Neuroscience
You have full access to this content through Seoul National University of Education
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Sub-akut Cerebral Microhemorrhages induceret af LPS injektion i rotter
Summary October 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer en protokol for at fremkalde og registrere CMHs forårsaget af LP'ER injektion i Sprague-Dawley rotter, som kan udnyttes i fremtiden forskning undersøgelser om patogenesen af CMHs.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i cerebral mikro-blødning felt såsom ætiologi, distribution, og påvisning af cerebral mikro-blødning og så videre. Den største fordel ved denne teknik er, at LPS injektioner stabilt fremkalde betændelse. Desuden, LPS injektion er ganske enkel, økonomisk, og omkostningseffektiv.
Selv om denne metode kan give indsigt i cerebral blødning induktion, det kan også anvendes til andre hjernesygdomme såsom depression, skizofreni, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, og prion sygdom. Administrere LPS ved en dosis på en milligram pr kg kropsvægt til 10-ugergamle mandlige Sprague Dawley rotter ved intraperitoneal injektion, derefter returnere hver rotte til hjemmet bur. Gentag LPS-injektionen efter seks timer og 16 timer.
Bemærk, at indsprøjtning af SD-rotter med LPS med en dosis på 1 mg/kg kan resultere i en dødelighed på 5 %. Dødeligheden kan stige yderligere hos yngre eller ældre rotter eller drægtige hunrotter. Returner rotterne til deres bure efter LPS injektion, og give ad libitum adgang til mad og drikke.
Under terminal anæstesi, udføre en fem til otte-millimeter dyb hjertepunktur på hver rotte. Punkteringspunktet skal være fem millimeter til venstre margen af brystbenet på det tredje og fjerde interkostale rum. Hold nålen på plads og udskift det tomme rør med et rør, der indeholder Evans blå.
Vent, indtil blodopvinding er observeret, og derefter injicere Evans blå ved en dosis på 0,2 milliliter pr 100 gram kropsvægt i venstre hjertekammer. Hold rotten i en liggende position i 10 minutter, hvis vurderingen Evans blå lækage gennem blod / hjerne barrieren ved immunfluorescens imaging. Udfør hjerteperfusioner ved hjælp af iskold 200 til 300 milliliter 0,9% saltvandsopløsning for at rydde hjernevasketur og hjerner.
Skift til iskold 4% paraformaldehyd til fiksering. Derefter, efter isolering af hjernen, nedsænkes det i 20% saccharose i PBS i mindst seks timer, eller indtil hjernen synker til bunden af røret. Skift opløsningen til 30%saccharose og fastgør den i yderligere seks timer.
Endelig forberede 10-millimeter tyk hjernevæv sektioner ved hjælp af en kryostat. Vask objektglassene med PBS tre gange i fem minutter hver, og inkuber derefter objektglas med 4, 6'diamidino-2-phenylindole eller DAPI-opløsning i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter vask af objektglas i PBS som før monteres objektglassene med PBS-glycerol-opløsning.
Tag billeder på et fluorescensmikroskop. EB deposition er indikeret ved rød fluorescens, kerner er indikeret med blå fluorescens. Begynd H & E farvning ved at vaske dias i destilleret vand.
Derefter nedsænkes i hæmaxylin opløsning i otte minutter. Alternativt, for Perl preussisk blå farvning, plet i reaktionsopløsning med lige dele blanding af ferrocyanid og saltsyre i 10 minutter. Efter farvning vaskes i rindende vand fra hanen i fem minutter.
Differentiere i 1% syre alkohol i 30 sekunder. Efter vask i rindende vand fra hanen i et minut, plet i 0,2% ammoniak vand eller mættet lithiumcarbonat opløsning i 30 sekunder til et minut. Dernæst vaskes i rindende vand fra hanen i fem minutter.
Kontraplet med eosinopløsning i 30 sekunder til et minut. Dehydrere gennem 90% alkohol, derefter 95% alkohol, og absolut alkohol i 0,5 til to minutter hver. Efter dehydrering, klar i xylen i 30 sekunder.
Efter montering, analysere H & E farvning ved hjælp af en brightfield fluorescens mikroskop. De røde blodlegemer frigivet fra blodkarrene, som er komponenter i CMHs, vises i rød-orange under H & E farvning. Surface CMH'er kan detekteres ved grov observation som angivet af de røde pile.
Evans blå farvning afslører synlig rød fluorescens, hvor Evans blå molekyler lækket fra en skadet blod - hjerne barriere. H & E farvning viser røde blodlegemer fundet uden for kapillærer, og preussiske farvning afslører ferr ion punkter stammer fra lysis af røde blodlegemer. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske, at dosis af LPS at fremkalde cerebral mikro-blødning er større end den, der anvendes i Parkinsons sygdom eller skizofreni model.
Derfor bør dyrenes miljø holdes rent for at reducere dødeligheden. Efter denne procedure, andre metoder som elektron mikroskopi, magnetisk resonans imaging, og immunfluorescerende billeddannelse kunne udføres for at bestemme skaderne på den ydre struktur af blod - hjerne barrieren i cerebral mikro-blødning, fordeling af cerebral mikro-blødninger i hjernen parenkym i vivo, samt glia celle aktivering.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
