انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الأسطورة يسمح للكشف حساسة للتفاعلات عابرة ومستقرة بين البروتينات التي يتم التعبير عنها في البيرة الكائن السكيراء النموذج. وقد تم تطبيقه بنجاح لدراسة خارجية والخميرة بروتينات الغشاء لا يتجزأ من أجل تحديد شركائهم التفاعل بطريقة إنتاجية عالية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Snider, J., Kittanakom, S., Curak, J., Stagljar, I. Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (36), e1698, doi:10.3791/1698 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

دفعت الأهمية الأساسية والسريرية البيولوجي للبروتينات الغشاء لا يتجزأ من تطوير نظام الخميرة المستندة لتحديد إنتاجية عالية من البروتين البروتين التفاعلات (PPI) لبروتينات عبر الغشاء كامل طول. تحقيقا لهذه الغاية ، وضعت في مختبرنا تقسيم اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام. تسمح هذه التكنولوجيا للكشف عن البروتين حساس للتفاعلات عابرة ومستقرة به

Protocol

1. معلومات أساسية

البروتين البروتين التفاعلات (PPIS) هي كتل البناء الأساسية التي تنظم المشاركة في جميع العمليات الخلوية. وبالتالي ، فمن الضروري أن يتم تنظيم جميع التفاعلات بإحكام من أجل الحفاظ على التوازن الخلوية ، وتحولا في هذا التوازن البيولوجي يلعب عادة دورا في مرض السرطان وتحول الخلية. غشاء البروتينات المرتبطة بها بين صفوف الطبقة الأكثر أهمية من الناحية البيولوجية من البروتينات لأنها يمكن أن تبدأ مجمع شلالات الإشارات ، والتوسط في كل من الواردات والصادرات من الجزيئات المختلفة ، بما في ذلك المخدرات ، التي كانت ذات أهمية الأخيرة في ميدان الرعاية الصحية والمشاكل المتصلة أصبحت مقاومة العقاقير شائعة بشكل متزايد. اكتساب نظرة ثاقبة لتعقيد هذه الفئة البروتين يتطلب تحديد شركائهم التفاعل. اكتشاف هؤلاء الشركاء أثبتت تحديا ، وغالبا ما تتطلب الظروف القاسية التي يجب أن يكون الأمثل لكل بروتين الغشاء المتجهة [1].

دفعت الأهمية الأساسية والسريرية البيولوجي للبروتينات الغشاء لا يتجزأ من تطوير نظام الخميرة المستندة لتحديد سرعة عالية من البروتينات عبر الغشاء مؤشر أسعار المنتجين لكامل طول. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير تقسيم اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام [2-4]. تسمح هذه الأداة للكشف عن البروتين حساس للتفاعلات عابرة ومستقرة. وقد تم تطبيقه بنجاح لدراسة البروتينات الخارجية والداخلية التي أعرب عنها في البيرة الكائن السكيراء نموذج [3-7]. الأسطورة يستفيد من الملاحظة التي يمكن فصلها إلى قسمين اليوبيكويتين شاردات : النصف C - محطة (سي يو بي) والنصف N - الطرفي (النوبي) في الدراسات المجراة أظهرت أن هذه الأنصاف إعادة تلقائيا نظرا لتقارب العالية ل واحد آخر (Figure. 1A) ومع ذلك ، تقدم نظاما آيسولوسين 13 إلى الطفرة جليكاين نقطة في النصف النهائي للN - اليوبيكويتين (إنتاج جزء يشار إلى G UB N) يمنع هذا عفوية إعادة تكوين الجمعيات [8] (Figure. 1B).

نستخدم هذا المبدأ في النظام الأسطورة (Figure. 1C و 2). باختصار ، هو تنصهر الطعم الغشاء لا يتجزأ من البروتين إلى شاردة UB C الذي يرتبط عامل النسخ الاصطناعية تتكون من الحمض النووي القولونية ملزم به lexa البروتين والمجال تفعيل VP16 من فيروس الهربس البسيط. يتم إنشاؤها بواسطة الانصهار يفترس شظايا الحمض النووي [كدنا] أو مشتقة الجينومية لشاردة NubG. التفاعل بين الطعم والبروتينات فريسة في مضيف الخميرة يؤدي إلى إعادة تشكيل جزيء كامل طول "الزائفة اليوبيكويتين ، مع الاعتراف اللاحقة التي عصاري خلوي الانزيمات deubiquitinating (يصف) والافراج عن بروتين عامل النسخ. يمكن للعامل النسخ ثم أدخل نواة الخلية ، وتفعيل نظام الجينات مراسل (والتي تشمل عادة التعبير عن HIS3 ، lacZ ADE2 والجينات) السماح للنمو سلالات الخميرة على وسائل الإعلام انتقائية ، مما يدل على الطعم والتفاعل فريسة [ 2-4].

وتحديد وتوصيف التفاعلات لا يتجزأ من البروتين غشاء توفير المعلومات للمساعدة في فهم وظيفتها بشكل كامل. ونحن نفهم أكثر دقة وشرح دور كل من البروتينات التي تتفاعل مع بروتينات الغشاء لا يتجزأ ، ونحن قد التبصر في التفاعل الحيوي تشارك في تنظيم هذه البروتينات واكتشاف أهداف الرواية التي قد تنطوي على إمكانات علاجية.

2. اختيار بيت وملائمة النظام الأسطورة

  1. قبل إجراء تحليل الأسطورة ، تحقق من أن البروتين الخاص به وN - و / أو C - محطة في العصارة الخلوية للخلية. فمن الضروري أن تنصهر في UB - VP16 - C به lexa سمة من البروتين الخاص بك في محطة من هذا القبيل ، لأن تقع على الانزيمات اللازمة لإطلاق سراح deubiquitinating عامل النسخ في العصارة الخلوية [4].
  2. المقبل ، أن يقرر أي من الخيارين من الخرافة الكبرى هي مناسبة. الخميرة للبروتينات غير أصلية ، فلا يجوز استخدام الأسطورة التقليدية (tMYTH) ، حيث يتم overexpressed الطعم ectopically من البلازميد. للبروتينات الخميرة الأم ، الأسطورة المتكاملة (iMYTH) هو الأسلوب المفضل. في iMYTH المفتاحية هي التطور الطبيعي الطعم مع العلامة UB - C به lexa - VP16 وتركهم تحت سيطرة المروج وطنهم. هذا هو مفيد ، كما على مستوى التعبير البرية من نوع من الطعم السام يساعد في القضاء على المشاكل المرتبطة overexpression البروتين ، مثل زيادة عدد ايجابيات كاذبة [3]. مع استثناء من البناء الأولية والطعم وسائل الإعلام الانتقائي المستخدمة ، ونفذ كل أشكال الأسطورة بها بطريقة مماثلة في جوهرها. لوضوح ، سنركز بشكل أساسي على استخدام tMYTH في هذا التقرير ، كما يمكن ، وهذا البديل من حيث المبدأ ، يمكن استخدامه مع بروتينات غشاء من أي كائن حي تقريبا ووبالتالي ينطبق على نطاق أوسع.

3. انشاء الطعم والتحقق من صحة

  1. مطلوب وسائل الإعلام وحلول
    1. DDH العقيمة 2 O أعدتها التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    2. 3 - 1 - الأمينية ،2،4 triazole - (3 - AT) حل أعدت كحل الأسهم 1M في DDH 2 O. تعقيم قبل المرور عبر فلتر ميكرون 0.2.
    3. وسائط النمو YPAD تتكون من 1 ٪ مستخلص الخميرة ث / ت ، 2 ٪ ث / ت ببتون ، 2 ٪ الجلوكوز ث / V و 100 ميكرومتر الأدينين أعد في DDH 2 O. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    4. 10X الأحماض الأمينية / النكليوتيد ميكس قاعدة : ويحتوي على مزيج كاملة أديناين 1.0 ملم ، 1.8 يوراسيل ملم ، 1.0 ملم ارجينين ، الحامض الأميني 1.0 ملم و 2.3 ملم آيسولوسين ، 7.6 ملي مول ليسين ، ليسين 1.6 مم ، 10.1 ملي الميثيونين ، 3.0 ملي فينيلالاناين ، 16.8 ملم ثريونين ، 2.0 ملي تريبتوفان ، و 1.7 و 12.8 ملي التيروسين حمض أميني أساسي مم ، أعد في DDH 2 O. عن التسرب حذفت حمض الأمينية الضرورية (ق) و / أو قاعدة النوكليوتيدات (ق). تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    5. الاصطناعية التسرب (SD) وسائط النمو التي تتكون من 0.67 ٪ W / V قاعدة النيتروجين الخميرة (بدون الأحماض الأمينية ولكن مع كبريتات الأمونيوم) ، و 2 ٪ ث / ت الجلوكوز ، 2 ٪ ث / ت آغار و1X حمض أميني ميكس / النوكليوتيدات ، أعد في DDH 2 O. إعداد السائلة والصلبة (التي تحتوي على 2 ٪ آغار) SD - يسين وسائل الإعلام. أيضا بإعداد الصلبة SD - تريبتوفان ، ليسين وسائل الإعلام SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين - الحامض الأميني. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة. صب سائل الاعلام الصلبة في أطباق بتري 100x15 ملم.
    6. الاصطناعية التسرب (SD) نمو وسائل الإعلام المتضمن 3 - AT. تحضير SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين الحامض الأميني وسائل الإعلام ، كما هو موضح ، ولكن تحتوي على 3 - AT بتركيزات 25 ، 75 ، 50 و 100 ملم. إضافة كمية مناسبة من 3 - AT من محلول المخزون العقيمة 1M إلى وسائل الإعلام بعد أن تم تعقيمها ذلك وتبريده (ولكن لم توطد بعد). تصب في أطباق بتري 100x15 ملم.
    7. PEG / ليثيوم ميكس خلات تتكون من 40 ٪ ث / ت PEG - 3350 ، و 120 ملي خلات ليثيوم و 167 ميكروغرام / مل الحمض النووي الحيوانات المنوية سالمون (نوع ملح الصوديوم الثالث) التي أعدت في DDH 2 O. لضمان عقم إعداد هذا الخليط من مياه معقمة والحلول (أي 50 ٪ تعقيمها PEG - 3350 ، تعقيمها 1M خلات ليثيوم والحيوانات المنوية 2 سالمون ملغ / مل DNA النوع الثالث ملح الصوديوم أعد العقيمة DDH O 2).
    8. الانزيم والكواشف لإجراء PCR.
    9. miniprep التجارية عدة.
    10. الخرز الزجاجي الصودا الجير (0.5 ملم).
    11. الخلايا المختصة القولونية مناسبة لتكاثر البلازميد (مثل DH5α ، XL10 الذهب) وسائل الاعلام القياسية مناسبة لتكاثر البكتيريا واختيار البلازميد.
    12. سلالات الخميرة محددة ، البلازميدات والاشعال كما هو موضح في البروتوكول.
  2. جيل من الطعوم tMYTH بواسطة إصلاح جاب
    1. يجب أن تكون مستنسخة الطعم متجه الى مناسبة لوضع العلامات والتعبير. مجموعة متنوعة من ناقلات tMYTH متاحة حاليا للاستخدام في البناء الطعم. نواقل مثل pCMBV4 ، وpAMBV4 pTMBV4 سماح ببناء C - عضال الطعم الموسومة (الطعم - C - UB - VP16 به lexa) تحت سيطرة CYC1 (ضعيف) ، ADH1 (قوية) وTEF1 المروجين (قوية جدا) ، على التوالي . يمكن أن تتولد الطعم N - عضال الموسومة (به lexa VP16 - C - UB - بيت) باستخدام نواقل مثل pTLB - 1 و N - pBT3 ، تحت سيطرة والمروجين TEF1 CYC1 ، على التوالي. الخيار متجه يعتمد على الطعم ويجب أن يتحدد تجريبيا. في بعض الحالات أعلى التعبير الطعم هو ضروري من أجل الكشف عن التفاعلات ، بينما في الأخرى overexpression الطعم الحالات قد يكون فعلا ضارا ، مما يؤدي إلى زيادة عدد ايجابيات كاذبة.
    2. تقييد هضم البلازميد المحدد في موقع التقييد المناسب (ق). وينبغي أن يحدث الانقسام الوحيد في المنطقة المجاورة مباشرة للعلامة UB - VP16 به lexa - C (من المنبع شعارا لمحطة سي علامات أو المتلقين لN - محطة علامات). على سبيل المثال ، عند استخدام ناقلات pAMBV4 ، SfiI هو الاختيار المثالي. تخزين البلازميد هضمها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
    3. الاشعال تصميم لالتضخيم ، واستنساخ الجينات في المصالح. 5 'يجب ان تنتهي من التمهيدي إلى الأمام نحو المباراة 35-40 النيوكليوتيدات المنبع للموقع قيود ، في حين أن 3' نهاية المباراة يجب أن أول 18-20 النيوكليوتيدات من الجين المستهدف. 5 'يجب نهاية المباراة عكس التمهيدي تكملة عكس ما يقرب من 35-40 النيوكليوتيدات المصب من موقع التقييد ، مع 3' نهاية مطابقة تكمل عكس 18-20 النيوكليوتيدات الأخير من هذا الجين الهدف (وقف إهمال رامزة إذا كان C - UB - VP به lexaويجري وضع علامة في 16 محطة - C). اعتمادا على ما إذا كانت أو N - C - طرفية يتم تنفيذ العلامات ، حدد النيوكليوتيدات 35-40 التمهيدي من الامام او الى الوراء بحيث يتم استنساخ الجينات المستهدفة في الإطار مع العلامة UB - C به lexa - VP16.
    4. تضخيم الجين الاهتمام من جانب PCR باستخدام بادئات أعلاه. سوف المعلمات PCR يعتمد على انزيم معين والاشعال المحددة المستخدمة.
    5. تحويل منتج PCR مع البلازميد هضمها الى سلالة الخميرة معمل المناسبة تحمل طفرة leu2 (مثل BY4741). ويمكن استخدام سلالة مراسل الأسطورة (على سبيل المثال أو THY.AP4 L40) ولكن ليس من الضروري ، كما أن الغرض من الخميرة في هذه المرحلة هو ببساطة لتكون بمثابة بيئة يمكن فيها إصلاح الفجوة مثلي التوحد يمكن أن يحدث. ينبغي أن يتم التحول على النحو التالي :
      1. تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة الخميرة الخاص المحدد في 5 مل من وسائل الإعلام YPAD معقمة واحتضان ليلا 30 درجة مئوية مع الهز المستمر (200 دورة في الدقيقة).
      2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها الى 50 مل من وسائل الإعلام YPAD جديدة لOD600 من 0.15 ~ واحتضان مع اهتزاز في 30 (200 دورة في الدقيقة) درجة مئوية. تنمو لحوالي 3-4 ساعات حتى يتم التوصل إلى OD600 من ~ 0.6.
      3. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا 700xg لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
      4. Resuspend بيليه في الخلية في 25 مل العقيمة O 2 DDH والطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق.
      5. إزالة وطاف resuspend الكرية خلية في 1 مل العقيمة O. 2 DDH
      6. إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا ، و 300 ميكرولتر مزيج خلات PEG / ليثيوم ، ويهضم البلازميد (50 fmol) وPCR المنتج (250-500 fmol) إلى أنبوب microfuge.
      7. في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      8. الصدمة الحرارية على 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      9. الطرد المركزي في 3000xg لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
      10. Resuspend بيليه في الخلية في 200 ميكرولتر العقيمة O 2 DDH ولوحة وحدة التخزين بالكامل على وسائل الاعلام الصلبة SD - يسين ، انتقائية. تنمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
      11. يكبر مستعمرة واحدة من سلالة تحولت وسائل الإعلام في 5 SD - يسين مل السائل عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
      12. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا 700xg لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
      13. عزل DNA البلازميد الطعم من الكريات الخلايا باستخدام أي مجموعة miniprep التجارية. اتباع بروتوكول قياسي مع واحد التعديل. من أجل ضمان ما يكفي من تحلل خلايا الخميرة ، إضافة إلى صغر حجم 0.5 ملم الزجاج الخرز الصودا الجير لبيليه بعد إعادة تعليق دوامة الأولية وبقوة لمدة 5 دقائق. ثم المضي قدما في البروتوكول التجاري كالمعتاد.
      14. تحويل الحمض النووي معزولة الخميرة إلى E. المختصة القولونية سلالة مناسبة لتكاثر البلازميد (مثل DH5α ، XL10 الذهب) مع كفاءة تحويل ما لا يقل عن 7 خلايا 1x10 / DNA ميكروغرام. لاحظ أنه يمكن تحديد البلازميدات الطعم لاستخدام الكانامايسين.
      15. DNA البلازميد الحصاد من E. حولت القولونية باستخدام الطريقة المعيارية عزل الحمض النووي أو عدة التجارية.
      16. البناء السليم للتحقق من الطعم البلازميد بواسطة التسلسل.
      17. تحويل الطعم التحقق من بناء الى سلالة الأسطورة مراسل المناسب (على سبيل المثال THY.AP4 ، L40). ويمكن استخدام بروتوكول تحول الخميرة وصفه للتو ، استبدال الحمض النووي البلازميد في الطعم بدلا من المنتج وهضمها البلازميد PCR.
  3. التحقق من صحة الطعم -- الترجمة الصحيحة
    1. قبل استعمالها ، ويتم تحليل سلالات الطعم لضمان أن يتم ترجمة بشكل صحيح أنهم لغشاء الخميرة. عند استخدام iMYTH ، وسوف تعتمد هذه الترجمة على وجه التحديد خصائص الطعم المفتاحية. لtMYTH ، البلازميدات الطعم عامة تشمل تسلسل إشارة (مثل Matα) توجيه البروتين وأعربت لغشاء البلازما. يتم تحديد توطين باستخدام المجهر مضان. إدراج جزيء YFP في الطعم تسلسل علامة (أي C - UB - YFP به lexa - VP16) هو نهج أبسط وأكثر مباشرة ، مما يتيح رؤية مباشرة من الخلايا الحية ، ويستخدم عادة في iMYTH. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نهج موحد المناعي باستخدام أجسام مضادة ضد به lexa أو VP16 مكونات العلامة.
  4. التحقق من صحة الطعم -- N UB G / I التحكم اختبار
    1. وقد أنشئت التوطين السليم للمرة الطعم ، فمن الضروري للتأكد من أن الطعم لا تفعيل نظام مراسل وحدها أو في وجود عدم التفاعل يفترس (أي التحقق من أن الطعم لم يتم تفعيل الذات). ويتم إنجاز هذا باستخدام UB N G / اختبار الأول ، حيث يتم تحويل التفاعل مع الطعم (إيجابي) وعدم التفاعل يفترس التحكم (السلبية) ، ويتم تقييم النمو على وسائط انتقائية. يجب أن يكون الطعم تنمو على وسائل الاعلام الانتقائية طن وجود مراقبة إيجابية ، وليس تنمو في وجود الرقابة السلبية ، من أجل أن تكون مناسبة للاستخدام في الأسطورة.
    2. تبدأ من خلال تحويل سلالة الطعم لفحصها مع 100-200 نانوغرام الجارحة السيطرة البلازميد. ويمكن استخدام هذا التحول الخميرة التي سبق وصفها البروتوكول ، استبدال SD - يسين وسائل الإعلام في مكان وYPAD باستخدام SD - تريبتوفان ، ليسين وسائل الإعلام للخطوة الطلاء النهائية. الفريسة التحكم التالية يبني يشيع استخدامها :
      1. pOST1 UB - N الأول (مراقبة إيجابية)
      2. pOST1 UB - N G (التحكم السلبية)
      3. pFUR4 UB - N الأول (مراقبة إيجابية)
      4. pFUR4 UB - N G (التحكم السلبية)
    3. OST1 هو مكون من مجمع oligosaccharyl والمترجمة إلى غشاء شبكية هيولي باطني [9] بينما هو FUR4 بيرمياز اليوراسيل والمترجمة إلى غشاء البلازما [10]. على الرغم من أن هذه البروتينات عادة ما تكون خيارنا الاول لاستخدامها كعامل غير المتفاعلة يفترس ، ومدى ملاءمتها تختلف على أساس كل حالة على حدة. في حال غير المرجح أن توقع الطعم الخاص للتفاعل حقيقي مع كل من هذه الضوابط ، وسوف يفترس البديلة تحتاج إلى تحديد. نذكر بأن N UB أنا هو شكل من النوع البري من محطة - N من اليوبيكويتين ، ويتفاعل تلقائيا مع C UB مستقلة عن تفاعل بين البروتينات التي تنصهر في وUB UB C N. وبالتالي لا يوجد UB يفترس أنا تشكل الضوابط الإيجابية ، في حين أن يفترس UB N G (تحمل آيسولوسين 13 إلى الطفرة جليكاين الذي يمنع الجمعيات من العفوية وUB UB N C) بمثابة الضوابط سلبية.
    4. Resuspend المستعمرات واحد من كل الطعم تتحول إلى 100 ​​ميكرولتر العقيمة O. 2 DDH
    5. مخفف تسلسليا الخلايا معلق في DDH العقيمة O 2 لإنتاج التخفيفات من 10 / 1 ، 1 / 100 و 1 / 1000.
    6. البقعة 5 مجلدات ميكرولتر من الخلايا غير مخفف والمخفض على تريبتوفان - SD - يسين وسائل الإعلام SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين - الحامض الأميني مع وبدون AT - 3 في طائفة من التركيزات. 3 - AT بمثابة مثبط تنافسية من الجين مراسل HIS3 ، ويعمل على زيادة التشدد في عملية الاختيار. يمكن أن تكون مفيدة في بعض الحالات لتثبيط نمو غير محددة وضعيفة من الطعم الذاتي لتفعيل معتدل.
    7. السماح للبقع لتجف ثم احتضان لوحات على 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
    8. ينبغي لجميع transformants تنمو على لوحات SD - تريبتوفان ، ليسين ، مشيرا إلى أنه تم تحويلها بنجاح مع أنهم فريسة البلازميد. الطعم الذي لا سوف الذاتي تنشيط النمو على تريبتوفان - SD - يسين الأدنين ، الحامض الأميني وسائل الإعلام إلا عندما تتحول مع UB N أنا فريسة يبني ، وليس مع G N يفترس UB. لاحظ ما تركيز 3 - AT هو مطلوب في وسائل الإعلام (إن وجدت) حيث سيؤدي ذلك إلى الحاجة لاستخدامها أثناء الفرز.

4. غربلة

  1. مطلوب وسائل الإعلام وحلول
    1. DDH العقيمة 2 O أعدتها التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    2. محلول كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ أعدت في DDH 2 O وتعقيمها بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    3. محلول فوسفات الصوديوم التي تتكون من 493 ملي الفوسفات ثنائي القاعدة الصوديوم وفوسفات الصوديوم أحادي القاعدة 250 مم في DDH 2 O. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    4. X - غال (5 - 4 - برومو كلورو - 3 - indolyl - β - D - galactopyranoside) محلول أعد بمثابة ملغ / 100 مل محلول المخزون في N ، N - ثنائي ميثيل formamide.
    5. وسائط النمو 2xYPAD تحتوي على 2 ٪ مستخلص الخميرة ث / ت ، ث 4 ٪ / V ببتون ، و 4 ٪ ث / ت 100 ميكرومتر الجلوكوز والأدنين ، الذي أعد في DDH 2 O. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    6. التسرب الاصطناعية (SD) وسائط النمو ، الذي أعد كما هو موضح سابقا. تحضير السائل SD - يسين والصلبة SD - تريبتوفان يسين. صب سائل الاعلام الصلبة في كل من أطباق بتري 100x15 ملم. إعداد الصلبة SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين - الحامض الأميني وسائل الإعلام في لوحات جولة 150 مم ، و 16 لوحات لكل الشاشة ، وتحتوي على 3 - AT ، إذا لزم الأمر ، في تحديد من تركيز G UB N / I اختبار السيطرة.
    7. التسرب الاصطناعية (SD) وسائل الاعلام + 5 - 4 - برومو كلورو - 3 - Indoyl - β - D - Galactopyranoside (X - غال). تحضير - SD - تريبتوفان يسين الأدنين ، الحامض الأميني وسائل الإعلام التي تحتوي على أجار كما هو موضح سابقا. بعد التعقيم ، والسماح لتبرد ، تضاف 3 - AT (إذا لزم الأمر) ، يليه س حجم 1/10thو فوسفات الصوديوم العقيمة الحل. المقبل ، إضافة X - غال الحل النهائي لتركيز 80 ميكروغرام / مل. المزيج جيدا وتصب في لوحات جولة 150 ملم.
    8. PEG / خلات ليثيوم الثاني محلول يحتوي على 40 ٪ PEG - 3350 ، 100 خلات ليثيوم ملم ، 1 ملم و 10 ملم EDTA تريس الرقم الهيدروجيني 7.5. يعد هذا الحل باستخدام العقيمة DDH 2 O وحلول (على سبيل المثال 50 ٪ تعقيمها PEG - 3350 (1) ، خلات ليثيوم م ، و 100 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 500 ملم EDTA 8.0 درجة الحموضة).
    9. خلات ليثيوم / تريس EDTA محلول يحتوي على 110 خلات ليثيوم ملم ، 11 ملم تريس درجة الحموضة 7.5 و 1.1 ملي EDTA. يعد هذا الحل باستخدام العقيمة DDH 2 O وحلول (مثل خلات ليثيوم 1M تعقيمها ، 100 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 500 ملم EDTA 8.0 درجة الحموضة).
    10. 10X الحل EDTA تريس يتألف من 100 درجة الحموضة 7.5 ملي تريس و 10 ملي EDTA أعد في DDH 2 O. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية ، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
    11. احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الناقل (ssDNA) محلول يحتوي على 2 ملغ / مل الحمض النووي الحيوانات المنوية سالمون النوع الثالث ملح الصوديوم ، الذي أعد ومعقمة O. 2 DDH
    12. miniprep التجارية عدة.
    13. الخرز الزجاجي الصودا الجير (0.5 ملم).
    14. الخلايا المختصة القولونية مناسبة لتكاثر البلازميد (مثل DH5α ، XL10 الذهب) وسائل الاعلام القياسية مناسبة لتكاثر البكتيريا واختيار البلازميد.
    15. سلالات الخميرة محددة والبلازميدات كما هو موضح في بروتوكول
  2. تحويل نطاق واسع
    1. تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة الأسطورة مراسل تحتوي على الطعم الخاص في 5 مل من SD - يسين وسائل الإعلام واحتضان بين عشية وضحاها في 30 مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) درجة مئوية.
    2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى وسائل الإعلام SD - 200 مل ليسين OD600 = 0.15 و احتضان عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة). = 0.6 تنمو حتى OD600 -- 0.7 (حوالي 4-5 ساعات).
    3. قبل وقت قصير من الوصول إلى الهدف OD600 ، أذاب an قسامة من حل ssDNA. يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبرد على الجليد. أكرر مرة واحدة.
    4. عندما تم التوصل إلى هذا الهدف OD600 ، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق (تقسيم الثقافة مل 200 مل بين أنابيب الطرد المركزي 4x50 المسمار الحد الأقصى).
    5. يغسل كل بيليه مع 30 مل العقيمة O 2 DDH ودوامة لفترة وجيزة العينة. الطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق.
    6. تجاهل وطاف resuspend كل بيليه في 1 مل خلات ليثيوم / تريس حل EDTA. نقل إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microfuge والطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق.
    7. تجاهل وطاف resuspend كل بيليه في 600 ميليلتر من خلات ليثيوم / تريس حل EDTA.
    8. إضافة إلى ما يلي مل أنابيب الطرد المركزي 4x15 المسمار الحد الأقصى :
      1. 2.5 مل PEG / خلات ليثيوم الحل الثاني
      2. 600 معلق الخلايا ميكرولتر
      3. 100 ميكرولتر حل ssDNA
      4. 7 ميكروغرام من الحمض النووي مكتبة فريسة
    9. المكتبات التي تحتوي على يفترس المفتاحية في إما أو محطة N - C - N مع يو بي جي ، وأعدت من مجموعة متنوعة من المصادر [كدنا] أو الجينوم ، متوفرة تجاريا ( www.dualsystems.com ). يجب تحديد مكتبة معينة تستخدم على أساس كل حالة على حدة ، يعتمد على تحديد الطعم وأهداف تجريبية.
    10. دوامة الأنابيب لمدة 1 دقيقة لضمان خلط دقيق ومن ثم في احتضان بالحمام المائي 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. مزيج لفترة وجيزة كل 15 دقيقة.
    11. إضافة 160 سلفوكسيد ثنائي ميثيل ميكرولتر (DMSO) لكل أنبوب وأنابيب المزيج فورا على عكس.
    12. في احتضان بالحمام المائي 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    13. جمع transformants بواسطة الطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق.
    14. تجاهل طاف. استرداد transformants بواسطة إعادة تعليق كل بيليه في 2xYPAD مل 3. تجمع معا في جميع العينات واحد 50 مل أنبوب الطرد المركزي برغي الغطاء.
    15. في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتحقيق الانتعاش الخلية.
    16. الطرد المركزي في 700xg لمدة 5 دقائق ، وتجاهل طاف.
    17. Resuspend الكريات الخلايا في 4.9 مل من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.9 ٪.
    18. استخدام 100 ميكرولتر من معلق الخلايا إعداد 10 أضعاف التخفيفات التسلسلي في العقيمة كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ لتتراوح بين 10X 1000x.
    19. لوحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 100X و1000x على تريبتوفان - SD - يسين وسائل الإعلام واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. هذه اللوحات بمثابة السيطرة ويتم استخدامها لحساب كفاءة التحول.
    20. الفجوة المتبقية بالتساوي 4.8 مل من الخلايا ومعلق على لوحة كبيرة لوحات - SD - تريبتوفان يسين الأدنين ، الحامض الأميني (150 ملم) ،تحتوي على الكمية الضرورية من AT - 3 كما هو محدد في مجموعة UB N / الاختبار الأول ، واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
    21. Resuspend المستعمرات واحد (كل الخلايا التي تحتوي على ما يمثل إمكانات التفاعل الطعم والفريسة الزوج) في 100 ميليلتر من 0.9 ٪ وكلوريد الصوديوم aliquots 5 ميكرولتر على لوحة SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين - X - هيستيدين + غال وسائل الاعلام (بما في ذلك وإذا AT - 3 مطلوب). السماح لتنمو لمدة 2-4 أيام. هذه الخطوة هي بمثابة جولة ثانية من الفحص الانتقائي ، ويساعد في إزالة ايجابيات كاذبة تم الحصول عليها في الجولة الأولي. ويتم اختيار المستعمرات الوحيدة التي تعرض النمو القوي واللون الأزرق لمزيد من التحليل.
  3. فريسة العزلة الحمض النووي وتسلسلها
    1. عزل DNA البلازميد من مستعمرات الخميرة الزرقاء باستخدام بروتوكول miniprep مع التعديلات التي سبق وصفها. لا شك أن يكبر الخلايا في SD - تريبتوفان وسائل الاعلام فقط ، لتحديد من أجل الإبقاء على الفريسة ، ولكن ليس الطعم ، البلازميدات. للشاشات التي تنتج عددا كبيرا جدا من الزيارات ، قد تتوفر تجاريا عدة miniprep الإنتاجية العالية يكون من المفيد عند هذه النقطة.
    2. تحويل معزولة DNA البلازميد الخميرة إلى E. المختصة القولونية سلالة مناسبة لتكاثر البلازميد (مثل DH5α ، XL10 الذهب) مع كفاءة تحويل ما لا يقل عن 7 خلايا 1x10 / DNA ميكروغرام. لاحظ أنه يمكن تحديد البلازميدات فريسة لاستخدام الأمبيسيلين.
    3. عزل DNA البلازميد من E. حولت القولونية باستخدام الطريقة المعيارية عزل الحمض النووي أو عدة التجارية. مرة أخرى ، قد يكون عدة miniprep الإنتاجية العالية تكون مفيدة إذا كان عدد العينة كبيرة. التضخيم من الحمض النووي في E. القولونية يزيد كثيرا العائد البلازميد ويضمن قدرا كافيا من الحمض النووي موجود لكل من التسلسل ومزيد من التحليل.
    4. تسلسل البلازميدات معزولة باستخدام التمهيدي مكملة لتسلسل داخل G. UB N
    5. تجميع وتحليل كل البيانات التسلسل لتجميع قائمة أولية interactors. ويمكن القيام بذلك يدويا ، أو بطريقة مؤتمتة باستخدام البرمجيات المناسبة.
  4. الطعم اختبار التبعية
    1. بعد التجميع من القائمة الأولية للinteractors المهم لإعادة التحقق من التفاعلات والقضاء على يفترس منحل التي تتفاعل / تفعيل نظام مراسل بطريقة مستقلة عن هوية الطعم. ويتم إنجاز ذلك باستخدام اختبار التبعية بيت. في هذا الاختبار ، يتم تحويل كافة interactors المحددة مرة أخرى إلى سلالة الطعم الأصلي ، وكذلك سلالة ايواء الطعم الاصطناعي مراقبة تتكون من مجال واحد تنصهر عبر الغشاء إلى العلامة UB - C به lexa - VP16. يتم تنفيذ التحويل وفقا للبروتوكول قياسي سبق وصفها ، وذلك باستخدام SD - يسين وسائل الإعلام في مكان وYPAD SD - تريبتوفان ، ليسين وسائل الاعلام الصلبة للخطوة الطلاء النهائية.
    2. Resuspend المستعمرات واحد من التحولات المذكورة أعلاه في 100 ميليلتر من العقيمة O 2 DDH والبقعة 5 مجلدات ميكرولتر على SD - تريبتوفان ، ليسين ، أديناين - X - الحامض الأميني وسائل الاعلام غال + (بما في ذلك وAT - 3 إذا لزم الأمر). ثم يتم تحضين لوحات لمدة 2-4 أيام حتى 30 درجة مئوية. وينبغي أن يتم اختيار مثالي transformants متعددة لكل ضحية ، وينبغي رصد كل من الطعم الأصلي والطعم الاصطناعي على نفس المائدة.
    3. الخميرة التي تحمل الطعم الاصطناعي والفريسة التي تعتبر سببا في تنشيط النظام مراسل (أي النمو واللون الأزرق) منحل وإزالة هذا فريسة محددة من قائمة interactors.
    4. يفترس التي تتسبب في نمو وتلوين الأزرق في الخميرة مع بيت من الفائدة ، ولكن ليس الطعم الاصطناعي ، ويؤكد هذا التفاعل محددة. ولكن ، إذا الخميرة إيواء الفريسة والطعم الخاص في المصالح لا ينمو لا تتم إزالة هذه الفريسة من قائمة interactors.
    5. ويفترس ما تبقى تشكل قائمة كاملة interactors المحددة في الشاشة خرافة.

5. مزيد من الدراسات

بمجرد اكتمال الفرز الأسطورة ، يجب إجراء المزيد من التحليلات من أجل التحقق من صحة وتحديد الأهمية البيولوجية للتفاعلات الكشف عنها. والدراسات المحددة التي يتعين القيام بها تختلف على أساس كل حالة على حدة ، ويجب أن يحددها الباحث الفردية. بعض الأمثلة الشائعة لمتابعة العمل المشترك مناعي تشمل تجارب ودراسات في حذف الكائن الأصلي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل البيانات الحسابية التي تم الحصول عليها أن تكون مفيدة للكشف عن الأنماط ، والمساعدة في تحديد العلاقة المحتملة ودور التفاعلات المختلفة قد تلعب. وبالتالي ، فإن الأسطورة التكنولوجيا بمثابة اول خطوة قوية نحو تحديد وفهم التفاعلات الوظيفية الحرجة للبروتينات الغشاء. بالإضافة إلى دراسات المتابعة المفصلة وغيرها من الشركة المصرية للاتصالات المتقدمة والناشئة في الآونة الأخيرةchnologies ، فمن المتوقع أن تكون أداة قيمة في كشف أسرار الخلية.

الشكل 1
الشكل 1. مبدأ تقسيم أ. اليوبيكويتين قد تكون مفصولة اليوبيكويتين الى قسمين شاردات : النصف C - محطة (سي يو بي) والنصف N - الطرفية (N UB الأول). هذه الأنصاف إعادة تلقائيا بسبب تقارب العالية لآخر واحد. ب. وهناك نقطة أنا UB طفرة في الموضع 13 من آيسولوسين لجليكاين (N UB G) يمنع هذا عفوية إعادة تكوين الجمعيات. ج. في النظام الأسطورة ، هو أن تنصهر UB جيم للبيت الفائدة من (B) ، وتنصهر في فريسة لمجموعة يو بي N (A). AB التفاعل البروتين يعيد الزائفة اليوبيكويتين.

الشكل 2
الشكل 2. انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء اثنين الهجين (الأسطورة) النظام.
وتنصهر في غشاء من البروتين في المصالح (الطعم) في النصف C - محطة من الخميرة اليوبيكويتين (C UB) ، مترافق إلى عامل النسخ. باستخدام مكتبة [كدنا] أو gDNA ، هو تنصهر كل البروتين المشفرة بواسطة المكتبة (الفريسة) إلى نهاية المقابلة N - شاردة من اليوبيكويتين (N UB G). إذا البروتينات اثنين لا تتفاعل ، عامل النسخ يبقى في واجهة الغشاء (اللوحة اليسرى). ومع ذلك ، إذا كانت تتفاعل البروتينات ، والأنصاف two اليوبيكويتين الانضمام ، مما أدى إلى انشقاق بواسطة البروتياز اليوبيكويتين محددة. تشطر النشرات عامل النسخ ، مما أدى إلى التعبير عن الجينات مراسل (اللوحة اليمنى)

الشكل 3
الشكل 3. الأسطورة خط الانابيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسطورة هي أول نظام الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد من التفاعلات بين البروتينات الغشاء كامل طول وعصاري خلوي أو غشاء محدد الشركاء. وقد تم استخدامه لدراسة البروتين الغشاء من مجموعة من الكائنات [3-7]. هناك ، ومع ذلك ، والتفاصيل المحددة التي قد تحتاج إلى تمحيص لضمان البروتين من المصالح غير قابلة للدراسة مع الأسطورة.

وتوجه العديد من الغشاء المتجهة البروتينات إلى غشاء البلازما عبر تسلسل إشارة إلى أن المشقوق احقا لإنتاج البروتين ناضجة. هذا التسلسل هو كائن محددة وأنه من الممكن أن هذا التسلسل إشارة الأصلي سوف يتسبب سوء الترجمة من البروتين من الفائدة عندما أعرب في الخميرة لأن تسلسل إشارة لا يزال غير معروف. للتحايل على هذه المسألة ، ونحن المهندسة هذه البروتينات المحددة التي يتعين تنصهر لتسلسل إشارة الخميرة ، والمستمدة من التزاوج ألفا عامل (MATα). هذا التسلسل الببتيد (ما يسمى MFα - SS) إعادة يموضع البروتين في غشاء البلازما الخميرة والأهم ، هو المشقوق بواسطة peptidases إشارة الخميرة. تم العثور على هذا التسلسل في الببتيد البلازميدات pTMBV - MFα وpAMBV MFα.

مقياس آخر مهم لا بد من التأكيد عليها هي مستويات التعبير الطعم. المروج التي تقود التعبير عن الطعم ينظم هذه المعلمة. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين مستويات التعبير الطعم باستخدام اختبار NubG / النوبي ومبلغ 3 - AT اللازمة للقضاء على التحف overexpression ، حيث الطعم هو "تفعيل الذات" (أي أنه يتفاعل مع العديد من البروتينات باباحه فريسة غير محددة) . فحص البروتينات الخميرة تنتج تركيزات الطعم الأكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية عند تطبيق iMYTH. في هذه الحالة ، يتم المفتاحية هذا الجين في المصالح مع الشبل - TF داخل gDNA. بدلا من ذلك ، يمكن التعبير عن البروتينات الخارجية من pBT3 - STE والبلازميدات pCMBV التي تحمل المروج CYC1 مما أدى إلى انخفاض التعبير الطعم. وpTMBV البلازميدات وpTLB1 الميناء المروج TEF1 بينما pAMBV والمروج ADH1 ، سواء تلك العبارة محرك قوي من البروتين الطعم. إذا كانت مستويات البروتين يتطلب تحسين الطعم كذلك ، قد يكون من الضروري استخدام البلازميد pTLB - 1 الذي يحمل TEF1 المروج ، ومع ذلك ، هو المجال تحور الحمض النووي ملزم به lexa في R156G للحد تقارب نحو المروجين مراسل الجين الخارجية ، وخفض في نهاية المطاف احتمال تنشيط المصير [5].

وثمة عامل آخر يلعب دورا هاما لتحقيق النجاح هو الأسطورة مكتبة يختارها المستخدم في عملية الفرز. هذا سيعتمد على الملامح الطعم التعبير الذاتية. على سبيل المثال ، يمكن التعبير عن الطعم في أنسجة معينة ، وبالتالي فإنه من المهم استخدام المكتبة التي شيدت من هذا النسيج محددة. هذا وسوف يتم الكشف عنها من الناحية الفسيولوجية ضمان التفاعلات ذات الصلة.

النظام الأسطورة هو أداة سهلة وسريعة توفر وفرة من المعلومات حول فئة من البروتينات التي كانت صعبة للدراسة. وقد حددت هذه التفاعلات تساعد في الكشف عن وظيفة بيولوجية الكامل للبروتينات الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ايغور Stagljar هو المؤسس المشارك لبيوتك DualSystems ، سويسرا.

Acknowledgments

نود أن نشكر ادموندز الفجر لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. يتم اعتماد مختبر Stagljar من أموال من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) ، والمعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) ، ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، وجمعية السرطان الكندية ، وشركة نوفارتيس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethenlene Glycol (PEG3350) BioShop Canada PEG335
Lithium Acetate Bihydrate BioShop Canada LIA001
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) BioShop Canada XGA001
N`,N-dimethyl formamide BioShop Canada DMF 451
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) BioShop Canada ATT124
Sodium phosphate dibasic BioShop Canada SPD307
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500
Salmon Sperm DNA VWR international CA80601-120
D-Glucose BioShop Canada GLU501
LB Broth LENOX BioShop Canada LBL405
Yeast Nitrogen Base BioShop Canada YNB406
Yeast Extract BioShop Canada YEX401
Peptone BD Biosciences 211677
Bio-Tryptone BioShop Canada TRP402
Adenine Sulphate BioShop Canada ADS201
L-Uracil BioShop Canada URA241
L-Threonine BioShop Canada THR002
L-Histidine BioShop Canada HIS200
L-Methionine BioShop Canada MET222
L-Valine BioShop Canada VAL201
L-Phenylalanine BioShop Canada PHA302
L-Isoleucine BioShop Canada ISO910
L-Tyrosine BioShop Canada TYR333
L-Leucine BioShop Canada LEU222
L-Arginine BioShop Canada ARG006
L-Tryptophane Fisher Scientific BP395-100
L-Lysine BioShop Canada LYS101
L-Alanine Fisher Scientific BP369-100
Agar BioShop Canada AGR001
Soda Lime Galss Beads Biospec Products 11079105
Sodium Chloride BioShop Canada SLD002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27, (11), 559-563 (2002).
  2. Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
  3. Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26, (1), 15-25 (2007).
  4. Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (9), 5187-5192 (1998).
  5. Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7, (7), 1362-1377 (2008).
  6. Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278, (39), 37998-38003 (2003).
  7. Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13, (7), 1744-1753 (2003).
  8. Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (22), 10340-10344 (1994).
  9. Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269, (17), 12908-12917 (1994).
  10. Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2, (8), 977-984 (1982).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics