Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Forberedelse af Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein oprensning
Chapters
Summary November 19th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En protokol til forberedelse af poly (pentafluorophenyl acrylat) (poly(PFPA)) podet silica perler er præsenteret. Poly(PFPA) functionalized overflade er derefter immobiliseret med antistoffer og anvendt med succes til protein adskillelse gennem immunoprecipitation.
Transcript
Denne metode kan bruges til at forberede biomolekyle-aktiverede overflader, som har applikationer på områder som lægemiddellevering, biologisk måldetektering og bioadskillelse. Den største fordel ved denne teknik er, at de poly PFPA børster er meget reaktive med aminer, og immobilisering af antistoffer opnås ved inkubation i buffer opløsning i et par timer. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod proteinrensning gennem immunopurification, da det immobiliserede antistof med succes kan binde med målantigener.
Selv om denne metode er demonstrere for antistof mobilisering og protein rensning, det kan også anvendes til andre systemer, der kræver biomolekylær mobilisering. Til behandling af siliciumdioxid perler med APTES, først opnå siliciumdioxid partikler i form af en 5%vægt volumen vandig suspension. Kombiner 0,8 milliliter siliciumdioxid suspension med 40 milligram APTES, og otte milliliter methanol i en 20 milliliter scintillation hætteglas udstyret med en røre bar.
Lad reaktionen fortsætte ved stuetemperatur i fem timer under kraftig omrøring. Efter fem timer overføres opløsningen til et konisk rør. For at isolere APTES funktionaliserede silikonedioxid perler, centrifuge opløsningen ved 10, 000 G i fem minutter.
Fjern derefter supernatanten. Vask nu perlerne ved at omsende dem i tre milliliter frisk methanol. Ryst røret i hånden til blanding, men om nødvendigt forbedre spredningen ved sonikering i et vandbad i et par sekunder.
Centrifuge som før, og gentag vasketrinnet en gang til. Kombiner methanol vask silikonedioxid perler med tre milliliter dimethylsulfoxid, eller DMSO. Ryst blandingen i hånden, eller om nødvendigt, sonikere i et par sekunder, indtil perlerne er fuldt spredt i DMSO.
Efter centrifugering på før, fjerne supernatant. Centrifugeringstrinnet gentages sidste gang for at sikre fuldstændig udveksling af opløsningsmidler fra methanol til DMSO. For at forberede den poly PFPA-opløsning opløses 20 mg poly PFPA i to milliliter DMSO i et 20 milliliter scintillationsglas.
For at forberede PEG-opløsningen opløses aminfunktionaliseret PEG i en milliliter DMSO. Overfør nu PEG-løsningen til den poly PFPA-løsning. Reagere ved stuetemperatur i en time ved kraftig omrøring.
En milliliter af APTES's funktionaliserede siliciumdioxidperler, der er suspenderet i DMSO, overføres til PEG-plastpoly PFPA-opløsningen. Lad podningen mellem poly PFPA og APTES funktionaliserede siliciumdioxidperler fortsætte ved stuetemperatur i en time under kraftig omrøring. Derefter isoleres perlerne ved centrifugering ved 10.000 G i fem minutter efterfulgt af fjernelse af supernatanten.
Vask perlerne ved at tilføje tre milliliter DMSO, og bland i hånden eller med et par sekunder sonication. Centrifuge perlerne som før. Og fjern supernatanten, før du gentager DMSO vasken to gange.
Vask perlerne to gange mere med tre milliliter tredobbelt destilleret vand. Derefter blandes i hånden eller med et par sekunders sonikering. Centrifuge perlerne som før og fjern supernatanten.
Endelig tørre perlerne ved 40 grader celsius i en vakuumovn natten over. Tilføj fem milligram poly PFPA podet siliciumdioxid perler til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Vask perlerne ved at tilføje 800 mikroliter af PBS, og bland godt ved vortexing.
Centrifuge perlerne ved 10,000 G ved stuetemperatur i et minut. Fjern supernatanten, og gentag vasketrinnet tre gange. Nu tilsættes 350 mikroliter frisk PBS, 50 mikroliter af 0,1%PBST, og 6,67 mikrogram af antistoffet.
Inkuber ca. 20 timer på en rotator ved fire grader celsius. Den næste dag, vaske perlerne og centrifuge ved 400 G og fire grader celsius i et minut. Fjern derefter supernatanten og tilsæt forsigtigt 400 mikroliter lysisbuffer.
Forsigtigt resuspenderede perlerne ved pipetting op og ned fem gange. Gentag dette vasketrin tre gange. Efter den endelige vask fjernes så meget af supernatanten som muligt.
Forbered celler og lysisbuffer som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter resuspend cell pellet med 400 mikroliter af lysis buffer. Sonikere cellerne ved hjælp af en ultrasonicator.
Efter sonikering, vortex kort. Derefter centrifuge lysatet ved 20, 000 G ved fire grader celsius i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliter centrifugerør.
For at udføre immunoprecipitation overføres 300 mikroliter cellelysat til tidligere tilberedte antistof immobiliserede poly PFPA podede siliciumdioxidperler. Opbevar 30 mikroliter af cellen lysatet som inputprøven i et nyt mikrocentrifugerør. Inkuber lysatperlerne blandingen i tre timer på en rotator ved fire grader celsius.
Efter inkubation centrifuger blandingen ved 400 G ved fire grader celsius i et minut. Fjern supernatanten, og tilsæt forsigtigt 400 mikroliter af vaskebuffer. Forsigtigt resuspenderede perlerne ved pipettering op og ned omkring fem gange.
Efter tre vaske, fjerne så meget af supernatant som muligt. Der tilsættes 30 mikroliter 2x SDS-lastefarve til perlerne og til inputprøven. Derefter opvarmes dem i 10 minutter ved 95 grader celsius.
Efter opvarmning analyseres prøven ved hjælp af vestlig blotting, eller prøven opbevares på minus 20 grader celsius. De funktionaliserede silicaperler undersøges ved røntgenfotoelektronspektroskopi eller XPS for at bestemme overfladesammensætningen. Repræsentative XPS-data vises her.
Efter BEHANDLING MED APTES registreres nitrogen 1s-toppen i forbindelse med amingruppezonen APTES. Efter poly PFPA-behandling detekteres fluortoppen 1s, der er forbundet med PFP-enhederne på polymeren. Protein kinase RNA aktiveret, eller PKR berigelse gennem immunoprecipation udføres, og den hentydede protein prøve analyseres ved hjælp af vestlige blotting.
Som forventet, perler immobiliseret uden antistof, eller en ikke-specifik antistof mixuture viser ingen PKR opsving. Perlerne inkuberet med anti-PKR kan med held berige PKR som angivet ved tilstedeværelsen af et PKR-bånd og fraværet af GAPDH-bånd. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at når man sammenligner systemer, IP eksperimenter samt den efterfølgende vestlige blotting analyse bør gøres samtidigt.
Efter dens udvikling, kan denne teknik bruges til immobilisering af forskellige biomolekylære eller materiale substrat. Desuden har denne metode den ekstra fordel ved tuning Kun overflade ejendom, der skal skræddersys til hver ansøgning behov.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
