Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En DNA/Ki67-basert flowcytometrianalyse for cellesyklusanalyse av antigenspesifikke CD8 T-celler hos vaksinerte mus
Chapters
Summary January 5th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Clonal ekspansjon er et sentralt trekk ved antigenspesifikk T-cellerespons. Cellesyklusen til antigenresponserende T-celler har imidlertid blitt dårlig undersøkt, blant annet på grunn av tekniske begrensninger. Vi beskriver en strømningscytometrisk metode for å analysere clonally ekspanderende antigenspesifikke CD8 T-celler i milt og lymfeknuter av vaksinerte mus.
Transcript
Vår protokoll gir en praktisk tilnærming der mus milt og lymfeknuter kan brukes til å gjenspeile dynamikken i T cellerespons større enn å gi en steady-state fenotypisk øyeblikksbilde. Vår teknikk oppdager sensitivt antigenspesifikke CD8 T-celler som er engasjert i en pågående respons. Proliferating CD8 T celler måles uten de muligens forvirrende effektene av in vivo narkotika behandling eller celleoverføring.
Vår teknikk kan gi et vindu i immundynamikk i flere innstillinger. For eksempel, i forhold til respons på vaksinasjon og infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreftimmunoterapi. Forbered fersk 1x permeabiliseringsvaskbuffer ved å fortynne 10x permeabiliseringsbuffer med destillert vann og filtrer den gjennom et 0,45 mikrometer filter for å eliminere aggregater.
Fortynn monoklonalt antistoff Ki67 FITC i 1x permeabiliseringsvaskbuffer som bestemt med et titreringsforsøk for et sluttvolum på 100 mikroliter per prøve. Tilsett 3 milliliter av 1x permeabiliseringsvaskbufferen til hvert rør med celler og sentrifuger ved 400 G i fem minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
Igjen, tilsett 1x permeabilisering vaskebuffer og sentrifuge til pellet cellene. Kast deretter supernatanten. Tilsett 100 mikroliter fortynnet monoklonalt antistoff Ki67 FITC til pelletsen, deretter virvel og inkuber i 30 minutter i mørket.
Etter inkubasjonen, vask cellene to ganger med 4 milliliter 1x permeabiliseringsbuffer, sentrifuger etter hver vask, og kast supernatanten. Tilsett 350 mikroliter PBS i cellepelleten for prøver som skal anskaffes direkte ved strømningscytometeret og 250 mikroliter PBS til cellepelleten for prøver som skal inkuberes med Hoechst for DNA-farging. Forbered Hoechst og PBS-løsning og legg den til hver prøve slik at den endelige konsentrasjonen er to mikrogram per milliliter.
Virvel og inkuber prøvene i 15 minutter i mørket. Sentrifuger deretter prøvene i fem minutter og tilsett 350 mikroliter PBS til cellepelleten. Åpne programvaren og opprett forskjellige grupper som tilsvarer de forskjellige organene som skal analyseres ved å klikke Opprett gruppe i arbeidsområdebånddelen.
Åpne det endrede gruppevinduet ved å dobbeltklikke gruppenavnet og synkronisere de nyopprettede gruppene ved å sette en hake i funksjonen som synkroniseres. Dra hver FCS-fil til den tilsvarende gruppen, og opprett deretter en gating-strategi som starter med en LN-gruppe. Åpne diagramvinduet ved å dobbeltklikke på den fullstendig fargede prøven for å vise de utakknemlige hendelsene som er anskaffet for prøven i en prikkplott.
Legg merke til at x- og y-aksen er merket som i FCS-filene, som angitt i tabell to av flow cytometer innstillingsfilen for dette manuskriptet. Kontroller at et tilstrekkelig antall hendelser vises for riktig visualisering. Om nødvendig åpner du preferanser ved å klikke på hjerteikonet på arbeidsområdebåndet, velger Grafer, deretter Dot Plot"som graftype, og kontroller at antall prikker som er tegnet i den tilsvarende boksen, er riktig eller endre det.
Vis de utakknemlige hendelsene i grafvinduet i et punktplott med DNA-A på x-aksen og DNA-W på y-aksen. Bruk lineær skala for begge aksene. Endre om nødvendig skala fra logaritmisk til lineær ved å klikke på boksen som er angitt med en T nær hver akse i grafvinduet.
Velg en enkelt cellepopulasjon ved å klikke på rektangel i delen for trykkingsverktøyet, og dobbeltklikk deretter midt i den rektangulære porten for å vise enkeltceller i en prikkplott med FSC-A-parameter på x-aksen og død celle dø på y-aksen. Klikk på polygonen for å velge levende cellepopulasjon, som er negative for død celledød. Dobbeltklikk midt i polygonporten for å vise cellene i en prikktegning med FSC-A-parameteren på x-aksen og SSC-A-parameteren på y-aksen.
Klikk på rektangel og lag en avslappet port for å inkludere alle enkelt levende celler i den grafen. Dobbeltklikk midt i den avslappede porten for å vise cellene i en prikkplott med CD3 på x-aksen og CD8 på y-aksen. Bruk riktig tilgangsskala for visualisering i diagramvinduet.
Hvis det er nødvendig, endrer du x- og y-skalaen ved å klikke på boksen, angitt med en T nær hver akse, velge Tilpass tilgangsfunksjon og endre ekstra neg tiår med baser og positive tiår etter behov. Velg CD3+CD8+-cellene ved å klikke på polygon. Dobbeltklikk midt på CD3+CD8+-porten for å vise cellene i en prikktegning med Tetr-gag på x-aksen og Pent-gag på y-aksen.
Velg de antigenspesifikke CD8 T-cellene ved å klikke på polygon. Dobbeltklikk midt i den gag-spesifikke porten for å vise cellene i et punktplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Velg cellene i de forskjellige cellesyklusfasene ved å klikke på Quad"i gatingverktøydelen av grafvinduet.
Kopier gatingstrategien som er opprettet i ett utvalg, til den tilsvarende gruppen for å bruke portene på alle eksemplene i gruppen. Kopier deretter gatingstrategier for b-milten og CBM-gruppene, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kontroller at alle portene passer for hvert utvalg av de tre gruppene.
Desynkroniser om nødvendig gruppen og endre portene som beskrevet i manuskriptet. Vis BM-cellene i den avslappede porten i en prikkplott med DNA-A på x-aksen og Ki67 på y-aksen. Visualiser resultatene ved å klikke Oppsettredigering i delen på båndet i arbeidsområdet.
Dra hver port i gating-strategien i eksempelruten til oppsettredigeringsprogrammet, og plasser plottene i henhold til sekvensen av gangen. Endre om nødvendig graftypen ved å dobbeltklikke på den tilsvarende tomten i oppsettet og velge riktig type i grafdefinisjonsvinduet. Klikk på gruppen og gjenta etter funksjoner på layoutbåndet for å visualisere resultatene oppnådd i antigenspesifikke CD8 T-celler fra hvert organ og sammenligne forskjellige prøver.
Visualiser resultatene av benmargsceller som representerer en positiv kontroll. Et typisk eksempel på cellesyklusanalyse av benmargsceller vises her. Protokollen ga en lav koeffisient av variasjon av G0 til G1 og G2 til M DNA-topper, noe som indikerer utmerket kvalitet på DNA-fargingen.
En femtrinns gating strategi ble brukt til å identifisere antigen spesifikke CD8 celler. To multimere ble brukt til å forbedre følsomheten til gag-spesifikk CD8 T celledeteksjon hos vaksinerte mus uten å øke fargingsbakgrunnen hos ubehandlede mus. Gag-spesifikke CD8 T-celler i drenerende lymfeknuter og i milten inneholder en høy andel celler i S-G2 / M-fasene på dag tre innleggsøkning.
Videre hadde gag-spesifikke CD8 T-celler i S-G2/ M-fasene høy FSC-A og SSC-A når de ble lagt over på de totale CD8 T-cellene fra samme organ. Offset histogrammer viste at CD62L-uttrykket ved gag-spesifikke CD8 T-celler var lavt, som forventet for aktiverte T-celler, bortsett fra noen få celler i G0 i lymfeknuter. Denne metoden er designet for T-celler for å oppnå en utmerket kvalitet på DNA-farging sammen med membranen og Ki67-fargingen.
Flow cytometridataanalyse er et nøkkelpunkt. Pass på at du bruker riktig kontroll for portposisjonering. Ved hjelp av denne metoden oppdaget vi T-celler i S-G2 / M faser av cellesyklus i mus og menneskelig perifert blod.
Denne teknikken var nyttig i immunovervåkingsstudier i type 1 diabetes, smittsom mononukleose og COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
