Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית
Chapters
Summary August 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות התקן מיקום העכבר המאפשר את המיקום המתאים של עכברים עבור המינהל intranasal של המוח מיקוד פפטיד-siRNA המאפשר גנים יעילים השתקה במערכת העצבים המרכזית.
Transcript
פרוטוקול זה מפרט את השימוש בהתקן מיקום עבור המסירה האינטראנסאלית של ביומולקולס ל- CNS של העכבר. השימוש במכשיר זה מפחית באופן משמעותי את הטיפול בעכברים ואת זמן הטיפול וכתוצאה מכך יעילות משופרת ושחזור של הטכניקה. כדי להתחיל בהליך זה, להעריך את רמת ההרדמה של העכברים על ידי רפלקס הדוושה על מנת לשמור על המישור הכירורגי.
לאחר מכן, מקם את התקן המיקום במרחק ובגובה המתאימים כדי לאפשר גישה נוחה לכל חברי ההנהלה הנדרשים. לאחר מכן, להחיל משחה על העיניים של החיה. רצועת עכבר אחד עם חגורות כיסא, לוודא את ה forelimbs של העכבר לספק תמיכה טבעית בזמן שהוא במצב רגוע ללא כל אי נוחות.
חזור על ההליכים עבור העכברים הנותרים. מניחים בעדינות כל עכבר על הכיסא המיועד על ידי הנחת גבו במקביל לתמיכת הגב של הכיסא וב-90 מעלות למושב הכיסא. תן לחיה לשכב באופן טבעי בתצב למטה וקדם מבלי לדחוף או ללחוץ.
ברגע שכל העכברים קשורים, מיד להתחיל את החיסון האינטרנסלי. כדי לבצע משלוח תוך-שנתי, טען את המיקרופיט עם שני מיקרוליטרים של פתרון מורכב RVG9R siRNA. החזק את פיפטה ביד הדומיננטית ולתמוך בו ביד השנייה, כדי למנוע תנועות בלתי מבוקרות תוך ניהול siRNA.
מניחים על שתי טיפות microliter קרוב מאוד נחיר אחד, כך העכבר יכול ישירות לשאוף אותו. אם טיפה זעירה אינה נוצרת בקלות, החלף את קצה פיפטה בטיפ חדש וחזור על הפעולה. בעדינות לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהוא שואף ולשמור על המיקום.
כדי למנוע ניקוז של סמים לתוך הריאות חשוב לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהעכבר שואף. התחל שעון עצר כדי שעון שלוש עד ארבע דקות לאחר מכן כדי לזמן חיסון לתוך nare השני של העכבר הראשון. מרווח זמן זה נחוץ לעכבר כדי להשלים את שאיפת המנה הראשונה ולשחזר נשימה נורמלית.
במרווח של שלוש עד ארבע דקות בין חיסון של nares חלופי על העכבר הראשון, חיסון תוך-רנסאלי מלא של nare אחד בכל אחד משלושת העכברים הנותרים להציב על המכשיר. כאשר שעון העצר נשמע, לחסן את הנחיר השני על העכבר הראשון ולחזור על ההליך עבור העכברים האחרים כמו לעיל. חזור על ההליך עד 20 עד 30 microliters מועבר עבור כל ארבעת העכברים.
זה ייקח בערך 30 עד 45 דקות כדי להשלים את הליך החיסון כולו. החזירו את החיות לכלובים המיועדים להן. אין להשאיר את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על שליטה בעצם החזה.
כדי להעריך השתחת גנים, לחלץ RNA מאזורי מוח שונים עם ערכת טיהור RNA, להפוך שעתוק לתוך cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA, ולבצע qPCR עם זוגות פריימר. רוב אספקת המוח של פפטיד RVG9R שכותרתו עם אלקסה פלואור 488 נבדק לראשונה באמצעות מכשיר מיקום העכבר המתואר כאן. ב 48 שעות לאחר חיסון, איברים שונים הוצאו כדי למדוד פלואורסצנטיות A488.
שום דבר לא זוהה באף אחד מהאיברים בפקדים השליליים. מצד שני, אות A488 פלואורסצנטי חזק זוהה אך ורק במוחה של הקבוצה מחוסן RVG9R. בנוסף, מיקום מיקום העכבר הושווה לשיטת מיקום supine ואת השיטה ערה ליעילות.
התוצאות הצביעו על כך שמיקום העכברים כלפי מטה וקדמתו שיפר את החדירה והתצהיר של RVG9R A488 בכל רקמת המוח. כדי לאשר עוד יותר את משלוח siRNA למוח, סריקת מוח מלאה בוצעה לאחר ניהול תוך-רנסאלי יחיד של RVG9R מורכב Cy5 שכותרתו siRNA. בניגוד PBS או RVM9R, קומפלקס עם RVG9R הביא הצטברות חזקה של siRNA באזורי המוח העיקריים כולל נורת הריח, קליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, המוח ה באמצע, ואת המוח הקטן.
התקן המיקום יכול לשמש לאספקת תרופות או מולקולות ל- CNS העכבר. היישומים להרחיב את הבדיקה של תרפיה, כמו גם בחינת מנגנונים סלולריים ב- CNS. מכשיר מיקום זה שימש את החוקרים להדגמת העוצמה של siRNAs בטיפול במחלת וירוס הנילוס המערבי, כמו גם לחקור טיפולים למחלות אחרות של המערכת העצבים המרכזיים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
