Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tid-løst fluorescens imaging og analyse av kreft celle invasjon i 3D sfæroid modell
Chapters
Summary January 30th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presentert her er en protokoll for fabrikasjon av en sfæroid bildeenhet. Denne enheten muliggjør dynamisk eller langsgående fluorescensavbildning av kreftcellesfæroider. Protokollen tilbyr også en enkel bildebehandlingsprosedyre for analyse av kreftcelleinvasjon.
Transcript
Denne protokollen kan brukes til å studere mekanismene som styrer invasjonen av kreftceller i den ekstracellulære matrisen i sanntid. Den største fordelen med denne teknikken er at den bruker en enkel sfæroid bildeenhet, noe som gjør spheroid invasjonsanalysen lettere å sette opp og forbedrer effektiviteten og kostnaden. Mens vi demonstrerer ved hjelp av spheroid invasjonsanalyse for å modellere mammary karsinom, er denne analysen en utmerket modell for invasjonen av en solid svulst i det omkringliggende sunne vevet.
Etter 3D-utskrift av avstandsspennen, kan du vekte ut et 10:1-forhold mellom basepolymer og krysskobling i en plastkopp og bruke en engangspipette til å blande den resulterende PDMS-løsningen grundig i koppen. Plasser koppen i et vakuumkammer og slipp raskt vakuumtrykket for å fjerne luft som er fanget på overflaten av blandingen og for å spre de gjenværende luftboblene. Inkuber 3D-trykt avstandss avstandss 100 grader Celsius i fem minutter for å øke fleksibiliteten og rengjøre to glassplater med 100% isopropanol.
Plasser avstandsspylet slik at det skylles mellom de to rengjorte platene og legg to store bindemiddelklemmer på nedre kant og en på øverste hjørne for å forsegle formen på ytterkantene av platene. Inspiser den øverste delen av formen for å sikre at avstandsspylet er i flukt med glassplatene og bruk en engangspipette med ca. to centimeter kuttet fra spissen for å sakte, men kontinuerlig legge PDMS-blandingen til øverste venstre hjørne av formen. Når hele formen er fylt, legg formen i vakuumkammeret for å fjerne eventuelle luftbobler som har dannet seg, før du herder PDMS i en time ved 100 grader Celsius.
På slutten av inkubasjonen, plasser formen ved romtemperatur. Når det er kult å ta på, fjern bindemiddelklemmene og glassplatene fra avstandssedemeren som inneholder de herdede PDMS og bruker et barberblad til å skjære gjennom forseglingen som ble opprettet på alle fire sidene av formen mellom avstandsslyset og glassplaten. Trekk fra hverandre formen for å avsløre PDMS-arket i avstandsskjørtet og bruk pinsett til å forsiktig skrelle PDMS-arket av avstandssrommet.
Plasser arket på en skjærematte og bruk en biopsipunch for å slå ut en PDMS-plate med 17,5 millimeter diameter, og slå deretter tre jevnt fordelte 5,5 millimeter hull inn i platen. Bruk tape for å fjerne støvpartikler fra hver innsats og stikke de rengjorte innsatsene på et stykke dobbeltsidig tape. Pakk båndet rundt lokket på en 10 centimeter petriskål og legg lokket i en plasmamaskin sammen med åpne 35 millimeter glassbunnsretter.
Aktiver innsatser og glass med ett minutt plasmabehandling på 300 millitorrs og bruk pinsett for raskt å feste den behandlede siden av hvert innlegg til glassdelen av en behandlet glassbunnsrett per innsats. Når alle innsatsene er påført, bruk pekefingeren og tommelen til å legge jevnt press på hver innsats mens du roterer parabolen for å feste innsatsene sikkert til oppvasken. Når alle innsatsene er sikret, inkuber de resulterende sfæroidbildeenhetene i 20 minutter ved 60 grader Celsius, før du utfører en ny runde plasmabehandling som vist.
Etter den andre behandlingen, tilsett 35 mikroliter med nylaget beleggløsning til hvert innsatshull. Etter en time ved romtemperatur, fjern beleggoppløsningen og skyll enheten tre ganger med destillert vann. Etter siste vask, tilsett 35 mikroliter krysskoblingsløsning til hvert hull for en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur.
På slutten av inkubasjonen, skyll enheten tre ganger med destillert vann som demonstrert, før du fyller hver enhet med 70% etanol for en 30-minutters inkubasjon under UV-lys. På slutten av steriliseringen, skyll enhetene tre ganger med destillert vann og tilsett 2,5 ml lagringsløsning til hver enhet. For å bygge inn sfæroider i kollagen, vask enhetene tre ganger med tre milliliter PBS per vask.
Etter den siste vasken, la enhetene tørke helt, før du legger til en sfæroid i 30 mikroliter av nylaget college en løsning i ett hull på innsatsen og starter en timer. Etter å ha bekreftet tilstedeværelsen av sfæroid i hullet, legg sfæroider til de to andre hullene som demonstrert. Bruk en 10 mikroliter pipettespiss til nyere sfæroider som ligger nær PDMS-grensen, eller for å skille sfæroidene hvis flere sfæroider dispenseres og stopper timeren.
For å vertikalt sentrere spheroiden i kollagenlaget, snu enheten opp ned og inkubere enheten ved 37 grader til kollagenpolymerer, reversere enhetens orientering hvert andre minutt i totalt 30 minutter, og legg deretter til 2,5 milliliter medium per enhet og få et bilde av sfæroidene på null timers tidspunkt. Ved hjelp av en sfæroid bildeenhet forenkler effektiv innebygging og time-lapse opptak av kreftcelleinvasjon i kollagen eller via langsgående bildebehandling. Mens denne sfæroiden ble avbildet langsgående i løpet av seks dager som krever stabilt uttrykk for cytoplasmatiske og/ eller kjernefysiske fluorescerende proteiner, kan lignende langsgående bildebehandling utføres over en kortere tidsperiode ved hjelp av fargestoffmerking.
Sfæroider kan også festes og immunolabeled. For eksempel ble disse sfæroidene immunolabeled for epitel-cadherin, kortactin og F-actin. I disse bildene kan en trinnvis illustrasjon av bildebehandlingsprosedyren ved hjelp av Fiji-makroen til å måle området av sfæroidet over tid observeres.
Pass på å føre en enkelt sfæroid inn i hvert hull i spheroid bildeenheten og for å plassere sfæroid i midten av hullet i både XY og Z retninger. Enhetsdesignen kan enkelt endres ved å endre størrelsen og arrangementet av hullene, innsatsene og glassbunnsrettene for å imøtekomme en høyere sfæroid gjennomstrømning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
