Murine हेपेटोसाइट Organoids की स्थापना और आनुवंशिक हेरफेर

जिगर स्तनधारियों में सबसे बड़ा अंग है। यह चयापचय और detoxification में बहुत महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यद्यपि जिगर में विट्रो में एक उल्लेखनीय पुनर्जनन क्षमता है, फिर भी यह अभी भी हेपेटोसाइट इन-विट्रो को संस्कृति के लिए एक लंबी अवधि के लिए एक बहुत बड़ी चुनौती है।

यहां, हम परिपक्व हेपेटोसाइट्स से हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स स्थापित करते हैं। यह आकृति विज्ञान और कार्य में हेपेटोसाइट्स की मुख्य विशेषताओं को रखता है। इस वीडियो में, हम पेश करेंगे कि इन ऑर्गेनोइड्स को कैसे संस्कृति और पारित किया जाए और विवरण में इन ऑर्गेनोइड्स के आनुवंशिक संशोधन को कैसे किया जाए।

सबसे पहले, जिगर परफ्यूजन और पाचन। सभी क्षेत्रों और उपकरणों को तैयार करें और उन्हें बाँझ बनाएं। माउस को धोएं और एपिडर्मल और त्वचा को खोलें, और फिर जिगर के थैली ओवन को खोजने की कोशिश करें।

इसमें सुइयों को इंजेक्ट करें, और फिर इसे कैप्चर करें। प्रति मिनट पांच मिलीलीटर की गति से परफ्यूजन करें, जब तक कि जिगर पीला न हो जाए। उन्हें परफ्यूजन बफर में बदलें, ध्यान से रखें, जिगर को देखें, जब तक कि यह नरम न हो जाए।

आमतौर पर इसमें तीन से पांच मिनट लगते हैं, फिर लिवर को काटकर प्लेटों में डाल दें, और कैंची से उन्हें छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें। इसे बार-बार ऊपर और नीचे पेप करें। आमतौर पर, उन्हें एकल सेल में बनाने में 10 से 15 मिनट लगते हैं।

और फिर इसे 10 से 15 मिनट के साथ ऊपर और नीचे पेप करें और फिटर के माध्यम से उन्हें खिलाएं। उन्हें एकल कोशिकाओं में बनाएं। 50 मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें सेंट्रीफ्यूज करें, गति के साथ और फिर सभी प्रति प्लेटों को इकट्ठा करें।

उन्हें हमेशा ठंडी बर्फ में रखने की कोशिश करें। एकल सेल निलंबन बनाएं और उन्हें सेल काउंटर के साथ गिनें। आमतौर पर हेपेटोसाइट्स यदि खुश होते हैं, तो इसमें जीवंत फ्लोरोसेंट होता है।

दूसरा भाग, हम कोशिकाओं को बैठने और ऑर्गेनोइड संस्कृति करने की कोशिश करते हैं। हम सभी कोशिकाओं को निलंबित करते हैं, और कोशिकाओं को एक निश्चित कंसंट्रो-संलयन के साथ गिनते हैं और फिर हम मिश्रण करते हैं। Metrogels. और कोड माध्यम।

आमतौर पर हम माध्यम और मेट्रोजेल के साथ, 1 से 2 या 1 से 3 के अनुपात में लेते हैं। उन्हें ध्यान से मिलाने के बाद, हम उन्हें ग्रेडिएंट प्लेटों पर बैठते हैं। हम आमतौर पर 24 प्लेट पर अच्छी तरह से 100 माइक्रोलीटर जोड़ते हैं।

उन्हें 37 डिग्री के तापमान पर इनक्यूबेटर में डालें। 20 मिनट के बाद, हम उन्हें नीचे और फिर माध्यम पर नीचे के साथ रिवर्स आगे रखते हैं। दो या तीन दिनों के काउंटरिंग के साथ, हम आमतौर पर ऑर्गेनोइड्स को बाहर आते हुए देखते हैं।

यह हमारे organoids की विशिष्ट छवि है। हमें आमतौर पर ऑर्गेनोइड्स से एकल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है यदि हम मार्ग करना चाहते हैं या कुछ आनुवंशिक संशोधन विधि करना चाहते हैं तो हम कोट धोने के बफर के साथ काउंटरिंग प्लेटों से सभी ऑर्गेनोइड्स एकत्र करते हैं। हम supernatant ड्रॉप, तो कोट प्लेट में बफर धोने पर, उन्हें मिश्रण, तो यह ऊपर और नीचे पेप.

और फिर हम आमतौर पर वॉश टेप बफर के साथ सभी युक्तियों को पूर्व-धोते हैं। सभी organoids युक्तियों पर टिप से बचने के लिए. और फिर बर्फ पर एक नया बैच या इसके बिना, हम सेंट्रो-फ्यूजन द्वारा सभी ऑर्गेनोइड्स एकत्र करते हैं।

हम उनका इलाज करते हैं, सभी मेट्रोजेल को हटाने के लिए एक conning radients है। बर्फ पर इनक्यूबेशन के 20 से 30 मिनट के बाद सभी मेट्रोजेल हटा दिए जाते हैं। हम सभी स्वच्छ ऑर्गेनोइड्स एकत्र करते हैं और उन्हें एकल कोशिकाओं में बनाने के लिए ट्रिप्सिन जोड़ते हैं।

ट्रिप्सिन को जोड़ने के बाद, हम इनक्यूबेटर में ऑर्गेनोइड्स का इलाज करते हैं। लिवर ऑर्गेनोइड्स को सिंगल सेल्स बनने में 5 से 10 मिनट लगते हैं। हम triplatin को रोकने के लिए और अधिक धोने buffers जोड़ते हैं।

और फिर इसे ऊपर और नीचे उनकी ओर पेप करें। विकल्प प्रक्रिया के लिए, आप सभी ट्रिप्सिन को हटाने के लिए उन्हें एक और बार धो सकते हैं। सेन्ट्रोफ्यूजन द्वारा धोने के बाद, हम उन्हें सेल काउंटर के नीचे गिन सकते हैं।

फिर हम दिखाएंगे कि इन हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स के लेनदेन या अभिकर्मक को कैसे किया जाए। सबसे पहले, आप जो करेंगे उसकी ट्यूबों को लेबल करें, और फिर हम निर्माता के निर्देशों के अनुसार दृष्टि अभिकर्मक करेंगे। आप की जरूरत है, lipoyl तथ्य TAMING INI MaX के रीजेंट.

हम जोड़ते हैं। नियंत्रण और विशिष्ट जीन siRNA, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इष्टतम के साथ उन्हें incubate. और फिर सेल एकाग्रता के अनुसार हम RAN अधिकतम जोड़ते हैं और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करते हैं।

फिर हम भी इष्टतम के साथ अलग से RAN अधिकतम जोड़ें और उन्हें बर्फ पर डाल दिया. 5 मिनट के बाद, हम अलग-अलग siRNas, विशिष्ट जीन RANi और II नियंत्रण के साथ अलग-अलग RAN अधिकतम मिश्रण को अलग-अलग पेप करते हैं और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करते हैं। उन्हें फिर से बर्फ पर रखो, और फिर हम सभी ऑर्गेनोइड्स, धीमी गति से सेंट्रोफ्यूजन एकत्र करते हैं, सभी supernatant को छोड़ देते हैं, हम इस सेल प्लेट में आरएनएआई अधिकतम, siRNA मिश्रण जोड़ते हैं और इसे पूरी तरह से ऊपर और नीचे पेप करते हैं।

संक्षेप में, कोशिकाओं और लेबल आरएनएआई अधिकतम और siRNA मिश्रण gentrification थे और 37 डिग्री पर 4 से 5 घंटे के लिए incubate थे। अंतिम भाग, इन हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स को लेंटी वायरस से भी संक्रमित किया जा सकता है। इसी तरह के संदेश siRNA अभिकर्मक के रूप में प्रदर्शन किया गया था।

नियंत्रण और siRNA वायरस ट्यूबों को अच्छी तरह से तैयार किया गया था, और इष्टतम निर्माता के निर्देशों के अनुसार जोड़ा गया था। फिर पॉली ग्रीन जैसे संक्रमण क्षेत्रों के साथ और फिर हम निर्माता के निर्देशों के अनुसार अलग-अलग लेंटी वायरस जोड़ते हैं। organoids संस्कृति और 1.5 milliters eppendorf ट्यूबों में विभिन्न कणों में एकल सेल निलंबन गठबंधन, जोड़ें, अच्छी तरह से, उन्हें मिश्रण इस मिश्रण प्लेट, और उन्हें 32 डिग्री पर 1 घंटे के लिए ध्यान केंद्रित।

ध्यान संलयन 500 G. और 4 से 5 घंटे के बाद किया जाएगा इनक्यूबेशन 37 डिग्री पर सेल निलंबन तब एकत्र किया जाएगा और metrogel में बैठेगा। और उन्हें फिर से इनक्यूबेटर में डाल दिया। गठन दक्षता या अन्य कार्यात्मक विश्लेषण पर अंग 7 से 10 दिनों बाद किया जा सकता है।

यहाँ हमारे प्रतिनिधि परिणाम है. चित्र 1A में, आप माउस से हमारे ALB-Cre Rosa 26-GFP या RFP हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड देख सकते हैं। चित्र 1 बी में आप धुंधला में Ki67 सकारात्मक संकेत देख सकते हैं, जिसने दिखाया है कि हमारे हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स फैल रहे हैं।

चित्र 2A और 2B में यहाँ हमारे जीन की हमारी हस्तक्षेप अभिव्यक्ति की एक प्रतिनिधि जीन अभिव्यक्ति है। हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स में आनुवंशिक हेरफेर के बाद, हस्तक्षेप प्रभावी बहुत कुशल है। यहाँ आंकड़ा 2 सी है, आप हमारे murine organoids में carsonite प्रौद्योगिकी के साथ आनुवंशिक हेरफेर के बाद देख सकते हैं.

निष्कर्ष, हमारे परिणामों से पता चला है कि हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स को विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। संक्षेप में, इस वीडियो में हम दिखाते हैं कि हेपेटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए यकृत परफ्यूजन और पाचन कैसे करें। हेपेटोसाइट्स पर कब्जा करने और हेपेटोसाइट्स ऑर्गेनोइड्स को कैसे पारित करें।

इसके अलावा, हमने दिखाया कि इन ऑर्गेनोइड्स के आनुवंशिक के संशोधन को करने के लिए siRNA और वेक्टर अभिकर्मक या लेंटी वायरस संक्रमण कैसे करें। इसके अलावा, हमारे ऑर्गेनोइड्स में दो कमी हैं। सबसे पहले, हमने हेपेटोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए प्रति कोर या फर कोर का उपयोग नहीं किया।

और दूसरा मुझे लगता है कि अधिक विकास कारकों और सिग्नलिंग को ऑर्गेनोइड्स के बढ़ते समय में सुधार करने की कोशिश की जानी चाहिए।