Etablering och genetisk manipulering av Murine Hepatocyte Organoids

Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en mycket viktig roll i ämnesomsättningen och avgiftningen. Även om levern har en anmärkningsvärd regenereringskapacitet in vitro, är det fortfarande en mycket stor utmaning på lång sikt att odla hepatocyt in vitro.

Här etablerar vi hepatocyterna organoider från mogna hepatocyter. Det håller huvuddragen hos hepatocyter i morfologi och funktion. I den här videon kommer vi att introducera hur man kultur och passage dessa organoider och hur man utför den genetiska modifieringen av dessa organoider i detaljer.

Först leverperfusion och matsmältning. Förbered alla regioner och instrument och gör dem sterila. Tvätta musen och öppna epidermal och huden, och försök sedan hitta påsugnen i levern.

Injicera nålarna i den och fånga den här. Gör perfusionen med en hastighet av fem milliliter per minut tills levern blir blek. Byt dem till perfusionsbufferten, placera försiktigt, titta på levern tills den blir mjuk.

Vanligtvis tar det tre till fem minuter, skär sedan levern och lägg dem i plattorna och skär dem i små bitar med saxen. Peppa det upp och ner ofta. Vanligtvis tar det 10 till 15 minuter att göra dem till den enda cellen.

Och peppa sedan upp och ner med 10 till 15 minuter och mata dem genom montören. Gör dem till de enda cellerna. Samla alla celler i 50 milliliterröret och centrifugera dem, med hastigheten och samla sedan alla per plattor.

Försök att alltid hålla dem i den kalla isen. Gör encellsupphängningarna och räkna dem med cellräknaren. Vanligtvis hepatocyterna om de är glada, har det den livliga fluorescerande.

Den andra delen försöker vi sitta cellerna och göra den organoida kulturen. Vi samlar alla cell suspensioner, och räknar cellerna med en viss concentro-fusion och sedan blandar vi. Metrogels. och kodmediet.

Vanligtvis tar vi, med mediet och metrogelerna, med förhållandet 1 till 2 eller 1 till 3. Efter att noggrant ha blandat dem sätter vi dem på gradientplattorna. Vi brukar lägga till 100 mikroliter vid 24-plattan väl.

Sätt dem i inkubatorn vid temperaturen 37 grader. Efter 20 minuter lägger vi dem bakåt med botten längst ner och sedan på mediet. Med två eller tre dagars kontrande ser vi vanligtvis organoiderna komma ut.

Detta är den typiska bilden av våra organoider. Vi behöver vanligtvis enstaka celler från organoider om vi vill göra passagen eller göra någon genetisk modifieringsmetod Vi samlar alla organoider från motplattorna med pälstvättbufferten. Vi släpper supernatanten, sedan vid pälstvättbufferten i plattan, blanda dem, så peppa den upp och ner.

Och då brukar vi förtvätta alla tips med tvättbandbufferten. För att undvika alla organoider tippar på spetsarna. Och sedan med, en ny sats på is eller utan den, samlar vi alla organoider genom centro-fusion.

Vi behandlar dem, det finns en räd radients för att ta bort alla metrogels. Efter 20 till 30 minuters inkubation på is avlägsnas alla metrogeler. Vi samlar alla rena organoider och lägger till trypsin för att göra dem till enstaka celler.

Efter trypsin läggs till behandlar vi organoiderna i inkubatorn. Det tar 5 till 10 minuter för leverorganoider att bli enstaka celler. Vi lägger till fler tvättbuffertar för att stoppa triplatin.

Och sedan peppa det upp och ner mot dem. För alternativprocess kan du tvätta dem en gång till för att ta bort allt trypsin. Efter att ha tvättats av centrofusion kan vi räkna dem under cellräknaren.

Då kommer vi att visa hur man gör transaktion eller transfektion av dessa hepatocyter organoider. Märk först rören på vad du ska göra, och sedan gör vi syntransfektionen enligt tillverkarens instruktioner. Du behöver, regenten av lipoyl fakta tämjer INI MaX.

Vi lägger till. och den specifika genen siRNA, och inkubera dem med det optimala, enligt tillverkarens instruktioner. Och sedan enligt cellkoncentrationen lägger vi till RAN max och blandar dem noggrant.

Sedan lägger vi också till RAN max med det optimala separat och lägger dem på is. Efter 5 minuter peppar vi upp separat RAN max blandning med olika siRNAs, Specifik gen RANi och II kontroll separat och blanda dem noggrant. Lägg dem på is igen, och sedan samlar vi alla organoider, långsam centrofusion, släpper alla supernatant, vi lägger till RNAi max, siRNA-blandningen i denna cellplatta och peppar den upp och ner noggrant.

Kort, cellerna och etiketten RNAi max och siRNA blandning var gentrification och inkubera i 4 till 5 timmar vid 37 grader. Den sista delen, dessa hepatocytes organoider kan också infekteras av Lenti virus. Liknande meddelande utfördes som siRNA transfection.

Kontrollen och siRNA-virusrören var väl förberedda, och det optimala lades till enligt tillverkarens instruktioner. Sedan med infektionsregionerna som polygrönt och sedan lägger vi till olika Lenti-virus, enligt tillverkarens instruktioner konstitution. Kombinera encellsupphängningarna i organoidkulturen och olika partiklar i 1,5 ml eppendorfrör, Tillsätt, blanda dem Plätera denna blandning och koncentrera dem i 1 timme vid 32 grader.

Koncentratfusionen kommer att utföras vid 500 G.Och efter 4 till 5 timmars inkubation vid 37 grader kommer cellfjädringen sedan att samlas in och sitta i metrogel. Och sätt dem i inkubatorn igen. Organet på formation effektivitet eller annan funktionell analys kunde utföras 7 till 10 dagar senare.

Här är våra representativa resultat. I figur 1A kunde du se vår ALB-Cre Rosa 26-GFP eller RFP hepatocytes organoid från musen. I figur 1B kunde man se ki67-positiv signal vid färgning, som har visat att våra hepatocyterorganoider sprider sig.

I figur 2A och 2B här är ett representativt genuttryck av vårt störande uttryck av våra gener. Efter genetisk manipulering i hepatocyter organoider är den störande effektiva mycket effektiv. Här är figur 2C, du kunde se efter genetisk manipulation med karsonitteknik i våra murinorganoider.

Slutsats visade våra resultat hepatocytes organoider kunde utökas in vitro och genetiskt manipuleras. Sammanfattningsvis visar vi i den här videon hur man gör leverperfusionen och matsmältningen för att få hepatocyterna. Hur man fångar hepatocyterna och passager hepatocyterna organoider.

Vi visade också hur man gör siRNA och vektor transfektion eller Lenti virusinfektion för att göra modifieringen av genetiken hos dessa organoider. Dessutom har vi två brister i våra organoider. För det första använde vi inte per kärna eller pälskärna för att rena hepatocyterna.

Och för det andra tycker jag att fler tillväxtfaktorer och signalering bör försöka förbättra organoidernas växttid.