Immunology and Infection
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Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas
Chapters
Summary October 19th, 2021
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Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.
Transcript
Este protocolo aborda las dificultades y desafíos con la larva microinyectante al describir un método preciso que permitirá el uso de la larva Drosophila melanogaster como modelo para diversos estudios inmunológicos y moleculares. Esta es una técnica de inyección simple que presenta un método eficiente, rentable y rápido para administrar repetidamente una variedad de sustancias de manera uniforme, lo que permite resultados consistentes y confiables. Comience seleccionando las larvas de la tercera etapa instar y lavándolas con la solución de Ringer en una pequeña placa de Petri.
Coloque un papel de filtro en una placa de Petri y humedézcalo con 5 ml de solución de Ringer. Luego coloque las larvas en el papel de filtro. Prepare los capilares utilizando tubos capilares de vidrio de 3.5 "en un extractor de micropipetas.
Abra el capilar de vidrio con la ayuda de pinzas de punto medio dentadas rectas. Llene el capilar abierto con aceite mineral con una jeringa desechable de plástico. Luego, expulse el aceite fuera del tubo capilar con un inyector de nanolitros.
Llene el capilar con la preparación bacteriana deseada para inyección. Transfiera las larvas anestesiadas a un papel de filtro humedecido con la solución de Ringer. Usando fórceps, aplique una presión firme en el lado dorsal del extremo posterior de las larvas, donde los espiráculos traqueales son evidentes.
Luego, inserte la aguja horizontalmente, hacia el extremo posterior de las larvas, e inyecte las existencias bacterianas. Retire los fórceps para evitar derrames de hemolinfa o intestino. Luego, retire la aguja previamente insertada en las larvas.
Infectar 20 larvas por cada condición experimental. Con un pincel, transfiera suavemente las larvas inyectadas a un papel de filtro húmedo separado. Agregue la solución de Ringer según sea necesario para evitar la desecación.
Incubar la placa de Petri en una incubadora a 25 C.Las larvas de Drosophila melanogaster infectadas con Photorhabdus asymbiotica exhibieron una tasa de supervivencia del 57% durante 24 horas después de la inyección, mientras que la larva inyectada con Escherichia coli mostró una tasa de supervivencia del 85% en el mismo punto de tiempo. La importancia de este método es que la aguja se mantiene aproximadamente paralela a la larva. La presión aplicada para retener a la larva es muy pequeña, lo que reduce la posibilidad de fuga de hemolinfa, lesiones fatales o entrega inadecuada de la sustancia deseada.
Esta técnica se puede perfeccionar con la práctica.
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