Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Biology

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Summary

MITO permette di rilevare sensibile delle interazioni transienti e stabili tra proteine ​​che sono espresse nel modello organismo Saccharomyces cerevisiae. E 'stato applicato con successo allo studio esogeni e lievito proteine ​​integrali di membrana allo scopo di individuare i propri partner che interagiscono in modo elevato throughput.

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Snider, J., Kittanakom, S., Curak, J., Stagljar, I. Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (36), e1698, doi:10.3791/1698 (2010).

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Abstract

L'importanza fondamentale biologici e clinici di proteine ​​di membrana integrali portato allo sviluppo di un lievito-based per la high-throughput identificazione di interazioni proteina-proteina (PPI) per la full-length proteine ​​transmembrana. A tal fine, il nostro laboratorio ha sviluppato il split-ubiquitina lievito base a membrana a due ibridi (MITO) del sistema. Questa tecnologia consente per la rilevazione delle interazioni proteina sensibile transitoria e stabile con

Protocol

1. Informazioni di base

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono i mattoni fondamentali coinvolti nel governare tutti i processi cellulari. Di conseguenza, è essenziale che tutte le interazioni sono strettamente regolati per mantenere l'omeostasi cellulare, come un cambiamento di questo equilibrio biologico gioca spesso un ruolo nella malattia e la trasformazione delle cellule tumorali. Proteine ​​di membrana associati sono tra la classe più importante di proteine ​​biologicamente in quanto possono avviare complesse cascate di segnalazione, e mediare sia l'importazione e l'esportazione di varie molecole, tra cui i farmaci, che è stato di importanza recenti nel campo dell'assistenza sanitaria, come problemi legati alla resistenza ai farmaci sono diventati sempre più comuni. Conoscere meglio la complessità di questa classe di proteine ​​richiede l'identificazione dei loro partner interagenti. Alla scoperta di partner quali si è dimostrato impegnativo, come spesso richiede condizioni difficili che deve essere ottimizzato per ogni proteina legata alla membrana [1].

L'importanza fondamentale biologici e clinici di proteine ​​di membrana integrali portato allo sviluppo di un lievito-based per la high-throughput identificazione dei PPI per il full-length proteine ​​transmembrana. A tal fine, abbiamo sviluppato la divisione ubiquitina-Membrane a base di lievito Two-Hybrid (MITO) sistema [2-4]. Questo strumento consente sensibili per la rilevazione delle interazioni proteina transitoria e stabile. E 'stato applicato con successo per studiare le proteine ​​esogene ed endogene espresse nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae [3-7]. MITO sfrutta l'osservazione che ubiquitina possono essere separati in due frazioni:. C-terminale (C ub) e l'N-terminale (nubi), studi in vivo hanno dimostrato che queste frazioni di ricostituire spontaneamente a causa della loro elevata affinità per un altro (Figure. 1a). Tuttavia, l'introduzione di un isoleucina 13 al punto mutazione glicina N-terminale dell'ubiquitina (producendo un frammento denominato N ub G) impedisce questa spontanea ri-associazione [8] (1b Figure.).

Usiamo questo principio nel sistema di MITO (Figure. 1c e 2). In breve, l'integrale proteina esca membrana è fuso con un residuo di C ub che è legata ad un fattore di trascrizione artificiale costituito dalla Escherichia coli DNA-binding protein Lexa e il dominio di attivazione di VP16 da virus herpes simplex. Prede sono generati dalla fusione di frammenti di DNA genomico o cDNA derivati ​​alla frazione NubG. Un'interazione tra esca e proteine ​​preda in un ospite di lievito porta alla ricostituzione di un full-length molecola 'pseudo-ubiquitina', con successivo riconoscimento da parte degli enzimi citosolici deubiquitinating (DUBS) e rilasciare proteolitica del fattore di trascrizione. Il fattore di trascrizione può quindi entrare nel nucleo della cellula, e attivare un sistema di gene reporter (tipicamente coinvolgono espressione della HIS3, lacZ e geni ADE2) che permette la crescita di ceppi di lieviti su terreni selettivi, il che è indicativo di esche e di interazione preda [ 2-4].

L'identificazione e la caratterizzazione delle interazioni proteina di membrana integrale fornirà informazioni utili per comprendere appieno la loro funzione. Come abbiamo più precisamente capire e analizzare il ruolo delle proteine ​​che interagiscono con le proteine ​​integrali di membrana, e giungeremo alla comprensione dell'interazione dinamica coinvolta nella regolazione queste proteine ​​e scoprire nuovi obiettivi che possono avere un potenziale terapeutico.

2. Selezione di Bait e System MITO appropriate

  1. Prima di condurre analisi MITO, verificare che la proteina ha il suo N-e / o C-terminale nel citoplasma della cellula. E 'essenziale che l'UB-Lexa-VP16 C tag essere fusi per la vostra proteina in un capolinea, dal momento che gli enzimi necessari per il rilascio deubiquitinating fattore di trascrizione si trovano nel citosol [4].
  2. Poi, decidere quale delle due varianti principali di MITO è adatto. Per i non-nativi delle proteine ​​del lievito, MITO tradizionali (tMYTH) possono essere utilizzati, in cui le esche sono sovraespressione ectopica da un plasmide. Per le proteine ​​del lievito madre, MITO integrato (iMYTH) è il metodo di scelta. In iMYTH esche sono endogenamente taggati con la UB-Lexa-VP16 tag C, lasciandoli sotto il controllo del loro promotore nativo. Questo è vantaggioso, come wild-type livello di espressione di esche aiuta a eliminare i problemi associati con l'iperespressione delle proteine, come ad esempio un maggior numero di falsi positivi [3]. Con l'eccezione della costruzione esca iniziale e dei media selettivi utilizzati, entrambe le forme di MITO sono svolte in maniera sostanzialmente identica. Per chiarezza, ci concentreremo principalmente sull'uso di tMYTH in questo rapporto, come questa variante può, in linea di principio, essere utilizzati con proteine ​​di membrana da qualsiasi organismo ed èquindi più ampiamente applicabile.

3. Esca Generazione e Validazione

  1. Supporti necessari e soluzioni
    1. Sterili DDH 2 O preparato in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    2. 3-ammino-1 ,2,4-triazolo (3-AT) soluzione preparata come soluzione stock 1M in DDH 2 O. Sterilizzare il passaggio attraverso un filtro 0,2 micron.
    3. La crescita media YPAD costituito da 1% w / v estratto di lievito, 2% w / v peptone, 2% w / v di glucosio e 100 mM adenina preparata in DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    4. 10x Amino Acid / Mix Nucleotide Base: Il mix completo contiene 1,0 mM Adenina, Uracile 1,8 mm, 1,0 mm Arginina, Istidina 1,0 mM, 2.3 mM Isoleucina, Leucina 7,6 mm, 1,6 mm lisina, metionina 10,1 mm, 3,0 mm fenilalanina, 16,8 mm Treonina, Triptofano 2,0 mm, 1,7 mM Tirosina e Valina 12,8 mM, preparata in DDH 2 O. Per i drop-out omettere la necessaria amino acido (s) e / o la base nucleotidica (s). Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    5. Sintetico Drop-Out (SD) Media crescita consistente 0,67% w / v di base di lievito di azoto (senza aminoacidi, ma con solfato di ammonio), 2% w / v di glucosio, 2% w / v di agar e 1x Amino Acid / nucleotidici Mix, preparata in DDH 2 O. Preparare sia liquidi che solidi (contenente 2% di agar) SD-Leucina media. Anche preparare solido SD-triptofano-Leucina e SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina media. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti. Versare in terreni solidi 100x15 millimetri piastre di Petri.
    6. Sintetico Drop-Out (SD) Crescita supporti contenenti 3-AT. Preparare SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina media come descritto, ma contenente 3-IN a concentrazioni di 25, 50, 75 e 100 mm. Aggiungere la quantità appropriata di 3-AT dalla soluzione 1M magazzino sterile ai media dopo che è stata in autoclave e raffreddato (ma non è ancora solidificato). Versare in piastre di Petri 100x15 millimetri.
    7. PEG / Acetato di litio Mix composto da 40% w / v PEG-3350, 120 mM litio acetato e 167 mg / ml DNA di sperma di salmone (tipo sale di sodio III) preparati in DDH 2 O. Per garantire la sterilità di questa miscela si prepara da acqua sterile e soluzioni (cioè autoclavato 50% PEG-3350, autoclave acetato 1M litio e 2 mg / ml di sperma di salmone DNA sale di tipo III di sodio preparata in sterili DDH 2 O).
    8. Enzimi e reagenti per lo svolgimento di PCR.
    9. Commerciale miniprep kit.
    10. Soda perle di vetro calce (0,5 mm).
    11. Competente cellule di Escherichia coli adatto per la propagazione plasmide (ad esempio DH5α, XL10 oro) e supporti standard adatto per la propagazione di batteri e selezione plasmide.
    12. Ceppi di lievito specifico, plasmidi e fondi, come descritto nel protocollo.
  2. Generazione di esche tMYTH di riparazione Gap
    1. L'esca deve essere clonato in un vettore appropriato per il tagging e di espressione. Una varietà di vettori tMYTH sono attualmente disponibili per l'impiego nelle costruzioni esca. Vettori come il pCMBV4, pAMBV4 e pTMBV4 permettono la costruzione di C-terminale esche tag (BAIT-C ub-lexa-VP16) sotto il controllo del CYC1 (debole), ADH1 (forte) e TEF1 (molto forte) promotori, rispettivamente . Esche N-terminale con tag (Lexa-VP16-C ub-BAIT) possono essere generati utilizzando vettori quali pTLB-1 e pBT3-N, sotto il controllo del TEF1 e CYC1 promotori, rispettivamente. La scelta dipende dal vettore, l'esca e devono essere determinati empiricamente. In alcuni casi l'espressione più alta esca è necessario al fine di individuare le interazioni, mentre in altri casi esca sovraespressione può effettivamente essere dannosa, portando ad un aumento del numero di falsi positivi.
    2. Restrizione digerire il plasmide selezionato al sito di restrizione appropriato (s). Scissione deve avvenire solo nelle immediate vicinanze della UB-Lexa-VP16 tag C (a monte del tag per il C-terminale tagging oa valle per N-terminale tagging). Per esempio, quando si utilizza il vettore pAMBV4, Street Fighter II è la scelta ideale. Conservare il plasmide digerito a -20 ° C fino al momento dell'utilizzo.
    3. Primer design per l'amplificazione e la clonazione del gene di interesse. Il 5 'del primer forward devono corrispondere a circa 35-40 nucleotidi a monte del sito di restrizione, mentre il 3' deve coincidere con i primi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio. 5 'del primer Reverse devono corrispondere il complemento inverso di circa 35-40 nucleotidi a valle del sito di restrizione, con 3' di corrispondenza il complemento inverso degli ultimi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio (omettendo il codone di stop se il C-ub Lexa-VP16 tag viene posto al C-terminale). A seconda che N-o C-terminale tagging viene eseguita, selezionare i 35-40 nucleotidi del primer avanti o indietro in modo che il gene bersaglio è clonato nel telaio con l'UB-Lexa-VP16 tag C.
    4. Amplificare il gene di interesse mediante PCR utilizzando i primer sopra. Parametri PCR dipenderà dal particolare enzima e primers specifici utilizzati.
    5. Trasformare il prodotto di PCR con il plasmide digerito in un ceppo di lievito appropriato laboratorio leu2 recanti una mutazione (ad es BY4741). Un ceppo giornalista MITO (ad esempio THY.AP4 o L40) può essere utilizzata ma non è necessario, come lo scopo del lievito, a questo punto è semplicemente quella di servire come un ambiente in cui la riparazione divario ricombinazione omologa può accadere. Trasformazione deve essere effettuata come segue:
      1. Inoculare una singola colonia del ceppo di lievito selezionato in 5 ml di media YPAD sterile e incubare una notte a 30 ° C con costante agitazione (200 giri).
      2. Diluire la cultura durante la notte in 50 ml di media YPAD fresca ad un OD600 di ~ 0,15 e incubare a 30 ° C con agitazione (200 giri). Crescere per circa 3-4 ore fino a quando un OD600 di circa 0,6 viene raggiunto.
      3. Centrifugare le cellule a 700xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      4. Risospendere il pellet cellulare in 25 ml sterile DDH 2 O e centrifugare a 700xg per 5 minuti.
      5. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml sterile DDH 2 O.
      6. Aggiungere 100 ml di cellule, 300 ul PEG / litio mix acetato, e il plasmide digerito (50 fmol) e prodotto della PCR (250-500 fmol) in una provetta per microcentrifuga.
      7. Incubare a 30 ° C per 30 minuti.
      8. Shock termico a 42 ° C per 1 ora.
      9. Centrifugare a 3000xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      10. Risospendere il pellet cellulare in 200 l sterile DDH 2 O e la piastra l'intero volume su solidi, terreni selettivi SD-Leucina. Crescere a 30 ° C per 2-4 giorni.
      11. Crescere una singola colonia del ceppo trasformato in 5 ml SD-Leucina liquidi a 30 ° C durante la notte.
      12. Centrifugare le cellule a 700xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      13. Isolare DNA plasmidico esca dal pellet cellulare utilizzando qualsiasi kit commerciale miniprep. Seguire il protocollo standard con una modifica. Al fine di garantire una sufficiente lisi delle cellule di lievito, aggiungere un piccolo volume di 0,5 mm soda perline di vetro calce al pellet dopo la ricostituzione iniziale e vortice vigorosamente per 5 minuti. Quindi procedere con il protocollo commerciale come di consueto.
      14. Trasforma DNA isolato lievito in una competente E. coli ceppo adatto per la propagazione plasmide (ad esempio DH5α, XL10 Oro) con un'efficienza di trasformazione di almeno 1x10 7 cellule / DNA mcg. Si noti che esca plasmidi possono essere selezionati per l'utilizzo di kanamicina.
      15. Harvest DNA plasmidico dal trasformata E. coli utilizzando un metodo standard di isolamento del DNA o di un kit commerciale.
      16. Verificare interpretato dell'esca plasmide mediante sequenziamento.
      17. Trasformare l'esca verificato costruire in un ceppo appropriato giornalista MITO (ad esempio THY.AP4, L40). Il protocollo di trasformazione lievito appena descritto può essere utilizzato, sostituendo il DNA plasmidico esca al posto del prodotto digerito plasmide e PCR.
  3. Bait convalida - Localizzazione corretta
    1. Prima dell'uso, ceppi esca sono analizzati per garantire che essi siano correttamente localizzata sulla membrana del lievito. Quando si utilizza iMYTH, questa localizzazione dipenderà in particolare sulle proprietà del tag esca. Per tMYTH, plasmidi esca generalmente includono una sequenza segnale (ad esempio Matα) dirigere la proteina espressa sulla membrana plasmatica. La localizzazione è determinato mediante microscopia a fluorescenza. L'inclusione di una molecola YFP nella sequenza di tag esca (es. C ub-YFP-lexa-VP16) è l'approccio più semplice e diretta, permettendo la visualizzazione diretta di cellule vive, ed è comunemente utilizzato in iMYTH. In alternativa, un approccio standard di immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro il Lexa o VP16 componenti del tag può essere utilizzato.
  4. Bait convalida - N ub G / I test di controllo
    1. Localization Once corretta dell'esca è stata stabilita, è necessario garantire che l'esca non si attiva il sistema di giornalista da soli o in presenza di non interagenti prede (ad esempio verificare che l'esca non è auto-attivazione). Questa operazione viene eseguita utilizzando il N ub G / Test I, dove si trasforma l'esca con l'interazione (positivo) e non interagenti (negativo) prede di controllo, e la crescita viene valutata su terreni selettivi. Un esca deve crescere su terreni selettivi in la presenza del controllo positivo, e non crescono in presenza del controllo negativo, per essere adatto all'uso in MITO.
    2. Inizia trasformando il ceppo esca da testare con 100-200 ng di plasmide preda di controllo. Il protocollo precedentemente descritto la trasformazione del lievito può essere utilizzato, in sostituzione SD-Leucina media in luogo di YPAD e l'utilizzo di SD-triptofano-Leucina supporti per la fase di rivestimento finale. I seguenti costrutti preda di controllo sono comunemente utilizzati:
      1. messaggio1-N UB I (controllo positivo)
      2. messaggio1-N ub G (controllo negativo)
      3. pFUR4-N UB I (controllo positivo)
      4. pFUR4-N ub G (controllo negativo)
    3. OST1 è un componente del complesso oligosaccharyl ed è localizzata nella membrana del reticolo endoplasmatico [9] mentre FUR4 è una permeasi uracile ed è localizzata nella membrana del plasma [10]. Anche se queste proteine ​​sono di solito la nostra prima scelta per l'utilizzo come non interagenti prede, la loro idoneità variano caso per caso. Nel caso improbabile che la vostra esca si prevede di interagire realmente con questi due controlli, prede alternative dovranno essere selezionati. Ricordiamo che N I ub è la wild-type forma di N-terminale di ubiquitina, e interagisce spontaneamente con C ub indipendente di una interazione tra le proteine ​​di cui si fondono la ub C e N ub. Così N ub prede ho costituiscono controlli positivi, mentre la N ub G prede (portando la isoleucina 13 a Glycine mutazione che impedisce l'associazione spontanea di N e C ub ub) servono come controlli negativi.
    4. Risospendere singole colonie di ogni esca trasformato in 100 ul sterile DDH 2 O.
    5. Serie diluire le cellule risospese in sterili DDH 2 O per produrre diluizioni di 1 / 10, 1 / 100 e 1 / 1000.
    6. Spot 5 volumi l di cellule non diluito e diluito su SD-triptofano-Leucina e SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina media con e senza 3-AT in un intervallo di concentrazioni. 3-A agisce come un inibitore competitivo del gene HIS3 giornalista, e serve ad aumentare la severità del processo di selezione. Può essere utile in alcuni casi per inibire la crescita non specifici della debolmente a moderatamente ad attivazione automatica esche.
    7. Lasciare i punti per asciugare e poi incubare le piastre a 30 ° C per 2-4 giorni.
    8. Tutti i trasformanti deve crescere sulla SD-triptofano-Leucina piatti, indicando che sono state trasformate con successo in preda plasmide. Le esche che non auto-attivare crescerà su SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina dei media solo quando si trasforma con N ub ho preda costruisce, e non con N ub G prede. Nota che la concentrazione di 3-AT è richiesto dai media (se presente) in quanto questo dovrà essere utilizzato durante lo screening.

4. Screening

  1. Supporti necessari e soluzioni
    1. Sterili DDH 2 O preparato in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    2. 0,9% Soluzione di NaCl preparato in DDH 2 O e sterilizzati in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    3. Soluzione di fosfato composto di 493 mM fosfato bibasico di sodio e 250 mM sodio fosfato monobasico in DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    4. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside) Soluzione pronta come una 100 mg / mL di soluzione madre in N, N-dimetil formammide.
    5. La crescita media 2xYPAD contenente il 2% w / v estratto di lievito, 4% w / v peptone, 4% w / v di glucosio e 100 mM adenina, preparata in DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    6. Dropout sintetico (SD) Media crescita, preparato come descritto in precedenza. Preparare liquido SD-Leucina e solido SD-Triptofano-Leucina. Versare il terreno solido su entrambi 100x15 millimetri piastre di Petri. Preparare solido SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina dei media in 150 piastre mm tondo, 16 piastre per ogni schermata, che contiene 3-AT, se necessario, alla concentrazione determinata dalla ub N G / I test di controllo.
    7. Dropout sintetico (SD) Media + 5-Bromo-4-cloro-3-Indoyl-β-D-galattopiranoside (X-Gal). Preparare SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina supporti contenenti agar come descritto in precedenza. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciar raffreddare, aggiungere 3-AT (se necessario) seguita in volume o 1/10thf sterile Soluzione di fosfato. Successivamente, aggiungere X-Gal soluzione ad una concentrazione finale di 80 mg / mL. Mescolare bene e versare in 150 lastre mm tondo.
    8. PEG / Litio Acetato Solution II contenente il 40% PEG-3350, 100 Acetato di litio mM, EDTA 1 mM e 10 mM Tris pH 7,5. Preparare questa soluzione sterile con DDH 2 O e soluzioni (ad esempio in autoclave 50% PEG-3350, 1 Acetato di litio M, 100 mM Tris pH 7,5 e 500 mM EDTA pH 8,0).
    9. Litio acetato / Tris EDTA soluzione contenente 110 mM acetato di litio, 11 mM Tris pH 7,5 e 1,1 mM EDTA. Preparare questa soluzione sterile con DDH 2 O e soluzioni (ad esempio acetato autoclave litio 1M, 100 mM Tris pH 7,5 e 500 mM EDTA pH 8,0).
    10. Soluzione 10x Tris EDTA composto di 100 mM Tris pH 7,5 e 10 mM EDTA preparata in DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, 15 psi per 30 minuti.
    11. DNA a singolo filamento Carrier (ssDNA) Soluzione contenente 2 mg / ml di salmone DNA spermatico sale di tipo III di sodio, preparata in sterili DDH 2 O.
    12. Commerciale miniprep kit.
    13. Soda perle di vetro calce (0,5 mm).
    14. Competente cellule di Escherichia coli adatto per la propagazione plasmide (ad esempio DH5α, XL10 oro) e supporti standard adatto per la propagazione di batteri e selezione plasmide.
    15. Ceppi di lieviti specifici e plasmidi, come descritto nel protocollo
  2. Scala di trasformazione di grandi dimensioni
    1. Inoculare una singola colonia del ceppo giornalista MITO contenente la vostra esca in 5 ml di SD-Leucina media e incubare una notte a 30 ° C con agitazione (200 giri).
    2. Diluire la cultura durante la notte in 200 mL SD-Leucina multimediale in un OD600 = 0,15 e incubare a 30 ° C con agitazione (200 giri). Crescere = 0,6 fino al OD600 - 0,7 (circa 4-5 ore).
    3. Poco prima della OD600 prefissata, si disgelo una aliquota di soluzione ssDNA. Fate bollire a 100 ° C per 5 minuti e poi raffreddare su ghiaccio. Ripetere una volta.
    4. Quando il bersaglio OD600 è stato raggiunto, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 700xg per 5 minuti (dividere i 200 ml cultura tra 4x50 mL con tappo a vite provette).
    5. Lavare ogni pellet con 30 ml sterile DDH 2 O e brevemente vortice del campione. Centrifugare a 700xg per 5 minuti.
    6. Eliminare il supernatante e risospendere ogni sedimento in 1 ml di acetato di litio / Tris soluzione di EDTA. Trasferire in un sterile provetta da microcentrifuga 1,5 ml e centrifugare a 700xg per 5 minuti.
    7. Eliminare il supernatante e risospendere ogni pellet in 600 ml di acetato di litio / Tris soluzione di EDTA.
    8. Aggiungere quanto segue 4x15 mL con tappo a vite provette:
      1. 2,5 ml PEG / Litio Acetato Solution II
      2. 600 microlitri cellule risospese
      3. 100 microlitri soluzione ssDNA
      4. 7 mg di DNA preda biblioteca
    9. Librerie contenenti prede tag sia a N-o C-terminale con N ub G, e preparato da una varietà di fonti di cDNA o genomica, sono disponibili in commercio ( www.dualsystems.com ). La biblioteca specifico utilizzato deve essere determinato caso per caso, dipende l'esca scelta e gli obiettivi sperimentali.
    10. Agitare per 1 minuto per permettere una miscelazione accurata e poi incubare a 30 ° C a bagnomaria per 45 minuti. Miscelare brevemente ogni 15 minuti.
    11. Aggiungere 160 microlitri dimetil solfossido (DMSO) a ciascuna provetta e mescolare immediatamente invertendo i tubi.
    12. Incubare in un 42 ° C a bagnomaria per 20 minuti.
    13. Raccogliere trasformanti da centrifugazione a 700xg per 5 minuti.
    14. Scartare il surnatante. Recuperare trasformanti da risospensione di ogni 2xYPAD pellet in 3 ml. Piscina tutti i campioni insieme in un unico 50 mL con tappo a vite provetta da centrifuga.
    15. Incubare a 30 ° C per 90 minuti per il recupero delle cellule.
    16. Centrifugare a 700xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
    17. Risospendere il pellet di cellule in 4,9 ml sterile di NaCl 0,9%.
    18. Con 100 ml di cellule risospese preparare diluizioni seriali di 10 volte in salina allo 0,9% di NaCl che vanno da 10x a 1000x.
    19. Piatto 100 l di diluizioni 100x e 1000x su SD-triptofano-Leucina media e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Queste lastre servono come controllo e vengono utilizzati per calcolare l'efficienza della trasformazione.
    20. Divideranno equamente il restante 4,8 ml di cellule risospese e la piastra su grandi (150 mm), SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina piatti,che contiene la quantità necessaria di 3-AT, come determinato nel ub N G / I test, e incubare a 30 ° C per 3-4 giorni.
    21. Risospendere singole colonie (ciascuno contenente le cellule che rappresentano un potenziale di interazione esca-preda coppia) in 100 ml di NaCl allo 0,9% e la piastra di 5 aliquote microlitri su SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina + X-Gal media (e di cui 3-AT se richiesto). Permettono di crescere per 2-4 giorni. Questa fase serve un secondo giro di monitoraggio selettivo, e aiuta nella rimozione di falsi positivi ottenuti nel turno iniziale. Solo colonie che mostrano una crescita robusta e di colore blu sono selezionate per ulteriori analisi.
  3. Prey Isolamento e sequenziamento del DNA
    1. Isolare il DNA plasmidico dalle colonie di lievito blu utilizzando un protocollo miniprep con le modifiche descritte in precedenza. Assicurati di crescere le cellule in SD-triptofano media solo, di scegliere per la conservazione della preda, ma non esca, plasmidi. Per schermi che producono un gran numero di visite, disponibile in commercio high-throughput miniprep kit può essere utile a questo punto.
    2. Trasforma DNA isolato lievito in un plasmide competente E. coli ceppo adatto per la propagazione plasmide (ad esempio DH5α, XL10 Oro) con un'efficienza di trasformazione di almeno 1x10 7 cellule / DNA mcg. Si noti che plasmidi preda possono essere selezionati per l'utilizzo di ampicillina.
    3. Isolare il DNA plasmidico dal trasformata E. coli utilizzando un metodo standard di isolamento del DNA o di un kit commerciale. Ancora una volta, un elevato throughput miniprep kit può essere utile se il numero del campione è grande. L'amplificazione del DNA in E. coli aumenta notevolmente la resa plasmide e garantisce che una quantità sufficiente di DNA è presente sia per il sequenziamento e ulteriori analisi.
    4. Sequenza i plasmidi isolati utilizzando un primer complementare alla sequenza all'interno del ub N G.
    5. Compilare e analizzare tutti i dati di sequenziamento per assemblare il vostro elenco preliminare di interattori. Ciò può essere fatto manualmente o in modo automatico utilizzando il software appropriato.
  4. Test di dipendenza Bait
    1. Dopo il montaggio della lista preliminare di interattori è importante ricontrollare le interazioni ed eliminare prede promiscuo che interagiscono / attivare il sistema di giornalista in modo indipendente l'identità di esca. Questa operazione viene eseguita utilizzando il test di dipendenza etero. In questo test, tutti gli interattori identificati sono trasformati di nuovo nel ceppo esca originale, così come un ceppo ospitare un esca artificiale di controllo costituito da un singolo dominio transmembrana fusa al UB-Lexa-VP16 tag C. La trasformazione è effettuata secondo il protocollo standard descritto in precedenza, utilizzando SD-Leucina media in luogo di YPAD e terreni solidi SD-triptofano-Leucina per la fase di rivestimento finale.
    2. Risospendere singole colonie dalle trasformazioni sopra in 100 ml di sterile DDH 2 O e spot 5 volumi microlitri su SD-triptofano-Leucina-Adenina-Istidina + X-Gal media (e di cui 3-AT se necessario). Le piastre sono poi incubate per 2-4 giorni a 30 ° C. Idealmente trasformanti multipli dovrebbero essere selezionati per ogni preda, e sia l'esca originale ed esche artificiali devono essere individuati sulla piastra stessa.
    3. Lievito portando l'esca artificiale e preda che causano l'attivazione del sistema di reporter (cioè la crescita e il colore blu) sono considerati promiscui e che la preda specifico viene rimosso dalla lista dei interattori.
    4. Prede che causano la crescita e la colorazione blu nel lievito con l'esca di interessi, ma non l'esca artificiale, conferma questa interazione specifica. Se, invece, il lievito ospitare la preda e la vostra esca di interessi non crescono, questa preda è rimosso dalla lista di interattori.
    5. Le prede rimanenti costituiscono l'elenco completo delle interattori identificati nella schermata di MITO.

5. Studi ulteriori

Una volta che lo screening MITO è stata completata, ulteriori analisi deve essere effettuata al fine di convalidare e determinare il significato biologico delle interazioni rilevate. Gli studi specifici da eseguire variano caso per caso, e deve essere determinato dal singolo ricercatore. Alcuni esempi comuni di follow-up sono co-immunoprecipitazione esperimenti e studi di cancellazione nell'organismo nativo. Inoltre, l'analisi computazionale dei dati ottenuti possono essere utili per la rilevazione di modelli, e contribuendo ad identificare la potenziale rilevanza e il ruolo delle interazioni diverse possono giocare. Così, la tecnologia MITO funge da potente primo passo 'verso l'identificazione e la comprensione delle interazioni critiche funzionali di proteine ​​di membrana. Accoppiato con dettagliati studi di follow-up e altri recentemente sviluppati ed emergenti technologies, promette di essere un valido strumento per svelare i misteri della cellula.

Figura 1
Figura 1. Principio di dividere ubiquitina. A. Ubiquitina possono essere separati in due frazioni: il C-terminale (C ub) e l'N-terminale (N ub I). Queste frazioni di ricostituire spontaneamente a causa della loro elevata affinità per un altro. b. UN mutazione puntiforme ub io alla posizione 13 da una isoleucina di glicina (N ub G) impedisce questa spontanea riassociazione. c. Nel sistema MITO, l'ub C è fuso con l'esca di interessi (B) e la preda si fonde alla ub N G (A). Interazioni proteiche AB ricostituisce pseudo-ubiquitina.

Figura 2
Figura 2. Split-ubiquitina membrana a base di lievito di due ibridi (MITO) del sistema.
La membrana di proteine ​​d'interesse (esca) è fusa al C-terminale di lievito ubiquitina (C Ub), coniugato con un fattore di trascrizione. Utilizzando una libreria di cDNA o gDNA, ogni proteina codificata dal libreria (preda) si fonde al corrispondente N-terminale della frazione ubiquitina (N Ub G). Se le due proteine ​​non interagiscono, il fattore di trascrizione rimane a livello di interfaccia membrana (pannello di sinistra). Tuttavia, se le proteine ​​interagiscono, le due frazioni ubiquitina unirsi, con conseguente scissione dalla ubiquitina proteasi specifiche. Scissione rilascia il fattore di trascrizione, con conseguente espressione di geni reporter (pannello di destra)

Figura 3
Figura 3. MITO pipeline.

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Discussion

MITO è il primo sistema ad alto rendimento che permette l'identificazione delle interazioni tra full-length proteine ​​di membrana e citosoliche o legata alla membrana partner. E 'stato utilizzato per lo studio delle proteine ​​di membrana di una serie di organismi [3-7]. Vi sono, tuttavia, i dettagli specifici che potrebbero dover essere esaminato per assicurare la proteina d'interesse è riconducibile a studiare con MITO.

Molte proteine ​​di membrana sono diretti alla membrana plasmatica tramite una sequenza segnale che viene successivamente scisso per produrre la proteina matura. Questa sequenza è organismo specifico ed è possibile che questa sequenza segnale nativo causerà mis-localizzazione della proteina d'interesse se espresso in lievito perché la sequenza segnale rimane sconosciuto. Per aggirare questo problema, abbiamo progettato queste proteine ​​specifiche che devono essere fuse alla sequenza segnale lievito, derivati ​​dal fattore alfa di accoppiamento (MATα). Questa sequenza di peptidi (i cosiddetti MFα-ss) ri-localizza la proteina alla membrana plasmatica lieviti e, soprattutto, viene scissa dalle peptidasi segnale lievito. Questa sequenza peptide si trova in plasmidi pTMBV-MFα e pAMBV-MFα.

Un altro parametro importante che deve essere sottolineato è livelli di espressione esca. Il promotore che guida l'espressione dell'esca regola questo parametro. Potrebbe essere necessaria per ottimizzare i livelli di espressione bait utilizzando il NubG / Nubi di prova e la quantità di 3-AT necessarie per eliminare gli artefatti iperespressione, dove l'esca è "auto-attivando" (cioè interagisce promiscuamente con molti non-proteine ​​specifiche preda) . Esaminando le proteine ​​del lievito produce le concentrazioni esca più fisiologicamente rilevanti iMYTH quando è applicato. In questo caso, il gene d'interesse è etichettato con la Cub-TF all'interno del gDNA. In alternativa, le proteine ​​esogene possono essere espressi da pBT3-STE e plasmidi pCMBV che portano il promotore CYC1 conseguente espressione esca bassa. Il pTMBV plasmidi e pTLB1 porto il TEF1 promotore mentre pAMBV è il promotore ADH1, sia che l'espressione forte impulso della proteina esca. Se i livelli di proteina esca richiedono ulteriore ottimizzazione, può essere necessario utilizzare il pTLB-1 plasmide che porta il promotore TEF1, tuttavia, il dominio del DNA Lexa legame è mutato in R156G per diminuire l'affinità verso i promotori esogeni gene reporter, in ultima analisi, diminuendo la probabilità di auto-attivazione [5].

Un altro fattore che gioca un ruolo importante per il successo MITO è la biblioteca di scelta utilizzato per il processo di screening. Questo dipenderà sui profili di espressione endogena esca. Per esempio, l'esca può essere espresso in tessuti specifici, e quindi è importante utilizzare una libreria che è costruito da questo tessuto specifico. Questo assicurerà fisiologicamente interazioni rilevanti vengono rilevati.

Il sistema MITO è uno strumento semplice e rapida che fornisce l'abbondanza di informazioni su una classe di proteine ​​che sono stati difficili da studiare. Queste interazioni identificate può aiutare nella spiegazione delle funzionalità complete biologica delle proteine ​​di membrana.

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Disclosures

Igor Stagljar è una co-fondatore di DualSystems Biotech, in Svizzera.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Edmonds Alba per una lettura critica di questo manoscritto. Il laboratorio Stagljar è sostenuto da fondi della Fondazione canadese per l'innovazione (CFI), il Canadian Institute for Health Research (CIHR), la Fondazione cardiache e ictus, la Canadian Cancer Society, e Novartis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethenlene Glycol (PEG3350) BioShop Canada PEG335
Lithium Acetate Bihydrate BioShop Canada LIA001
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) BioShop Canada XGA001
N`,N-dimethyl formamide BioShop Canada DMF 451
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) BioShop Canada ATT124
Sodium phosphate dibasic BioShop Canada SPD307
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500
Salmon Sperm DNA VWR international CA80601-120
D-Glucose BioShop Canada GLU501
LB Broth LENOX BioShop Canada LBL405
Yeast Nitrogen Base BioShop Canada YNB406
Yeast Extract BioShop Canada YEX401
Peptone BD Biosciences 211677
Bio-Tryptone BioShop Canada TRP402
Adenine Sulphate BioShop Canada ADS201
L-Uracil BioShop Canada URA241
L-Threonine BioShop Canada THR002
L-Histidine BioShop Canada HIS200
L-Methionine BioShop Canada MET222
L-Valine BioShop Canada VAL201
L-Phenylalanine BioShop Canada PHA302
L-Isoleucine BioShop Canada ISO910
L-Tyrosine BioShop Canada TYR333
L-Leucine BioShop Canada LEU222
L-Arginine BioShop Canada ARG006
L-Tryptophane Fisher Scientific BP395-100
L-Lysine BioShop Canada LYS101
L-Alanine Fisher Scientific BP369-100
Agar BioShop Canada AGR001
Soda Lime Galss Beads Biospec Products 11079105
Sodium Chloride BioShop Canada SLD002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27, (11), 559-563 (2002).
  2. Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
  3. Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26, (1), 15-25 (2007).
  4. Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (9), 5187-5192 (1998).
  5. Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7, (7), 1362-1377 (2008).
  6. Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278, (39), 37998-38003 (2003).
  7. Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13, (7), 1744-1753 (2003).
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  10. Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2, (8), 977-984 (1982).

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