Immunology and Infection
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Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva
Chapters
Summary October 19th, 2021
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Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.
Transcript
Questo protocollo affronta le difficoltà e le sfide con la microiniezione della larva descrivendo un metodo preciso che consentirà l'uso della larva di Drosophila melanogaster come modello per vari studi immunitari e molecolari. Questa è una semplice tecnica di iniezione che presenta un metodo efficiente, economico e rapido per fornire ripetutamente una varietà di sostanze in modo uniforme, il che consente risultati coerenti e affidabili. Inizia selezionando le larve del terzo stadio instar e lavandole con la soluzione di Ringer in una piccola capsula di Petri.
Mettere una carta da filtro in una capsula di Petri e inumidirla con 5 ml di soluzione di Ringer. Quindi posizionare le larve sulla carta da filtro. Preparare i capillari utilizzando tubi capillari di vetro da 3,5 "in un estrattore di micropipette.
Aprire il capillare di vetro con l'aiuto di pinze dritte a punto medio seghettato. Riempire il capillare aperto con olio minerale usando una siringa monouso di plastica. Quindi, espellere l'olio dal tubo capillare con un iniettore nanoliter.
Riempire il capillare con la preparazione batterica desiderata per l'iniezione. Trasferire le larve anestetizzate su una carta da filtro inumidita con la soluzione di Ringer. Usando la pinza, applicare una forte pressione sul lato dorsale dell'estremità posteriore delle larve, dove sono evidenti gli spiracoli tracheali.
Quindi, inserire l'ago orizzontalmente, verso l'estremità posteriore delle larve, e iniettare le scorte batteriche. Rimuovere la pinza per evitare fuoriuscite di emolinfa o intestino. Quindi, prelevare l'ago precedentemente inserito nelle larve.
Infettare 20 larve per ogni condizione sperimentale. Usando un pennello, trasferire delicatamente le larve iniettate su una carta da filtro umida separata. Aggiungere la soluzione di Ringer se necessario per evitare l'essiccazione.
Incubare la capsula di Petri in un'incubatrice a 25 C.Le larve di Drosophila melanogaster infettate da Photorhabdus asymbiotica hanno mostrato un tasso di sopravvivenza del 57% per 24 ore dopo l'iniezione, mentre la larva iniettata con Escherichia coli ha mostrato un tasso di sopravvivenza dell'85% nello stesso momento. L'importanza di questo metodo è che l'ago è tenuto approssimativamente parallelo alla larva. La pressione applicata per trattenere la larva è molto piccola, il che riduce la possibilità di perdite di emolinfa, lesioni mortali o consegna inadeguata della sostanza desiderata.
Questa tecnica può essere perfezionata con la pratica.
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