Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Ons protocol maakt gebruik van regelmatige fluorofoorsondes en eenvoudige monstervoorbereidingstechnieken die de afgebeelde cel in fysiologische conditie houden om een zeer dynamisch cellulair proces en gedetailleerde subcellulaire structuren te bestuderen. Deze techniek stelt ons in staat om cellulaire processen te onderzoeken met een superresolutie en onder fysiologische omstandigheden voor een langere periode zonder de speciale of tijdelijke resolutie op te offeren. Begin met het snijden van een 12 tot 14 kilodalton moleculair gewicht cutoff dialysemembraan in kleine stukjes en week de stukken met 100 microliters levend celmedium gedurende ongeveer vijf minuten.

Terwijl de membranen weken, snijdt u de buitenste ring van een buis van 50 milliliter in kleine stukjes en steriliseert u de stukken in 70% ethanol. Voor dissectie en montage van teelballen, breng tien twee tot drie dagen oude verdoofde mannelijke vliegen over in een dissectieschaal onder een ontledingsmicroscoop en gebruik fijne tang om de teelballen te verwijderen. Wanneer alle teelballen zijn verzameld, wast u de teelballen twee keer in levend celmedium en gebruikt u een pipettip om 100 tot 150 microliter levend celmedium naar de voorbereide glazen bodemschaal te verspreiden.

Gebruik fijne tangen om de vliegtesten naar het midden van de schaal over te brengen en verwijder alle behalve ongeveer 10 microliters van het medium. Plaats snel het voorge natte membraan op de teelballen en plaats twee tot drie kleine plastic gewichten op het membraan. Voeg onmiddellijk 100 tot 150 microliter vers levend celmedium toe en plaats de ring terug op de verhoogde kant van de schaal.

Plaats de afdekstrip terug op de ring en wervel een stuk tissuepapier in water voordat u het papier op de afdekstrook plaatst. Bedek vervolgens de schaal met een deksel en zet de schotel vast op het podium van een superresolutiemicroscoop. Voor kiembaanstamcelbeeldvorming opent u de beeldvormingssoftware en schakelt u het verzonden licht in.

Gebruik de 63X-doelstelling om je te concentreren op het testesweefsel en de lasers in te schakelen. Klik op Live”om kiemstamcellen te vinden. Pas de scherpstelling aan en klik op Framegrootte”om de framegrootte in te stellen op tussen 512 bij 512 en 1024 bij 1024 pixels, en op Gemiddeld”om het framegemiddelde in te stellen op een of twee.

Klik op Master Gain”om de elektronenvermenigvuldigingswinst in te stellen op minder dan 800, en Lasers”om de laserkracht in te stellen op 1%tot 2%Zoom in op de regio of cel van belang om de beeldverwervingstijd te verkorten en het bleken van foto’s te verminderen en te bevestigen dat de afbeelding optimaal is geconfigureerd voordat u op Experiment starten klikt”om de timelapse-beeldopname te starten. Als Airyscan Acquisition niet optimaal is geconfigureerd”wordt weergegeven, klikt u op Optimaal”in de secties framegrootte, Z-Stack en Scangebied” en optimaliseert u het tijdsinterval, het aantal Z-segmenten en de duur van de timelapse-beeldvorming, afhankelijk van het experimentele ontwerp en type specimen. Selecteer na beeldvorming Processing, Batch” en Airyscan Processing en selecteer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt.

Klik vervolgens op Proces uitvoeren”om de afbeeldingen met superresolutie te verkrijgen. Live cell imaging van drosophila-teelballen die alfa tubuline GFP uitdrukken in kiemcellen in een vroeg stadium met behulp van een draaiende schijfconocale microscoop, maakt visualisatie van de asymmetrische intensiteit van GFP-signalen bij twee centrosomen mogelijk, als een helderder signaal bij het moeder-centrosoom en een relatief zwakker signaal bij de dochter-centrosomen. Het verschil in helderheid wordt waarschijnlijk weerspiegeld door de temporele asymmetrie van de microtubulinucleatie, maar de gedetailleerde morfologie en hoeveelheid van de microtubuli kunnen niet worden opgelost met behulp van spinneschijf confocale microscopie.

Live cell super resolution imaging daarentegen maakt de visualisatie en kwantificering van microtubulimorfologie en getallen mogelijk. Deze verbeterde resolutie onthult ook patronen van asymmetrische microtubulinucleatie, rek en verhoogde interactie met het nucleaire membraan. Live cell imaging maakt ook de visualisatie van asymmetrische nucleaire membraan invaginatie mogelijk, maar niet van individuele microtubuli die direct de kern binnendringen.

Deze superresolutietechniek voor levende cellen maakt daarentegen de directe observatie van deze gebeurtenissen mogelijk door gelijktijdige beeldvorming van zowel microtubuli als de nucleaire lamina. Tijdens metafase kunnen beide zuster centromeren als één signaal worden gedetecteerd met behulp van draaiende schijfmicroscopie, hoewel de centrale bevestiging van de microtubuli niet kan worden waargenomen. Daarentegen maakt live beeldvorming met superresolutie visualisatie van de microtubuli centromeeraanhechting in vroege profase mogelijk.

Zorg ervoor dat u een membraan over de teelballen plaatst om ervoor te zorgen dat ze niet bewegen of zweven tijdens de beeldvorming en om de microscoopinstellingen te optimaliseren om het bleken van foto’s en fototoxiciteit te voorkomen. Er zijn veel manieren waarop deze methode kan worden toegepast, zoals het onderzoeken van eiwitdynamica, lineaire stress of cellulaire afweer en processen.