Живая съемка подвижность клеток и актинового цитоскелета отдельных нейронов и нервных клеток Крест в данио рерио Эмбрионы

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает изображения отдельных нейронов или нервных клеток гребня в живых рыбок данио эмбрионов. Этот метод используется для изучения поведения и сотовой локализации актина с помощью флуоресцентной конфокальной покадровой микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (36), e1726, doi:10.3791/1726 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Данио является идеальной моделью для работы с изображениями камера поведения в процессе развития в естественных условиях. Данио рерио эмбрионы внешне оплодотворенной и, следовательно, легко доступны на всех этапах развития. Более того, их оптическая прозрачность позволяет высоким разрешением клеточной и молекулярной динамики природной среды нетронутыми эмбриона. Мы используем подход жить изображений для анализа поведения ячейки во время нейронные миграции клеток гребня и результатом и руководства нейронных аксонов.

Живая изображения особенно полезна для понимания механизмов, регулирующих процессы клеточной подвижности. Чтобы представить себе детали клеточной подвижности, таких как выступающими деятельности и молекулярная динамика, это выгодно для обозначения отдельных ячеек. В данио рерио, ДНК плазмиды инъекция дает переходный характер экспрессии мозаики и предлагает явные преимущества перед другими методами маркировки клеток. Например, трансгенные линии часто этикетке всей популяции клеток и таким образом может заслонить визуализации тонких выступов (или изменений в молекулярно-массовое распределение) в одну ячейку. Кроме того, введение ДНК в один-клеточной стадии менее инвазивных и более точных, чем краситель инъекции на более поздних этапах.

Здесь мы опишем метод маркировки отдельных развивающихся нейронов или нервных клеток гребня и визуализации их поведение в естественных условиях. Мы вводят плазмиды ДНК в 1-клеточной стадии эмбриона, в результате чего мозаика выражение трансгена. Векторы содержат ячейки конкретных промоутеров, которые управляют выражение гена в подмножество сенсорных нейронов или нервных клеток гребня. Мы предоставляем примеры клетки помечены мембраны целевых GFP или биосенсор зонд, который позволяет визуализировать F-актина в живых клетках 1.

Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой работе.

Protocol

1. Ассамблея инъекции слайдов и визуализация слайдов

Инъекция слайдов:

  1. Подготовка Sylgard силиконового эластомера в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Используйте Sylgard для соединения трех стандартных микроскопом стеклах вместе, складывая один слайд на вершине пересечении двух других слайды, которые расположены бок о бок на длинных краев. Верхнем слайде создает прямоугольный угол или "стены" между верхней и нижней слайдов.
  3. Давайте Sylgard набор на ночь. Эти слайды являются многоразовыми.

Изображений слайд:

  1. Мы используем нержавеющей стали вырезать прямоугольники с тем же размером со стандартный микроскопический слайд стекла (75 мм х 25 мм х 1 мм), так что камера подходит держателя слайдов на столик микроскопа. 1,5 см, вырезать отверстие в центре прямоугольника.
  2. Прикрепите 22 мм 2 покровное к металлической прямоугольник с Sylgard. Используйте ровно столько Sylgard тщательно печать покровное. Чтобы изображение на инвертированный микроскоп, эмбрионы будут установлены на этой покровное и изображение получено с дном.
  3. Давайте Sylgard набор на ночь. Эти слайды являются многоразовыми и очищается на 70% этанола между применениями.

2. Подготовка конструкций ДНК

Чтобы выразить трансгена в тканеспецифические образом, интерес гена клонируется за ячейке конкретных промоутера. Мы используем цис-регуляторных элементов гена данио neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 или sox10 гена (-4.9sox10) 3 водить выражение в сенсорных нейронов или нервных клеток гребня, соответственно. Для визуализации клеток и мембраны динамика, мы выражаем цитоплазматические мембраны или локализованные флуорофоров. Чтобы создать образ F-актин распределения, мы выражаем ДНК, кодирующей домен calponin гомологии атрофин слит с mCherry (UtrCH-mCherry). UtrCH-mCherry биосенсор зонда позволяет визуализировать F-актин, не мешая актина динамики 1. Мы генерируем эти конструкции ДНК использованием шлюза Invitrogen рекомбинации стратегия, ориентированная на клонирование 4 и векторы представлены в данио Tol2kit 5.

  1. Создание вектора экспрессии (ы) с помощью Многоузловое-Gateway Технология и векторы из данио Tol2kit 5. Плазмиды содержат Tol2 позвоночник от pT2KXIGDin.
  2. Purify плазмидной ДНК плазмиды с QIAfilter Midi Подготовка комплекта (QIAGEN Inc) и элюируются в стерильной воде. ДНК не должны быть линеаризованной для инъекций.

3. Введение ДНК-конструкции

  1. Развести ДНК, чтобы конечная концентрация 10-50 мкг / мл ДНК в 0,2% фенола красного (для визуализации во время инъекций) в воде.
  2. Заполнить и калибровать иглы: Назад заполнения вытащил капиллярной иглой с приблизительно 1 мкл раствора ДНК и вставить ее в держатель иглы инъекции аппарата (мы используем Picospritzer). Использование тонких щипцов, сломать кончик иглы так, чтобы кончик открытия составляет примерно 10 мм в диаметре. Измерьте диаметр капли в минерального масла с окулярного микрометра. Отрегулируйте давление настройки длительности, чтобы получить капли объемом около 1 п.
  3. Соберите 1-клеток эмбрионов этап в E3 среда эмбриона (5 мМ NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0,33 мм, 0,33 мм MgSO 4 * 7H 2 O, рН 7,0).
  4. Передача примерно 30-60 эмбрионов слайд инъекции и положение эмбриона в правом углу угол, образуемый между верхней и нижней слайдов. Удалите большинство Е3 так, что эмбрионы проходят в слайд поверхностным натяжением.
  5. Используйте изогнутые рассекает контактный вращаться эмбрионов так ячейка к стене инъекции слайда.
  6. Использование микроманипулятора для руководства иглу через эмбрион хориона, через желток и в одной клетки эмбриона. Inject 0.5-1 п раствора ДНК в клетку.
  7. Трансфер эмбрионов в чашки Петри в Е3 и инкубировать при 28,5 ° C. При необходимости, развитие может быть замедлено путем инкубации эмбрионов при более низкой температуре.

4. Монтаж эмбрионов для работы с изображениями

  1. Удалить chorions из эмбрионов с мелкими пинцетом примерно за час до эмбрионы достигают желаемого возраста для работы с изображениями (примерно 14-17 часов после оплодотворения для наших целей).
  2. Выберите эмбрионов с использованием меченых клеток вскрытии микроскоп с флуоресценции. Мы используем 4X цели (увеличение 40х) на сферу Nikon AZ100 из-за его сочетание большое рабочее расстояние и большом увеличении.
  3. Место эмбрион в микроцентрифужную трубка с примерно 50 мкл E3, содержащий 0,2% Tricaine анестезии (10X концентрации).
  4. Добавить 500 мкл 1% низкой температурой плавления агарозы в E3 10 мМ HEPES (хранятся при температуре 42 ° С), разбавляя Tricaine до конечной концентрации 0,02%.
  5. Сразу передачи эмбриона в агарозном падение напокровное из изображений слайд, используя широкий стекла отверстия пипетки.
  6. Перед агарозном затвердевает, положение эмбриона так регионе с мечеными клетками вниз от нижнего покровного (спинной вниз для нервных клеток гребня и дорсолатеральной вниз для спинальных сенсорных нейронов).
  7. Соберите изображения камеры: Пальто с одной стороны пластиковым кольцом (2 см наружный диаметр, 3 мм) с силиконовой смазки вакуумного и прикрепите к слайду изображений металла. Пальто другой стороне кольца с жиром.
  8. Заполнить камеру с Е3, содержащем 10 мМ HEPES и 0,02% Tricaine. Уплотнение камеры сверху нанесения 22 мм 2 покровное к началу смазанные поверхности кольца.

5. 4D визуализации клеточных поведения на Олимпе FV1000 конфокальной микроскопии с IX81

Подробности захвата изображения будет зависеть от специфики вашего микроскопа. Здесь мы опишем покадровой процесс приобретения для Olympus FV1000 конфокальной микроскопии. Смотреть предыдущий Юпитера протокол для покадровой приобретения с Zeiss LSM 510 конфокальной системы 6.

  1. Место изображения камеры в держатель слайдов на столик микроскопа и сосредоточиться на эмбрион использованием 10X или 20X цель в проходящем свете.
  2. Переключить на 60X цели (НС 1.2 или выше) и сосредоточиться на меченую клетку с epifluorescence. Мы используем либо масло погружения (UPLSAPO 60xO NA 1,35) или погружение в воду (UPLSAPO 60xW NA 1,20) линзы.
  3. В FV программного обеспечения (версия 1.7c), нажмите на XY повторить начать лазерного сканирования.
  4. Отрегулируйте приобретение настройки и получения изображений управления (лазера, скорость сканирования, HV, усиление и смещение уровней) для оптимизации сигнала, сохраняя при этом мощность лазера, как минимум (25% или ниже), чтобы предотвратить повреждения тканей и снижения фотообесцвечивания.
  5. Для приобретения Z-серии, установить верхний и нижний пределы Z-Stack, наряду с шагом. Убедитесь, что глубина значок занимается, так что значок XY развертки имеет XY и Z выделены. Начало приобретение, нажав на значок XYZ Sweep.
  6. Для приобретения покадровой серии, установить временной интервал и количество временных точек под TimeScan заголовок в окне Приобретение Настройки. Нажмите Время иконка в окне управления Приобретение изображения так, чтобы значок XY развертки имеет XY (Z) и T выделены. Начало приобретение, нажав XY (Z) T развертки значок.
  7. Кроме того, TimeController может быть использован для создания покадровой. Это программирование полезно при генерации больших наборов данных, так как она не превышает распределения памяти. В области Device, открытого TimeController окна. Создать новую Задачу Imaging. Окно изображения параметр будет открытым. Нажмите кнопку FV статус обновить приобретение настройки. Убедитесь в том, сохранять и удалять сообщения проверяются под заголовком Terminate. Установить имя выходного файла и нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить настройки и закрыть окно. Используйте Loop функцию, чтобы установить необходимый интервал времени и количество временных точек. Нажмите кнопку Готово и Пуск, чтобы начать покупки. Пауза и Z-сдвиг функции могут быть использованы для переориентации в то время как изображения.

6. Представитель Результаты

Цифры и фильмов изображают примеры сенсорных нейронов и нервных клеток гребня, меченных мембранно-целевых флуорофоров или зонд актина биосенсоров.

Рисунок 1
Рисунок 1 конфокальной изображений (г-проекций) Tg (ngn1: GFP-caax). Трансгенных эмбрионов вводят с 25 пг ngn1: mCherry-caax ДНК. MCherry-CAAX этикетки одного нейрона красный () в фоновом со всеми Rohon-Борода сенсорных нейронов помечены зеленым цветом (В). C) Объединенные образ как зеленый и красный каналы. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2 конфокальной г-проекций нейронов в эмбрионы вводят ~ 20 пг ngn1:.. MCherry-UtrCH ДНК) Rohon-Борода сенсорного нейрона в 16,5 HPF эмбриона. F-актин сигнал сильный роста конусов (наконечники стрел) и выступы по вновь образованных аксонами. B) Нейрон в 20 HPF эмбрион показывает сильную F-актин сигнал роста конусов разветвленных периферических аксонов (наконечники стрел) и слабый сигнал в более зрелых центральной аксоны (стрелки). Шкала бар = 50 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оптимальная концентрация вводили ДНК будет варьироваться в зависимости от размера и силы промоутер строительства и должен быть определен эмпирически. Инъекция слишком много ДНК может привести к нездоровым эмбрионов с обширной гибель клеток, в то время слишком мало приведет к очень небольшой части вводят эмбрионы выражения трансгена. Уровень экспрессии ДНК коррелирует с силой флуорофора сигнал, который меняется от клетки к клетке. При сортировке эмбрионов под epifluorescence, исключить те с чрезвычайно высоким уровнем экспрессии. Меченых клеток, которые появляются очень яркие как правило, также показывают явные признаки токсичности, таких, как ненормальные морфологии клетки, mislocalization меченых молекул и гибели клеток. Типичный инъекции ДНК дает 5-10% эмбрионов, пригодных для работы с изображениями.

F-актин биосенсор может функционировать в доминирующих отрицательных моды при выраженных на высоком уровне. Если промоутер управляемой выражение проблематично, биосенсоров может быть выражена повсеместно, вводя мРНК. Преимущество мРНК инъекции в том, что уровни экспрессии можно управлять, регулируя концентрацию мРНК. Отдельные клетки в этих эмбрионов помечены совместное введение ДНК-конструкции содержащих клеточных конкретных промоутер вождения выражение мембраны локализованных флуорофора. Мы использовали этот подход для изображения F-актина в нервные клетки гребня 7.

Мы часто выполняют одноклеточные маркировки техники в трансгенных линий выражения. Например, потребители инъекционных-3.1ngn1: mcherry плазмиды в эмбрионы Tg (-3.1ngn1: GFP) линии будет наклейка сенсорных нейронов красного фоне зеленой нейронов. Эта стратегия позволяет исследовать поведение отдельной клетки в контексте всей клеточной популяции.

Мы сосредоточимся на изображение нервной и нервного гребня ячейки поведения и актин распределения. Тем не менее, общий метод ткани конкретных маркировки ячейка мозаики ДНК плазмиды инъекция может быть расширен для использования с флуоресцентных белков слияния, а также другие генетически закодированы биосенсор зондов. Сочетание этих методов может позволить следователям визуализировать субклеточные локализации специфических молекул, а также сигнальных механизмов в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH R01 NS042228 к MCH Olympus FV1000 конфокальной была приобретена с приборами NIH общие грант S10RR023717 к UW кафедре зоологии (П. И. Билл Бемент).

Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой статье.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich A5040-250G
Sylgard Silicone Elastomer Kit Dow Corning 184
QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen 12243
Low melting point agarose Invitrogen 15517-014
Picospritzer Parker Hannifin Corporation 051-0302-900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
  2. Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
  3. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
  5. Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
  6. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
  7. Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).

Comments

1 Comment

  1. There is an error with the reported bolus diameter and the corresponding approximate volume. According to the video, a 0.1²um diameter drop is approximately equal to a volume of 1nL. This value is off 1000-fold. I believe the authors made a mistake with the units. It should be corrected such that a drop diameter of 1²4um is equal to a volume of 1nL (or as I believe the authors intended, 0.1²4mm = 1nL).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 30, 2010 - 11:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics