Neuroscience
You have full access to this content through Seoul National University of Education
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Microhemorrhages מוחי תת חריפה הנגרמת על ידי הזרקת ליפופוליסכריד בחולדות
Summary October 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
אנו מציגים פרוטוקול זירוז ולגלות CMHs הנגרמת על ידי הזרקת LPS בחולדות ספראג-Dawley, אשר עשוי להיות מנוצל בעתיד חקירות מחקר בפתוגנזה של CMHs.
Transcript
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-דימום המוחי כגון אטיולוגיה, הפצה וזיהוי של מיקרו-דימום מוחי וכן הלאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי זריקות LPS לגרום דלקת. בנוסף, הזרקת LPS היא די פשוטה, חסכונית וחסכונית.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה אינדוקציה דימום מוחי, זה יכול להיות מיושם גם על הפרעות מוחיות אחרות כגון דיכאון, סכיזופרניה, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ומחלת פריון. ניהול LPS במינון של מיליגרם אחד לקילוגרם של משקל גוף לחולדות ספראג דאוולי זכר בן 10 שבועות על ידי הזרקה תוך-לידתית, ואז להחזיר כל חולדה לכלוב הבית. חזור על הזרקת LPS לאחר שש שעות ו 16 שעות.
שים לב כי הזרקת חולדות SD עם LPS במינון של מיליגרם אחד לקילוגרם עלולה לגרום לתמותה של 5%. התמותה יכולה לעלות עוד יותר אצל חולדות צעירות או מבוגרות יותר או חולדות בהריון. להחזיר את החולדות לכלובים שלהם לאחר הזרקת LPS, ולספק גישה ליביטום מודעה למזון ושתייה.
תחת הרדמה סופנית, לבצע ניקור לב עמוק חמישה עד שמונה מ"מ על כל חולדה. נקודת הדקירה צריכה להיות חמישה מילימטרים בשוליים השמאליים של עצם החזה בחלל הבין-צלעי השלישי והרביעי. החזק את המחט במקום ולהחליף את הצינור הריק עם צינור המכיל אוונס כחול.
חכה עד התאוששות הדם נצפתה, ולאחר מכן להזריק אוונס כחול במינון של 0.2 מיליליטר לכל 100 גרם של משקל גוף לתוך החדר הלב השמאלי. שמור את החולדה במצב עלוב במשך 10 דקות אם הערכת דליפת אוונס כחול דרך מחסום הדם / מוח על ידי הדמיה immunofluorescence. בצע חליטות לב באמצעות קר כקרח 200 עד 300 מיליליטר של 0.9% תמיסת מלח כדי לנקות את כלי הדם המוחיים ואת המוח.
עבור אל קר כקרח 4% paraformaldehyde עבור קיבעון. לאחר מכן, לאחר בידוד המוח, לטבול אותו 20% סוכרוז ב PBS לפחות שש שעות או עד המוח שוקע לתחתית הצינור. שנה את הפתרון ל- 30%sucrose ותקן אותו למשך שש שעות נוספות.
לבסוף, להכין 10 מילימטר עבה רקמת המוח חלקים באמצעות קריוסטט. לשטוף את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה שקופיות עם 4, 6'diamidino-2-פנילינדולה או DAPI פתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS כבעבר, תן את השקופיות עם פתרון PBS-גליצרול.
לכידת תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תצהיר EB מסומן על ידי פלואורסצנטיות אדומה, גרעינים מסומנים על ידי פלואורסצנטיות כחולה. התחל מכתים H&E על ידי שטיפת המגלשות במים מזוקקים.
ואז לטבול תווי hematoxylin במשך שמונה דקות. לחלופין, עבור כתמים כחולים Perl Prussian, כתם בת פתרון תגובה עם תערובת חלקים שווים של פרוציאניד וחומצה הידרוכלורית במשך 10 דקות. לאחר הכתמים, יש לשטוף במי ברז זורמים במשך חמש דקות.
להבדיל 1% חומצה אלכוהול במשך 30 שניות. לאחר שטיפה במי ברז זורמים למשך דקה אחת, יש להכתים במי אמוניה 0.2% או בתווית ליתיום קרבונט רוויה למשך 30 שניות עד דקה. לאחר מכן, יש לשטוף במי ברז זורמים למשך חמש דקות.
כתם נגדי עם תוסף אאוסין למשך 30 שניות עד דקה אחת. התייבשות באמצעות 90% אלכוהול, לאחר מכן 95% אלכוהול, ואלכוהול מוחלט במשך 0.5 עד שתי דקות כל אחד. לאחר התייבשות, יש לנקות את הקסילן למשך 30 שניות.
לאחר ההרכבה, לנתח את כתמי H&E באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיר שדה. תאי הדם האדומים המשתחררים מכלי הדם, שהם רכיבים של CMHs, מופיעים באדום-כתום תחת כתמי H&E. CMHs פני השטח ניתן לזהות על ידי תצפית ברוטו כפי שצוין על ידי החצים האדומים.
הכתם הכחול של אוונס חושף פלואורסצנטיות אדומה גלויה שבה מולקולות כחולות של אוונס דלפו ממחסום דם-מוח פצוע. כתמי H&E מראים תאי דם אדומים שנמצאו מחוץ לנימים, וכתמים פרוסיים חושפים נקודות יונים ברזליות שמקורן תיזה של תאי דם אדומים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי המינון של LPS כדי לגרום לדימום מיקרו מוחי גדול יותר מזה המשמש מחלת פרקינסון או מודל סכיזופרניה.
לכן, הסביבה של בעלי חיים צריכה להישמר נקייה כדי להפחית את שיעור התמותה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים, דימות תהודה מגנטית והדמיה immunofluorescent כדי לקבוע את הנזק למבנה החיצוני של מחסום הדם - מוח בדימום מיקרו מוחי, הפצה של מיקרו דימומים מוחיים בפרנצ'ימה במוח ב vivo, כמו גם הפעלת תאי גליה.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE