Login processing...

JoVE Journal
Developmental Biology
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Developmental Biology

Оптимизация почечной органоидной и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопии

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Journal (Developmental Biology)

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Journal (Developmental Biology)

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Click here for the English version

Оптимизация почечной органоидной и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопии

Article DOI: 10.3791/60995-v

March 28th, 2020 •

Susanna Kaisto¹, Ulla Saarela¹, Laura Dönges¹, Irina Raykhel¹, Ilya Skovorodkin*¹, Seppo J. Vainio*^1,2,3

¹Biocenter Oulu and Faculty of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Oulu, ²InfoTech Oulu, University of Oulu, ³Biobank Borealis of Northern Finland, Oulu University Hospital

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 28th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Эта работа описывает два метода для изучения развития органов, улучшенная установка ксенотрансплантации на хориоаллантоической мембране (CAM) из птичьих эмбрионов, что позволяет васкуляризировать культивированные эмбриональные органы и органоиды и новый фиксированный z-направление метод культуры органов с измененными экспериментальными условиями, который позволяет с высоким разрешением замедленной конфокальной визуализации.

Transcript

Культура органов почек и органеллы, полученные из запрограммированных стволовых клеток, обеспечивают отличные способы изучения механизмов развития почек и болезней. Однако нынешняя система культуры органов не обеспечивает приток крови к почкам. Из-за этого, причина нынешних моделей являются неполными и не в состоянии повторить основную функцию почек, которая является фильтрация крови.

В этой публикации мы представляем улучшенный протокол для выращивания и визуализации эмбриональных почек и органоидов на хориоаллантической мембране куриного эмбриона. В нашем романе экспериментальной создана, мы наложения зачатков почек пересажены на CAM с проницаемым смыслом резервуаров, которые заполнены культуры среды. Этот протокол значительно повышает выживаемость зачатков почек, а также внутренних эндотелиальных клеток.

Метод позволяет приток крови к развивающемуся гломерулу. Недавно мы опубликовали также новый фиксированный набор направления орган культуры метод, который предлагает высокое разрешение конфокальных 3D замедленной визуализации. Метод обеспечил оптимальные условия для долгосрочной конфокальные изображения органоидов и зачатков органов.

В подходе мы аккуратно сжимаем ткань между проскальзывания стеклянной крышки и проницаемой мембраной. Здесь мы покажем, как изготовлены специально разработанные пластины и как настраиваются культурные эксперименты. Таким образом, в этой публикации мы представляем улучшенную технику почечной органеллы труб культуры.

Этот метод предлагает лучший способ моделирования генезиса органеллы и проведения изображений высокого разрешения для изучения эмбриональных почек и почечных органоидов ex vivo. В зависимости от эксперимента возьмите переносные ячейки контра-вставки, предназначенные для шести-хорошо или 12-хорошо пластин. Вырежьте стороны вставки с помощью инструмента Dremel, чтобы создать двухмиллиметровое пластиковое кольцо с проницаемой мембраной, прикрепленной к нему.

Польский края кольца от swarf со скальпелем или острым ножом. Стерилизовать мини-резервуары в 70% этанола, по крайней мере один час. Затем вымойте мини-резервуары в автоклаве дистиллированной водой и высушите их в ламинарный капюшон.

Промыть мини-резервуары в PBS и культуры среды. Поместите резервуар на чашку Петри на вершине нашей капли культуры среды с мембраной лицом вверх. Упорядочить вскрытые ex vivo эмбриональных почек или почечных органоидов на мембране.

Избегайте оставлять много жидкости вокруг образцов и оставить их прилагается от двух до 24 часов в инкубаторе культуры клеток. Экзенальная трансплантация проводится на хориоалантной мембране восьмидневного бывшего эмбрионального цыпленка ово. Перенесите мини-резервуары так, чтобы мембрана покрывала трансплантат.

Поместите их на периферию CAM, чтобы они не покрывали эмбрион. Затем добавьте культурную среду в мини-резервуары. Культивировать образцы на куриный CAM в течение девяти дней, как максимум.

Заменить культурную среду в мини-резервуарах ежедневно. Васкуляризацию образцов можно наблюдать уже через 24-48 часов после трансплантации. Чтобы сделать специально разработанные шесть хорошо пластин для фиксированной культуры.

Вы должны начать с бурения 20 миллиметров отверстий в нижней части пластины с помощью буровой машины с подходящим битом сверла. Затем отполировать диски отверстий на верхней стороне пластины. Наконец, стерилизовать пластины в 70% этанола, по крайней мере один час.

Затем вымойте пластины в автоклаве дистиллированной водой и высушите их в мизерной капюшоне. Вымойте 22x22 миллиметровый покров скользит в 70%этанола и дайте им высохнуть полностью. Клей крышку скольжения на верхней части отверстия в нижней части скважины с помощью ткани клея.

После высыхания осмотрите пластины под стерильным микроскопом и удалите лишний клей. Во-первых, смешать алицит из полистирола бусы с равным объемом водорода. Поместите трансполильную вставку под рассекающий микроскоп с мембраной вверх и расположить почки на мембране.

Добавить каплю смеси гидро-гель шарик рядом с почками тщательно. Переверните трансфилловую вставку так, чтобы мембрана и почки были обращены вниз. Затем аккуратно поместите вставку в наш колодец специально разработанной пластины из шести хорошо.

Нажмите вставку очень осторожно в колодец. Следуйте степени уплощения из микроскопа, пока почка находится на уровне с бисером. Держите вставку слегка прижатой к хорошо с одной стороны и исправить его на тарелку путем плавления пластика в трех точках на периферии вставки с припоем железа.

Добавить два миллилитров культуры среды в колодец через отверстие на стороне. При запуске изображений замедленного действия перенесите пластину в инкубатор перевернутого микроскопа на сцене. Наш модифицированный протокол захвата CAM позволяет высокоэффективную васкуляризацию почечных органоидов и эмбриональных почек.

Многие резервуары, содержащие культурную среду, снабжают донорскую ткань и защищают ее от высыхания в течение первоначального периода времени, исходящего из васкуляризатона. Этот фильм показывает поток клеток куриной крови в эмбриональном центре почек мыши привиты куриный CAM и культурные в течение семи дней. Эта панель рисунков показывает, что наш улучшенный метод культуры CAM обеспечивает разрешительные условия для почечных эндотелиальных клеток.

Цифры А и В показывают эмбриональные почки, выращенные в течение пяти дней в интервале дней культуры были центр привиты куриный CAM в течение пяти дней. Окрашивание с помощью мыши специфики CD-31 антитела показывает, что эндотелиальной клеточной сети почечного центра привиты CAM является более обширным, чем в левой стороне управления. На рисунке C мы видим, что кровеносные сосуды мыши окрашены мышью конкретных CD-31 антитела, и это больше всего с куриными кровеносными сосудами.

Цифры D и E показывают криозиции эмбриональных почек мыши, выращенных на культуре путешествий или куриного CAM в течение пяти дней и окрашенных CD-31 и Hoechst. Glomeruli сосуды более зрелые в почках, культурных на куриный CAM, чем в культурах контроля. На рисунке F показана эмбриональная почка мыши, выученная на CAM трансгенного цыпленка GFP в течение семи дней.

Эндотелиальные клетки мыши окрашены антителами CD-31, и мы можем наблюдать, что сосуды в ксенотрансплантированных почках мыши в основном, но не исключительно мыши полученных. Новая культура фиксированного направления набора позволяет культивирование эмбриональных почек и органоидов на ограниченном расстоянии. В традиционной культуре путешествий культурные органы помещаются на фильтр, который хранится в воздушном интерфейсе металлической сетки.

Этот метод обеспечивает хорошие условия для развития и роста, но не является оптимальным для визуализации. В фиксированном наборе культуры направления, культурный орган нажат между стеклянным дном блюда и мембраны и толщина его контролируется полистирол шарики, работающие в качестве раскаленников здесь. Развивающиеся органы могут быть изображены прямо через стекло крышки, давая улучшенный вид органа.

Эта панель рисунков показывает, что эмбриональные почки и органоиды почек могут быть выучтированы в методе фиксированной культуры направления. Яркие полевые изображения эмбриональных почек и органоидов почек на седьмой день показывают нормальное развитие. На рисунке C экспрессия GFB была активирована в развивающихся нефронах органоида почек на рисунке D показывает почку с травмой одного окрашивания на euretric бутон и шесть двух окрашивания маркировки нефроновых клеток-предшественников.

Цифры E и F представляют мышеловку, культурную в течение 12 дней. Травма один и nephron окрашивания показывают eurethric бутон и подоциты. Фильм тоже представляет эмбриональной почки MTMG, Тайвань кри происхождения, где Тайвань кри вызывает экспрессию GFB в эндотелиальных клеток.

Мы видим, что почечные эндотелиальные клетки присутствуют в развивающейся эмбриональной почки и эндотелиальной сети может также развиваться в методе культуры. В панели справа можно увидеть, как эндотелиальные клетки мигрируют в сосудистую расщелину S-образного стадии нефрона. Здесь мы представили улучшенный протокол ксенотрансплантации почечных органоидов и эмбриональных почек куриного КАМА.

Этот протокол значительно повышает выживаемость зачатков почек, а также их внутренних эндотелиальных клеток. Метод позволяет приток крови к развивающемуся гломерулу. Другой протокол, представленный здесь, является фиксированным методом культуры органов, который улучшает качество изображения и помогает изучать генезис органеллы на уровне одной клетки.

Изображения с высоким разрешением подходят для автоматической сегментации клеток и компьютерного исследования клеточного поведения в почечных органоидах и культурах почек.

X

Simple Hit Counter