotopic PDAC homografts sigter profilering tumor immuno-mikromiljø. Tumorer er orthotopically implanteret via kirurgi. Tumorer i 200-600 mm3 i størrelse blev høstet og adskilles for at forberede encellede suspensioner, efterfulgt af flere immun markør FACS analyse ved hjælp af forskellige fluorescently-mærket antistoffer.
Transcript
Denne meddelelse kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i Immunophenotyping i Murine modeller, såsom markører bruges til at identificere forskellige immunitet slægter og aldring strategier. Den største fordel ved denne teknik er, at markør og aldring stategies, når immunophenotyping, kan gælde for en række murine modeller. Overvåg kropsvægten på C57 Black 6 mus ved hjælp af en balance.
Også, overvåge tumor volumen af tumor varierende donor mus ved kaliber måling. Efter dødshjælp af dyret i en biologisk hætte som pr protokol, sterilisere huden omkring tumoren ved hjælp af Iodophor svaberprøver. Efter kirurgisk fjernelse af tumoren som beskrevet i tekstprotokollen, placere tumor i en petriskål, der indeholder 20 milliliter PBS, der er blevet forkølet til 4 grader Celsius.
Hvis der er forurenende blod, overføre tumoren i en anden petriskål og vaske tumor med PBS. Skær tumoren i halve. Fjern eventuel ekstra hud, kar, forkalkning og nekrose.
Vælg kun intakte stykker tumor og læg dem i et sterilt 50 milliliter centrifugerør. Tilsæt 20 milliliter PBS, før rør transporteres til et separat dyrerum til farmakologiske undersøgelser. For at forberede sig til ortopisk implantation, fastsætte en fuldt bedøvende mus på et eksperiment bord i den rigtige laterale position.
Desinficere huden omkring milten med idodin og derefter afdodinate med 75% ethylalkohol. Find medianpunktet af milten og gøre en 1 centimeter lodret snit på maven til at udsætte milten. Forsigtigt trække en del af bugspytkirtlen væv under milten ved hjælp af flad spids pincet.
Og sutro mus homograft tumor stykke fra C musen på bugspytkirtlen af modtageren musen ved 9-O bsorbable kirurgisk sutur. Luk maven med en 6-O silke sutur af dobbelt søm. Opnå homøostase ved kompression.
Efter endt tumor implantation, holde dyret i et varmt bur, så længe ingen blødning eller tumorvæv lækage opstår. Overvåg dyret, indtil de genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Returner dyret til dyrerummet efter fuld helbredelse fra anæstesi.
Overvåge tumor varierende mus ved palpating maven nær milten og udvælge mus forsynet med ortopiske tumorer. For hver tumor, forberede en C-rør med tumor fordøjelse buffer. Brug 3 milliliter fordøjelsesbuffer for tumorfragmenter mindre end 0,8 gram for at sikre, at tumoren er fuldt fordøjet.
Mærke tumor med undersøgelsen kode, tumor, muse-id, behandling gruppe, og tumor vægt. Indsamle tumor fra musen. Vask tumoren i koldt PBS og rense ud væv knyttet på tumoren.
Placer tumor i fordøjelsesmedier i en brønd af en steril 6-brønd plade. Hold tumoren på plads med sterile pincet eller pincet og skær med en skalpel. Skær tumoren godt nok til at bryde i mindre stykker.
Nu, placere tumor stykker tilbage i C-rør og bruge de resterende fordøjelse buffer til at vaske pladen. Overfør væsken ind i C-røret og læg den på is, indtil du fordøjelsen. Tænd derefter dissociatoren med varmeapparater.
Placer tumor dissociation C-rør på hovedet i ærmet på den ledige position. Juster status for rørpositionen fra Fri til Udvalgt. Vælg et dissociationsprogram, der skal følges af valget af den ønskede mappe, hvor listen over programmer vises.
Efter programmets afslutning udtages C-røret af dissociatoren, og der drejes kortvarigt om til pallen af prøven. Nu, re-suspendere prøverne og læg dem i en celle si over en 50 milliliter rør. Vask cellen gennem cellestingen med 10 milliliter vaskebuffer for at give en enkelt cellesuspension.
Efter centrifugeringsrøret ved 300 G i 5 minutter kasseres supernatanten, og cellerne suspenderes igen med en 5 milliliter vaskepude. Tæl levedygtige celler, og juster cellekoncentrationen til 1 million celler pr. rør eller pr. prøve. Udfør immunpaneldesign, immunstaining og fluorescens minus én kontrol som detalje i tekstprotokollen.
Forbered UltraComp perler, mens flow instrumenter varmer op ved vortexing dem grundigt før brug. Mærke et separat 12 x 75 millimeter prøverør for hver fluorochromes konjugeret antistoffer. Tilføj 100 mikroliter af farvning buffer til hvert rør følge med en fuld dråbe af perlerne.
Tilføj antistoffer og udfør farvningsproceduren som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter tilsættes 0,5 milliliter farvning buffer til hver perle pellet og helt re-suspendere via vortex. Sæt nu Flow cytometri PMT spænding pr målvæv for det givne eksperiment.
Kør prøven gennem prøven gennem Flow-cytometrien for dataindsamling ved at få en enkelt perlepopulation pr. fremadspred og sidespr.aflæsninger. Indstil strømningshastigheden omkring 200 til 300 hændelser pr. sekund. Angiv den passende kompensation for et givet fluorescein-FITC-bøjningsantistoffer ved hjælp af et FL1 versus FL1-dotplot.
Placer en kvadrant gate, så de negative perler er inden for nederste venstre kvadrant og de positive perler er inden for den øvre eller nederste højre kvadrant. Juster kompensationsværdierne, indtil medianinfluoresceinintensiteten for hver population er omtrent ens. Gentag disse trin for alle rør.
Fortsæt nu med at anskaffe faktiske pletprøver. Kør guiden Kompensation, og gem indstillingen med formatet:dato, eksperiment og dine initialer. Ortopisk implantation af pancreas ductal adenocarcinom resulterede i hurtig tumorvækst svarende til den, der ses i subkutan implantation.
Repræsentative hæmatoxylin og eosin farvning billeder er vist og demonstrere lignende vækst af subkutane og ortopiske implantater. Rimeligt høje levedygtige celler udbytter blev indhentet fra tumor prøve af begge typer af implantation. Den repræsentative FACS splat viser levedygtige celler fra tumor adskilt fra de døde celler og cellerester.
Vist her, er en tumor infiltrerer en immunprofil sammenligning af de store og tæller cellepopulation af flere vigtige delmængder af tumor immunceller. Subkutan versus ortopisk homograft af kræft i bugspytkirtlen er vist. Dataene viser klart, at tumoren har øget immuncelleinfiltrationen betydeligt sammenlignet med bugspytkirtlen af raske mus.
Desuden blev der fundet forskellige procenter af tumor infiltrerende immuncelledelmængder i ortopiske versus subkutane homografter. For eksempel er der betydeligt flere B-celler i ortopisk end i subkutan. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske at forberede alle tilknyttede materialer og reagenser på forhånd.
Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du udfører FACS analyse for murine modeller.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
