Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri
Chapters
Summary October 9th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Det experimentella förfarandet på immunophenotyping av murina ortotop PDAC homografts syftar till profilering av tumör immuno-mikromiljö. Tumörer är orthotopically implanteras via kirurgi. Tumörer i 200 – 600 mm3 i storlek var skördas och skiljas för att förbereda encelliga suspensioner, följt av flera immun markör FACS analys med hjälp av olika fluorescently-märkt antikroppar.
Transcript
Detta meddelande kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i Immunophenotyping i Murine modeller, till exempel markörer som används för att identifiera olika immunitet härstamningar och åldrande strategier. Den stora fördelaktiga av denna teknik är att markören och åldrande stategies, när immunophenotyping, kan gälla en mängd olika murine modeller. Övervaka kroppsvikten hos C57 Black 6-möss med hjälp av en balans.
Också, övervaka tumörvolymen av tumör varierande givare möss av kaliber mätning. Efter dödshjälp av djuret i en biohazard huva enligt protokollet, sterilisera huden runt tumören med hjälp av Iodophor svabbprover. Efter kirurgiska ta bort tumören som beskrivs i textprotokollet, placera tumören i en petriskål som innehåller 20 milliliter PBS som har pre-kyld till 4 grader Celsius.
Om det finns förorenande blod, överföra tumören till en annan Petri-skålen och tvätta tumören med PBS. Skär av tumören på mitten. Ta bort eventuella extra hud, kärl, förkalkning, och nekros.
Välj bara intakta bitar av tumör och placera dem i en steril 50 milliliter centrifugrör. Tillsätt 20 milliliter PBS innan du transporterar rör till ett separat djurrum för farmakologiska studier. För att förbereda för orthotopic implantation, fixera en helt bedövande mus på ett experiment ombord i rätt lateral position.
Desinficera huden runt mjälten med jod och sedan de-iodinate med 75%etylalkohol. Hitta medianpunkten för mjälten och gör ett 1 centimeter vertikalt snitt på buken för att exponera mjälten. Försiktigt, dra ut en del av bukspottkörteln vävnad under mjälten med hjälp av platt spets pincett.
Och sutro mus homograft tumör bit från C-musen på bukspottkörteln av mottagaren musen av 9-O bsorbable kirurgiska sutur. Stäng buken med en 6-O siden sutur med dubbelsöm. Uppnå homeostas genom komprimering.
Efter avslutad tumörimplantation, hålla djuret i en varm bur så länge ingen blödning eller tumörvävnad läckage uppstår. Övervaka djuret tills de återfår tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Returnera djuret till djurrummet efter full återhämtning från anestesi.
Övervaka tumören varierande möss genom palpering buken nära mjälte och välj ut möss med ortopiska tumörer. För varje tumör, förbereda ett C-rör med tumör matsmältningsbuffert. Använd 3 milliliter av matsmältningsbuffert för tumörfragment mindre än 0,8 gram för att säkerställa att tumören är helt smält.
Märk tumören med studiekoden, tumören, mus-ID, behandlingsgrupp och tumörvikt. Samla in tumören från musen. Tvätta tumören i kalla PBS och rensa ut vävnaden fäst på tumören.
Placera tumör i digestion media i en brunn av en steril 6-väl platta. Håll tumören på plats med steril pincett eller pincett och skiva med en skalpell. Skiva tumören tillräckligt bra för att bryta sig in i mindre bitar.
Nu, placera tumörbitarna tillbaka i C-röret och använd den återstående matsmältningsbufferten för att tvätta plattan. Överför vätskan i C-röret och placera den på is tills matsmältningen. Slå sedan på dissociator med värmare.
Placera tumör dissociation C-röret upp och ner i hylsan på den lediga positionen. Justera status för rörposition från Ledig till Vald. Välj ett dissociationsprogram följer av valet av den mapp som krävs där listan över program visas.
Efter avslutad program, ta C-rör av dissociator och snurra kort för att palla provet. Nu, åter upphäva proverna och lägg dem i en cell sil ovanför en 50 milliliter rör. Tvätta cellen genom cellsilen med 10 milliliter tvättbuffert för att ge en enda cellfjädring.
Efter centrifugeringsröret vid 300 G i 5 minuter, kassera supernatanten och dra upp cellerna på ett återuppseänd med 5 milliliter tvättbuffert. Räkna livskraftiga celler och justera cellkoncentrationen till 1 miljon cell per rör eller per prov. Utför immunpaneldesign, immunfärgning och fluorescens minus en kontroll som detalj i textprotokollet.
Förbered UltraComp pärlor medan flödet instrumenten värms upp genom att virveling dem noggrant före användning. Märk ett separat provrör på 12 x 75 millimeter för varje fluorokromer konjugerade antikroppar. Tillsätt 100 mikroliter färgningsbuffert till varje rör följt av en hel droppe av pärlorna.
Lägg till antikroppar och utför infärgningsproceduren enligt beskrivningen i textprotokollet. Tillsätt sedan 0,5 milliliter färgningsbuffert till varje pärla pellet och helt åter upphäva via virvel. Nu, set Flow cytometry PMT spänning per mål vävnad för det givna experimentet.
Kör provet genom prov genom Flow cytometry för datainsamling genom att få på singlet pärla befolkningen per framåt scatter och sida avläsningar scatter. Ställ in flödet runt 200 till 300 händelser per sekund. Ange lämplig kompensation för en given fluorescein FITC konjugation antikroppar med hjälp av en FL1 kontra FL1 dot plot.
Placera en kvadrant grind så att de negativa pärlorna är inom den nedre vänstra kvadranten och de positiva pärlorna är inom övre eller nedre högra kvadranten. Justera kompensationsvärdena tills medianen för fluorescensentiteten för varje population är ungefär lika. Upprepa dessa steg för alla rör.
Nu, fortsätt att förvärva faktiska fläckprover. Kör kompensationsguiden och spara inställningen med formatet:datum, experiment och dina initialer. Orthotopic implantation av bukspottskörteln duktal adenocarcinom resulterade i snabb tumör tillväxt liknande den som ses i subkutan implantation.
Representativa hematoxylin och eosin färgning bilder visas och visa liknande tillväxt av subkutana och orthotopic implantat. Rimligt hög livskraftiga celler avkastning erhölls från tumören provet av båda typer av implantation. Den representativa FACS splat visar livskraftiga celler från tumör separeras från de döda cellerna och cell skräp.
Visas här, är en tumör infiltrera en immunprofil jämförelse av de stora och täljare cellpopulationen av flera viktiga delmängder av tumör immunceller. Subkutan kontra ortopic homograft av cancer i bukspottskörteln visas. Uppgifterna visar tydligt att tumören har avsevärt öka immuncell infiltration som jämför med bukspottkörteln av friska möss.
Dessutom hittades olika procentsatser av tumör infiltrera immun cell delmängder i orthotopic kontra subkutan homografts. Till exempel, Det finns betydligt fler B-celler i orthotopic än i subkutan. Samtidigt som man försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att förbereda alla tillhörande material och reagenser i förväg.
Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man utför FACS analys för murine modeller.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
