Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kontrollere partikkelfraksjon i mikroporøse annealede partikkelstillaser for 3D-cellekultur
Chapters
Summary October 28th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Minimering av variasjonen i partikkelfraksjonen i granulære stillaser muliggjør reproduserbar eksperimentering. Dette arbeidet beskriver metoder for å generere granulære stillaser med kontrollerte partikkelfraksjoner for in vitro vevstekniske applikasjoner.
Transcript
Granulære materialer, som MAP-stillaser, er porøse injiserbare materialer laget av sammenkoblede hydrogelpartikler i mikrostørrelse. Kontroll av partikkelfraksjon er kritisk for materialegenskaper og cellulære responser. Variable partikkelfraksjoner i MAP-stillas resulterer i en rekke stillasegenskaper og celleresponser, men denne teknikken lar brukerne definere den endelige partikkelfraksjonen i MAP-stillasene de lager.
MAP-stillas kan brukes til å fremme reparasjon og regenerering av komplekse sår, samt å levere medisiner. Partikkelfraksjon påvirker for eksempel hastigheten og graden av cellulær infiltrasjon og regenerering. Denne metoden kan brukes på tvers av alle klasser av granulære hydrogeler.
Nå som vi kan lage MAP-stillaser med brukerstyrte partikkelfraksjoner, kan vi reproduserbart studere bioaktiviteten til disse materialene og undersøke unike celleresponser, for eksempel inneslutning. Å sette opp mikrofluidisk mikrogelgenerering krever tid og tålmodighet når du lærer teknikkene. Det er best å ha flere enheter klargjort og klar i tilfelle du får problemer med oppsettet.
Begynn med mikrofluidisk produksjon av hyaluronsyre, eller HA, og Norbornene, eller NB, mikrogeler. Før du tørker mikrogelene, veier du et kryosikkert skrukorkrør. Deretter overfører du de vaskede og rensede mikrogelene til et kryosikkert skrukorpeter i en steril hette ved hjelp av en pipette med positiv forskyvning.
Tilsett 70% etanol til de rensede mikrogelene og bland godt. Sentrifuge røret i fem minutter ved 5.000 g. Aspirer supernatanten, og tilsett 70% etanol.
Bland godt og rug over natten ved fire grader Celsius. Neste dag, kort sentrifuge for å sikre at mikrogelene er i bunnen av røret. Tilsett flytende nitrogen i en kryogen beholder, og legg røret med mikrogeler for å fryse ned.
Etter fem til 10 minutter, fjern røret av mikrogeler med tang. Fjern hetten raskt, og dekk røret med laboratorievev. Fest vevet med et gummibånd, og overfør det til en lyofiliseringsbeholder eller kammer.
Legg prøven på lyofilisatoren etter produsentens instruksjoner, og lyofiliser ved 0,066 Torr og minus 63 grader Celsius. Vei de lyofiliserte mikrogelene fra røret før du lagrer dem ved romtemperatur. Bland polydimetylsiloksan, eller PDMS elastomerbase med herdemiddelet i forholdet 10 til ett med masse.
Hell PDMS-blandingen i en stor petriskål og degaser i plast i tørkeovnen i 30 minutter, eller til alle boblene har forsvunnet. Når alle boblene har forsvunnet, plasser den 3D-printede formen forsiktig i PDMS for å minimere dannelsen av nye bobler. Sett i ovnen ved 60 grader Celsius i to timer for å kurere PDMS.
Etter herding, bruk en kniv eller barberblad for å forsiktig spore rundt omkretsen av kulturenheten, og fjern formen forsiktig. Bruk en fire millimeter biopsistans for å fjerne PDMS fra bunnen av brønnene. Klipp enhetene slik at de passer på et glassdeksel.
Bruk tape for å fjerne støv fra undersiden av kulturenheten. Plasser det rene glassdekselet og kulturanordningen på en kokeplate ved 135 grader Celsius i 15 minutter for å fjerne fuktighet. I en avtrekkshette, bruk en koronaplasmapistol høyt på glassdekselet og undersiden av enheten i 30 sekunder.
Bind deretter de behandlede overflatene raskt sammen. Trykk forsiktig for å sikre en god forsegling mellom kulturenheten og glassdekselet. Plasser enheten i en 60 grader Celsius ovn over natten for å sikre bindingen.
Neste dag autoklav enheten for å sterilisere før bruk in vitro. Deretter klargjør du Microporous Annealed Particle, eller MAP stillaskomponenter, basert på ønsket partikkelfraksjon for cellekultur i MAP-stillas. Vei lyofiliserte mikrogeler for å bestemme massen av mikrogeler.
Rekonstituer deretter mikrogelene i 84 % av det endelige MAP-volumet av cellemedier basert på valgt vektprosent MAP. La mikrogelene svulme i 20 minutter. Oppløs hyaluronsyren, eller HA-tetrazin, og cellemedier i 16 % av det endelige MAP-volumet.
Når cellene har nådd ønsket sammenløp, løft og tell cellene. Overfør 10.000 celler per mikroliter MAP til et nytt rør. Sentrifuger cellene, og aspirerer supernatanten fra pelleten uten å aspirere cellene.
Tilsett mikrogeler og tverrbinding til pelleten ved hjelp av en forskyvningspipette. Bland godt, og frø 10 mikroliter per brønn. Pipette i en sirkulær bevegelse for å fordele blandingen jevnt i brønnen.
La mikrogelene anneal ved 37 grader Celsius i 25 minutter før du legger til cellemedier for å fylle brønnene. Oppretthold 3D-kulturene ved 37 grader Celsius, og bytt media etter behov. For å unngå å aspirere stillaset, stabiliser pipettespissen langs kanten av den øvre brønnen.
På de ønskede tidspunktene, fest prøver ved å erstatte media med 50 mikroliter 4% paraformaldehyd per brønn i 30 minutter ved romtemperatur. Vask prøvene tre ganger med 50 mikroliter PBS, eller foretrukket buffer, og fortsett for immunfluorescens eller fluorescensfarging ved bruk av 50 mikroliter per brønn og arbeidsvolumet. Mikrofluidiske enheter med et strømningsfokuserende område ble vist å produsere HA-NB mikrogeler på enten 50 eller 100 mikron i diameter.
Mediet for lyofilisering av mikrogelene ble optimalisert for å minimere kryogeldannelse ved bruk av 70% etanol. Imidlertid kan andre medier, som isopropylalkohol, vann og acetonitril, brukes om hverandre for å lette kryogeldannelsen. For å lette bio-ortogonal sammenkobling av HA-NB mikrogeler ble en lineær HA-tetrazin tverrbinding syntetisert.
Proton NMR-spektroskopi viser en vellykket modifisering av 11% av HA-repetisjonsenhetene med en tetrazinanhengsgruppe. Det tørkede lyofiliserte mikrogelproduktet ble rehydrert med spesielle volumer og glødet for å oppnå forskjellige vektprosentformuleringer av mikrogeler i MAP-stillaser. Disse vektprosentene av mikrogeler i MAP-stillas korresponderte med unike partikkelfraksjoner.
Cellekultur i MAP-stillaser er vist her. Celler i 3D-kultur i MAP-stillas ble fikset på dag fem, farget og avbildet på et konfokalt mikroskop. Enkle Z-skiver viser forskjeller i cellevekst og stillaser som består av forskjellig vektprosent MAP.
Velg ditt lyofiliseringsmedium på riktig måte, avhengig av om du vil ha kryogeler eller ikke. Ikke hopp over inkubasjonstrinn, slik at mikrogelene dine har tilstrekkelig tid til å hovne opp i media. Standardteknikker som mikroskopi, flowcytometri, RNA-sekvensering med mer kan brukes til å vurdere celleresponser innenfor disse granulære materialene med definerte porøsiteter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
