הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

הפרוטוקול שלנו משתמש בבדיקות פלואורופור רגילות וטכניקות הכנת דגימה פשוטות השומרות על התא המדומן במצב פיזיולוגי כדי לחקור תהליך תאי דינמי ביותר ומבנים תת-תאיים מפורטים. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור תהליכים תאיים ברזולוציית-על ובתנאים פיזיולוגיים לתקופה ממושכת מבלי להקריב את הרזולוציה המיוחדת או הזמנית. התחל על ידי חיתוך 12 עד 14 קילודלטון מולקולרי ניתוק קרום דיאליזה לחתיכות קטנות והשרות את החלקים עם 100 microliters של בינוני תא חי במשך כחמש דקות.

בזמן הקרומים ספוגים, חותכים את הטבעת החיצונית של צינור 50 מיליליטר לחתיכות קטנות ומעקרים את החלקים ב -70%אתנול. עבור ניתוח האשכים והרכבה, להעביר עשרה שניים עד שלושה ימים זכר מרדים זבובים לתוך צלחת ניתוח תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את האשכים. כאשר כל האשכים נאספו, לשטוף את האשכים פעמיים בינוני תא חי ולהשתמש טיפ פיפטה להתפשט 100 עד 150 microliters של תא חי בינוני לצלחת התחתונה זכוכית מוכן.

השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את האשכים הזבוב למרכז המנה ולהסיר את כל אבל כ 10 microliters של המדיום. במהירות, מניחים את הממברנה הרטובה מראש על האשכים ומניחים שניים עד שלושה משקולות פלסטיק קטנות על הממברנה. מיד, מוסיפים 100 עד 150 מיקרוליטרים של בינוני תא חי טרי ומניחים את הטבעת בחזרה על הצד המוגבה של המנה.

מניחים את החלקת הכיסוי בחזרה על הטבעת ומערבבים פיסת נייר טישו במים לפני הנחת הנייר על פתק הכיסוי. לאחר מכן, לכסות את המנה עם מכסה ולאבטח את המנה על הבמה של מיקרוסקופ רזולוציה סופר. להדמיית תאי גזע חיידקיים, פתחו את תוכנת ההדמיה והדליקו את האור המועבר.

השתמש במטרה 63X להתמקד ברקמת האשכים ולהדליק את הלייזרים. לחץ על Live”כדי לאתר תאי גזע נבטים. התאם את המוקד ולחץ על גודל מסגרת כדי להגדיר את גודל המסגרת בין 512 ל- 512 ל- 1024 על ידי פיקסלים 1024, ועל ממוצע “כדי להגדיר את ממוצע המסגרת לאחד או שניים.

לחץ על Master Gain כדי להגדיר את רווח הכפלת האלקטרונים לפחות מ- 800, ועל לייזרים”כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל- 1%עד 2% הגדלה לאזור או לתא העניין כדי לקצר את זמן רכישת התמונה ולהפחית את ההלבנה של התמונות, ולאשר כי התמונה הוגדרה בצורה אופטימלית לפני לחיצה על Start Experiment”כדי להתחיל את לכידת התמונה בזמן. אם רכישת Airyscan אינה מוגדרת באופן אופטימלי”מוצג, לחץ על אופטימלי “בגודל מסגרת, Z-Stack, ו אזור סריקה”, ולמטב את מרווח הזמן, מספר פרוסות Z ומשך הדמיית זמן לשגות, על פי העיצוב הניסיוני וסוג הדגימה. לאחר ההדמיה, בחר עיבוד, אצווה ועיבוד Airyscan ובחר את התמונות לעיבוד.

לאחר מכן לחץ על הפעל תהליך”כדי לקבל את תמונות רזולוציית העל. הדמיית תאים חיים של אשכים drosophila מבטא אלפא טובולין GFP בתאי נבט בשלב מוקדם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק ספינינג, מאפשר הדמיה של העוצמה האסימטרית של אותות GFP בשני centrosomes, כאות בהיר יותר במרכז האם אות חלש יחסית במרכז הבת. ההבדל בבהירות משתקף ככל הנראה על ידי הא-סימטריה הזמנית של התגרענות המיקרוטובולה, אך לא ניתן לפתור את המורפולוגיה המפורטת ואת כמות המיקרוטובולות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

לעומת זאת, הדמיית רזולוציית-על של תאים חיים מאפשרת הדמיה וכימות של מורפולוגיה ומספרים של מיקרוטובולות. רזולוציה משופרת זו חושפת גם דפוסים של התגרענות מיקרוטובולת אסימטרית, התארכות ואינטראקציה מוגברת עם הממברנה הגרעינית. הדמיית תאים חיים מאפשרת גם הדמיה של התפשטות קרום גרעיני אסימטרי, אך לא של מיקרוטובולות בודדות שנכנסות ישירות לגרעין.

לעומת זאת, טכניקת רזולוציית-על של תאים חיים זו מאפשרת התבוננות ישירה באירועים אלה על ידי הדמיה סימולטנית של שני המיקרוטובולים ושל המרינה הגרעינית. במהלך metaphase, שני centromeres אחות ניתן לזהות כאות אחד באמצעות מיקרוסקופיית דיסק ספינינג, אם כי הקובץ המצורף המרכזי microtubule לא ניתן לראות. לעומת זאת, הדמיה חיה ברזולוציית-על מאפשרת הדמיה חזותית של הקובץ המצורף של צנטרומר מיקרוטובול בפרופאזה מוקדמת.

הקפד למקם קרום מעל האשכים כדי להבטיח שהם לא לזוז או לצוף במהלך הדמיה כדי לייעל את הגדרות המיקרוסקופ כדי למנוע הלבנת תמונה ורעילות תמונה. ישנן דרכים רבות שבהן ניתן ליישם שיטה זו, כגון לחקור דינמיקת חלבונים, הדגשה ליניארית, או הגנות ותהליכים תאיים.