Demonstrere en lineær sammenhæng mellem vaskulær endotelial vækstfaktor og luteiniserende hormon i nyre cortex ekstrakter

Vores protokol bemærker, at brugen af nyreekstrakter fra køer og svin er en fremragende og økonomisk ressource til undersøgelse af nyrefysiologi, især ved at undersøge sammenhængen mellem vaskulær endotelvækstfaktor og andre analysander. Det har altid været en udfordring at korrelere VEGF, en væsentlig vækstfaktor i orgel angiogenese, med andre proteiner. Denne teknik giver os mulighed for at undersøge forbindelsen mellem VEGF og analytter såsom hormoner.

Dette vil helt sikkert fremme vores vidensgrundlag om denne vigtige vækstfaktor. Denne metode kan være nyttig til korrelering andre analysander i nyre kortikale ekstrakter ud over dem, der er nævnt i denne video. Visuel demonstration vil hjælpe andre med at opnå reproducerbare resultater uden stikprøvefejl.

Brugen af frisk væv er afgørende for succes af denne teknik. Det er vigtigt at få friske hele nyrer umiddelbart efter slagtning fra et dyr. Overfør altid vævet til laboratoriet på is.

Brug sterile saks, scer, en kniv, og petriskåle til at dissekere nyrer og punktafgifter den nødvendige vævsdel. Skær forsigtigt nyrerne i halve langs sagittal flyet og skær et stykke væv fra cortex regionen i midten af nyrerne. Hakke vævet i små stykker med kniven og overføre det til en mikrofuge rør med en milliliter iskold 1X RIPA lysis ekstraktion buffer.

Mærke røret med specifikke prøvedetaljer og læg det på is. Brug en håndholdt homogenisator med en steril sonde til at homogenisere vævet i et til to minutter, indtil ingen stykker er synlige, derefter straks centrifuge røret ved 9, 600 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering forberedes separate aliquots af prøven til ELISA og total proteinanalyse for at undgå flere fryse-/optøningscyklusser.

Før analysen påbegyndes, skal alle reagenser og analysepladen bringes til stuetemperatur og fjernes de overskydende brønde og opbevares ved fire grader Celsius indtil videre brug. 20X vaskebufferen fortyndes til 300 milliliter med dobbelt destilleret vand, og blindboerne opsæts uden opløsning. Tilsæt 50 mikroliter af standard eller prøve og yderligere 50 mikroliter peberrod peroxidase konjugat til hver brønd, derefter straks tilføje 50 mikroliter af antistofopløsning til hver brønd og forsegle pladen.

Bland pladen og inkuber den ved 37 grader Celsius i en time. Efter inkubationen vaskes hver brønd med 200 mikroliter vaskepude. Tilsæt 50 mikroliter af substrat A og substrat B til hver brønd, bland pladen forsigtigt ved at trykke på siden, derefter forsegle og inkubere det i mørke i 15 minutter ved 37 grader Celsius.

Tilføj 50 mikroliter stopopløsning til hver brønd. Bank forsigtigt på pladen, og aflæs absorbansen ved 450 nanometer med spektrofotometer. Forbered reagenser og vask buffer som tidligere beskrevet, derefter tilføje 100 mikroliter af standard eller prøve til hver brønd, forsegle pladen, bland godt, og inkubere det i to timer ved 37 grader Celsius.

Fjern væsken i hver brønd og tilsæt 100 mikroliter af detektion reagens A.Seal pladen og inkuber den i en anden time. Dernæst vaskes hver brønd med 400 mikroliter vaskebuffer, og tilsæt derefter 90 mikroliter af substratopløsning til hver brønd, bank forsigtigt på pladen og inkuber den i en time ved 37 grader Celsius. Efter den sidste inkubation tilsættes 50 mikroliter stopopløsning til hver brønd, bank forsigtigt på pladen, og aflæs absorbansen ved 450 nanometer med et spektrofotometer.

Det samlede protein i kvæg- og svinenyrekstrakterne anslås med en standard BSA-analyse, og dette skøn anvendes til at normalisere LH- og VEGF-A-ELISA-resultaterne. Gennemsnits- og medianniveauerne for LH og VEGF blev beregnet for både dyr og køn. Efter at have kontrolleret datas normalitet blev lineære regressionsmodeller udnyttet til at undersøge forholdet mellem LH og VEGF.

LH viste sig at være en stærk og signifikant indikator for VEGF i både kvæg- og svinenyrerne. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at prøve identiske områder i hvert væv. En lignende procedure kan bruges til at udtrække enhver form for væv.

Husk at normalisere analysander ved total protein ekstrakt uanset væv, du bruger.