दो फोटॉन आधारित लाइव Zebrafish भ्रूण में photoactivation

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Biology

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Summary

माइक्रोस्कोपी multiphoton गहरी ऑप्टिकल पैठ और कम phototoxicity के साथ कम ऊर्जा photons के नियंत्रण की अनुमति देता है. हम zebrafish भ्रूण में रहते सेल लेबलिंग के लिए इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन. यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकाश उत्तरदायी अणुओं की तस्वीर शामिल होने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है.

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Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (46), e1902, doi:10.3791/1902 (2010).

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Abstract

एक जीवित जीव में लक्ष्य यौगिकों के photoactivation एक मूल्यवान दृष्टिकोण साबित हो गया है भ्रूण के विकास, सेलुलर संकेत और वयस्क शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की जांच. इस संबंध में, बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग किसी दिए गए किसी एकल कक्ष के संकल्प पर प्रकाश गहरी ऊतकों में उत्तरदायी एजेंट के मात्रात्मक photoactivation सक्षम बनाता है. Zebrafish भ्रूण के रूप में ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं, उनके विकास में vivo नजर रखी जा सकता है. ये लक्षण zebrafish केंद्रित प्रकाश द्वारा रासायनिक एजेंटों और प्रोटीन की एक किस्म की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं. यहाँ हम दो photon माइक्रोस्कोपी उपयोग करने के लिए fluorescein रासायनिक बंदी, जो बारी में हमें जीना zebrafish भ्रूण में सेल भाग्य का पालन करने के लिए अनुमति देता है के सक्रियण प्रेरित वर्णन. हम एक जीने आनुवंशिक ऐतिहासिक (GFP) व्यक्त हित के किसी भी कक्ष को खोजने के लिए और ठीक लक्ष्य भ्रूण का उपयोग करें. यह प्रक्रिया इसी तरह प्रोटीन, हार्मोन, छोटे अणुओं और अन्य बंदी यौगिकों के सटीक प्रकाश प्रेरित सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

हम सेल बंदी fluorescein का उपयोग लेबलिंग के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, तथापि, अन्य फोटो activatable रंजक और प्रोटीन इसी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है.

1. बंदी fluorescein इंजेक्शन

  1. 5% Dextran संयुग्मित (DMNB) 4,5 - dimethoxy 2 - nitrobenzyl fluorescein (10,000 मेगावाट dextran, anionic, Invitrogen, आणविक जांच, Carlsbad, CA के बंदी के शेयर समाधान (5mg बंदी fluorescein / 100 μL 0.2M KCl) तैयार , बिल्ली नहीं डी 3310). -20 डिग्री सेल्सियस में विभाज्य दुकान नोट है कि DMNB - बंदी fluorescein प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और अंधेरे में रखा जाना चाहिए.
  2. एक इंजेक्शन 1% agarose (सिग्मा, सेंट लुइस, MO, बिल्ली नहीं. A9539) के रूप में "zebrafish पुस्तक" 1 में वर्णित के बने गर्त तैयार.
  3. एक 100 x E3 शेयर समाधान गिराए द्वारा E3 के माध्यम से 2 लीटर की तैयारी.
  4. इंजेक्शन से पहले शाम में, संभोग पुरुष (ओं) (ओं) महिला वांछित ट्रांसजेनिक लाइन के एक दृश्य फ्लोरोसेंट (GFP, आरएफपी आदि) ऐतिहासिक photoactivation के लिए लक्ष्य कोशिकाओं स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया व्यक्त से अलग पिंजरों तैयार करते हैं.
  5. केशिका इंजेक्शन सुई (पतला रेशा के साथ दीवार ग्लास capillaries, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL, बिल्ली नहीं. TW100F 6) एक micropipette डांड़ी (Sutter साधन, Novato, CA P-97) का उपयोग कर तैयार है.
  6. 5 बर्फ पर fluorescein बंदी% की एक विभाज्य पहले गला लें.
  7. 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5% 0.2M KCl में बंदी fluorescein शेयर समाधान पतला है, और बर्फ पर रख. प्रकाश जोखिम से बचें.
  8. सेटअप संभोग पार चरण 4 में तैयार.
  9. निषेचित अंडे के रूप में जल्द ही के रूप में वे निर्धारित कर रहे हैं लीजिए. ओरिएंट एक सेल agarose इंजेक्शन मोल्ड में मंच भ्रूण 1 E3 के साथ मढ़ा.
  10. एक microloader (Eppendorf, हैम्बर्ग, जर्मनी, बिल्ली नहीं. 956.003 5242) टिप backfill ~ 1% बंदी fluorescein समाधान की एक μL के साथ एक इंजेक्शन सुई का प्रयोग.
  11. एक गैस संचालित microinjector (वायवीय picopump, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL, PV820). संलग्न micromanipulator प्लेस में सुई लोड
  12. 2 - 3nl इंजेक्शन मात्रा समायोजित और बंदी fluorescein सेल cytoplasm में सीधे इंजेक्षन. प्रयोग 50 प्रतिशत भ्रूण की एक न्यूनतम इंजेक्षन.
  13. अंधेरे में 28.5 पर भ्रूण सेते ° सी E3 में वांछित विकास मंच के लिए. यदि 24 घंटे के बाद निषेचन की तुलना में पुराने भ्रूण का विश्लेषण कर रहे हैं, 0.1% phenylthiourea जोड़ने (PTU, सिग्मा, सेंट लुइस, MO, बिल्ली नहीं. 22,290-9) pigmentation बाधित.

2. भ्रूण बढ़ते

  1. ताजा E2 समाधान तैयार (समाधान हिस्सा देख, 4 ° C से कम एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है).
  2. कोट E2 मध्यम में भंग 1% agarose की एक पतली परत के साथ 60 मिमी पेट्री डिश.
  3. 2% कम पिघलने बिंदु एम्बेडिंग agarose (अल्ट्रा शुद्ध एलएमपी agarose, Invitrogen, Carlsbad, सीए, बिल्ली नहीं 16,520,100) के लिए तैयार: बाँझ दोहरा आसुत जल में उबलते जब तक माइक्रोवेव हीटिंग द्वारा agarose भंग. ट्यूब टोपी हीटिंग के दौरान खुली रखो. विभाज्य 1 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में और 72 पर एक हीटिंग ब्लॉक में रखने डिग्री सेल्सियस
  4. धीरे तेज संदंश (5 सं) के साथ chorion अलावा खींच द्वारा भ्रूण के chorions निकालें. अगर लेपित पकवान पर E2 समाधान में भ्रूण रखें (चरण 2 देखें). Dechorionated भ्रूण आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक के साथ संभाला जाना चाहिए के रूप में वे polypropylene pipettes के लिए छड़ी कर सकते हैं. हवा करने के लिए इन भ्रूण के रूप में तरल सतह तनाव द्वारा क्षतिग्रस्त हो सकता है dechorionized भ्रूण को उजागर करने से बचें.
  5. E2 की एक छोटी मात्रा एक आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग कर में चयनित भ्रूण लीजिए, और 60 मिमी पेट्री डिश पर भ्रूण जगह. 2% agarose (~ 150 μL) (कदम 3) भ्रूण के बगल में ड्रॉप माउंट. जल्दी दो बूँदें मिश्रण करने के लिए एक समरूप अंतिम ~ 1% agarose मिश्रण प्राप्त है और एक खुर्दबीन उन्मुख विदारक इसकी पृष्ठीय उद्देश्य लेंस का सामना करना पड़ पक्ष के साथ भ्रूण का उपयोग कर.
  6. रुको जब तक agarose जम गया है और E2 मध्यम जोड़ने एम्बेडेड भ्रूण तक तरल में डूबे हुए है. यह पकवान प्रति एक भ्रूण प्राप्त करने के रूप में यह photoactivation प्रक्रिया के बाद agarose से जारी किया जा सकता है पसंद है.

3. Photoactivation

  1. हम एक Zeiss LSM 510 मेटा दो फोटॉन NLO एक tunable ब्रॉडबैंड (700 1020nm) माई ताई HP-femtosecond Spectraphysics से लेजर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करें.
  2. खुर्दबीन के नीचे एक थाली धारक पर घुड़सवार भ्रूण रखें. भ्रूण में फ्लोरोसेंट ऐतिहासिक कल्पना उद्देश्य 40x/0.8W Achroplan पानी का उपयोग डूबे है. हम 500-550nm बैंड पास फिल्टर (बीपी) के साथ गैर descanned डिटेक्टर (NDD) का उपयोग निम्न चरणों के लिए.
  3. Photoactivation प्रक्रिया के लिए एक शर्त के रूप में, सबसे उदर से दो photon 860nm लेजर तरंग दैर्ध्य (GFP पता लगाने के लिए) के साथ छवि श्रृंखला का पता चला फ्लोरोसेंट संकेत के पृष्ठीय भाग को प्राप्त करके हित के क्षेत्र के स्थानिक फ्लोरोसेंट जानकारी प्राप्त करते हैं. यह अंत करने के लिए पर्याप्त संकल्प 6μm प्रत्येक अधिग्रहीत फोकल हवाई जहाज़ के बीच के अंतराल का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
  4. लक्ष्य का चयन करेंphotoactivation के लिए z-विमान और ध्यान केंद्रित इस क्षेत्र में लाने के. प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, ब्याज की क्षेत्र में या तो के भीतर या GFP दिखाई ऐतिहासिक बाहर किया जा सकता है. इस z-विमान में एक एकल छवि ले लो. छवि सहेजें और इसे खुला रखने के एक अलग विंडो में.
  5. 720nm दो photon लेजर तरंग दैर्ध्य सेट और जब लेजर मोड बंद 'संपादन ब्लीच' मेनू खोलने में है. Photoactivation के लिए 860nm (चरण 4) में ले जाया छवि 'को परिभाषित क्षेत्र' मेनू का उपयोग कर के अनुसार ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित. यह 720nm लेजर तरंग दैर्ध्य स्थानांतरण के रूप में उत्तरार्द्ध कार्रवाई एक्स, मनाया क्षेत्र के y पदों में परिवर्तन के बाद इस छवि पर रॉय का चयन महत्वपूर्ण है.
  6. 'संपादन ब्लीच' मेनू में photoactivation के लिए निम्न पैरामीटर समायोजित (कदम 9 को देखें):) रिश्तेदार लेसर शक्ति, पुनरावृत्तियों की संख्या ख), ग) स्कैन गति.
  7. 'संपादन ब्लीच' विंडो में प्रेस 'ब्लीच' और लेजर बंद हो जाता है जब तक रुको.
  8. 860nm करने के लिए वापस जाएँ, एक एकल विमान परिणामस्वरूप photoactivated सामग्री और छवि अधिग्रहण की दूसरी श्रृंखला के लिए सक्रिय डोमेन के Z अवधि (मोटाई) मूल्यांकन की तीव्रता का मूल्यांकन करने के लिए छवि अधिग्रहण.
  9. Photoactivation के लिए निम्नलिखित मापदंडों पर विचार करें:
    1. लेजर की तीव्रता और photoactivation की अवधि: एक empirically दो मापदंडों अलग से photoactivation के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करना चाहिए. रिश्तेदार लेसर शक्ति acousto ऑप्टिक न्यूनाधिक संचरण (AOM) द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. photoactivation की अवधि के पुनरावृत्तियों की संख्या और स्कैन गति के एक समारोह है.
    2. प्रतिदीप्ति तीव्रता रैखिक सीमा निर्धारित क्रम में uncaged प्रतिदीप्ति की संतृप्ति से बचने के.
    3. प्राप्त uncaged अणुओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता और photoactivated 2 क्लोन के z-अक्ष के अंतराल के बीच एक रैखिक संबंध है.

4. Uncaged fluorescein की जांच

  1. Photoactivation के बाद, 28.5 पर अंधेरे में भ्रूण बढ़ा ° सी में E2 मध्यम 0.1% युक्त त्वचा pigmentation की उपस्थिति को रोकने के लिए PTU.
  2. वांछित विकास मंच, agarose से एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत भ्रूण को हटा दें. बताया स्केलपेल का उपयोग, एक "वी" agarose में भ्रूण के पास आकार का चीरा तो बना है कि 'वी' भ्रूण सिर की ओर इशारा कर रहा है. भ्रूण के सिर के पास 'वी' के बिंदु पर एक बंद संदंश प्लेस और धीरे से खुला भ्रूण की लंबाई के साथ agarose अलग और मध्यम में भ्रूण रिहा संदंश धक्का.
  3. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ भ्रूण लीजिए और paraformaldehyde (पीएफए, 1 x Pbs, 7.2 पीएच में 4%) के साथ ठीक या तो कमरे के तापमान पर 3 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
  4. लगानेवाला समाधान निकालें और PBST में कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए 2-3 बार कुल्ला करें.
  5. 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल के साथ भ्रूण धो, कम से कम 2 घंटे के लिए ताजा और -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल सेते साथ फिर से भरना.
  6. 80%, 60%, 40% और 20%: PBSTr में पतला मेथनॉल की एक श्रृंखला में लगातार incubations (5 मिनट प्रत्येक) द्वारा भ्रूण rehydrate. PBSTr में 2 एक्स 10 मिनट धो लें.
  7. अवरुद्ध समाधान के 500 μL में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. एक विरोधी fluorescein-alkaline फॉस्फेट (एपी) फैब टुकड़े (Roche, Palo Alto, CA, बिल्ली नहीं. 11426338910), 1:500 पतला समाधान अवरुद्ध में जोड़ें और 4 में रात सेते डिग्री सेल्सियस (जगह अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूबों) .
  9. PBST में 5 एक्स 15 मिनट धो लें.
  10. टीएनटी में 0.2M NaCl में 5 मिनट के लिए धोएं.
  11. टीएनटी में 0.4M NaCl में 5 मिनट के लिए धोएं.
  12. हौसले से तैयार Prestain समाधान में 3 एक्स 5 मिनट संतुलित करना.
  13. 2 एमएल Prestain समाधान में एक फास्ट लाल गोली (Roche, पालो अल्टो, सीए, बिल्ली. नहीं. 11496549001) भंग. यह वाटमान सं 2 कागज का उपयोग करने के लिए संयुक्त राष्ट्र भंग कणों छोड़ के समाधान को फ़िल्टर करने के लिए सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, नीचे समाधान स्पिन और स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला तरल का उपयोग.
  14. 500 μL फास्ट प्रत्येक ट्यूब करने के लिए लाल समाधान, कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं, और मॉनिटर रंग के विकास जब तक वांछित अनुपात संकेत करने के लिए पृष्ठभूमि (कई घंटे के लिए 20 मिनट) तक पहुँच जाता है जोड़ें. यदि पृष्ठभूमि में विकसित, 4 करने के लिए स्थानांतरण ° सी. ऊष्मायन के एक घंटे के बाद, एक नया फास्ट लाल धुंधला समाधान के साथ फिर से भरना.
  15. 3 एक्स 5 मिनट के द्वारा धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो PBST में washes.
  16. 4% पीएफए ​​में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक है.
  17. PBST 2 एक्स 5 मिनट में धो डालें.
  18. 25%, 50% की एक श्रृंखला और पीबीएस में 75% ग्लिसरॉल के माध्यम से साफ भ्रूण भ्रूण जब तक ट्यूब के नीचे बसे हैं. भ्रूण कुछ दिनों के लिए 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है.

5. Uncaged क्षेत्र के प्रतिदीप्त विज़ुअलाइज़ेशन

  1. बढ़ते के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार हैं: 1 एमएल सिरिंज का उपयोग स्लाइड पर स्पष्ट सिलिकॉन तेल के चार स्थानों, एक दूसरे से ~ 15mm का एक दूरी पर रखा लागू. Cente पर भ्रूण पर्वतआर ~ 200 75% ग्लिसरॉल और जगह एक coverslip (0 सं; 18x18mm) की μL में शीर्ष पर और धीरे यह सिलिकॉन के खिलाफ धक्का तक ग्लिसरॉल समाधान स्लाइड्स के बीच सतह पर.
  2. मंच पर घुड़सवार भ्रूण प्लेस और यह एक 40x उद्देश्य का उपयोग करते हुए ध्यान में लाने के. 488nm आर्गन और 543nm उत्तेजना स्रोत के रूप में HeNe लेसरों का उपयोग कर छवियों का एक confocal जेड श्रृंखला मोल.
  3. z-अक्ष photoactivatated डोमेन की अवधि uncaged एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग भ्रूण के 3D पुनर्निर्माण का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.

6. समाधान

100 x E3 174mM NaCl, 21mm KCl, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, 7.4 = पीएच. 4 में निस्पंदन और स्टोर द्वारा जीवाणुरहित डिग्री सेल्सियस
20 एक्स E2 0.3M NaCl, 10mm KCl, 20mm 2 CaCl * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, कमरे के तापमान में 3mm के.एच. 2 4 पीओ, 0.8mm ना 2 4 HPO 2HOH *, छानना और दुकान
1 एक्स E2 दोहरा आसुत जल में 20 x E2 पतला और जोड़ने के हौसले NaHCO 3 (0.7mm के अंतिम एकाग्रता के लिए), पेनिसिलीन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पतला कलम strep 1 एक्स के अंतिम एकाग्रता जो 100U पेनिसिलिन और एमएल प्रति 100mg स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen शामिल करने के लिए समाधान किया , Carlsbad, CA, बिल्ली नहीं. 15140-122.))
PBST 0.1% के बीच-20 पीबीएस में
PBSTr पीबीएस में 0.3% ट्राइटन
अवरुद्ध समाधान 10% BSA, ट्राइटन 0.3%, पीबीएस में 1% DMSO
टीएनटी 100mm Tris - एचसीएल पीएच 7.5, 150mm NaCl, दोहरा आसुत जल में 0.5% के बीच-20
Prestain समाधान 100mm Tris - एचसीएल पीएच 8.2, 0.4M NaCl, दोहरा आसुत जल में 0.1% के बीच-20

7. प्रतिनिधि परिणाम

दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग का एक उदाहरण के रहने वाले एक zebrafish भ्रूण में एजेंट photoactivate प्रस्तुत किया है. एक समान दृष्टिकोण का उपयोग हम पहले zebrafish 2,3 मस्तिष्क में photoactivated लेबल तंत्रिका progenitors के वंश का पता लगाया. Gfp रिपोर्टर transgene है, जो एक रहते हैं आंतरिक ऐतिहासिक के रूप में सेवा: चित्रा 1 zebrafish भ्रूण neurog1 ले जाने के पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट में एक बंदी fluorescein संयुग्मित ट्रेसर डाई के photoactivation से पता चलता है.

भ्रूण बंदी fluorescein के साथ एक सेल चरण में अंतःक्षिप्त थे और कली चरण में agarose में एम्बेडेड. 3 में - चरण 5 - somite स्थानिक निर्देशांक neurog1 में मापा गया: GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण uncaging (चित्रा 1 ए, ए ') के लिए ब्याज की क्षेत्र (आरओआई) को निर्धारित करने के लिए. हम तंत्रिका प्लेट (चित्रा 1 बी, बी ') के एक विशिष्ट डोमेन में fluorescein वंश ट्रेसर uncaged. बाद में, इस दी लेबल तंत्रिका पूर्वज उपडोमेन के भाग्य prim5 मंच (24 घंटे पोस्ट निषेचन) uncaged fluorescein (चित्रा 1C, सी ') के immunostaining द्वारा निर्धारित किया गया था.

दो photon लेजर uncaging की हद तक, uncaged प्रतिदीप्ति और photoactivated डोमेन (z अवधि) की मोटाई की तीव्रता यानी, दो मापदंडों का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है: लेजर की तीव्रता और अवधि. बाद चलना संख्या और स्कैन गति का समायोजन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है (भाग 3, 9 कदम देख; Russek - ब्लम, 2009). चित्रा 1 में दिखाए गए उदाहरण में, हम 12% AOM संचरण के सापेक्ष लेसर शक्ति, 20 पुनरावृत्तियों और 25.6 μsec / पिक्सेल गति स्कैन का इस्तेमाल किया. इन सेटिंग्स का उपयोग हम एक रॉय 9-10 कोशिकाओं और एक photoactivated 30μm के z अवधि (~ 1-2 सेल पंक्तियों) से युक्त लेबल.

चित्रा 1
चित्रा 1. रहते zebrafish दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग भ्रूण में बंदी fluorescein के photoactivation का एक प्रतिनिधि परिणाम .

योजनाबद्ध चित्रण (एसी) और photoactivation प्रक्रिया के प्रतिनिधि छवियों (A'- सी '). (: GFP neurog1) कि बंदी fluorescein ट्रेसर डाई के साथ एक सेल चरण में इंजेक्ट किया गया था zebrafish (ए, ए ') neurogenin-1 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP भ्रूण जीते. 3-5 - somite मंच, अग्रमस्तिष्क primordium (diencephalon) के एक असतत क्षेत्र photoactivated था और uncaged fluorescein ट्रेसर डाई (बी, बी ') पता लगाया जा सकता है. Photoactivation प्रक्रिया के बाद, भ्रूण 28.5 डिग्री सेल्सियस और मस्तिष्क uncaged fluorescein युक्त कोशिकाओं में incubated था विरोधी fluorescein immunostaining द्वारा 24 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF, सी, सी ') में पता लगाया गया. Dien, Diencephalon, दूरभाष, Telencephalon.

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Discussion

फोटो activatable यौगिकों अणुओं समारोह जिसका नकाबपोश जब तक वे एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर यूवी), एक प्रकाश रासायनिक प्रतिक्रिया है कि एक जैविक या रासायनिक रूप से सक्रिय राज्य में अणुओं धर्मान्तरित उत्प्रेरण के साथ प्रकाशित कर रहे हैं. इन जांच कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में बहुत शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं, सक्रियण के बाद से ठीक उनके प्रकाश के लिए जोखिम सीमित किया जा सकता है अस्थायी और spatially नियंत्रित.

बहु photon माइक्रोस्कोपी के महत्वपूर्ण लाभ इसकी अपेक्षाकृत गहरे ऑप्टिकल पैठ और कम nonspecific phototoxicity है. सक्रियण प्रक्रिया के लिए, कम ऊर्जा की दो फोटॉनों एक ही समय में फोटो activatable यौगिक द्वारा अवशोषित किया जाना चाहिए. एक ऐसी घटना की संभावना के रूप में फोटोन घनत्व पर निर्भर है, सक्रियण फोकल हवाई जहाज़ के लिए प्रतिबंधित है. सक्रियण क्षेत्र इसलिए चुनिंदा ऊतक के भीतर एक निर्धारित मात्रा में चालाकी से किया जा सकता है.

हम बंदी रहते zebrafish भ्रूण में दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग fluorescein के photoactivation के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान हैं. विशिष्ट उदाहरण में दिखाया के साथ साथ हम दो photon माइक्रोस्कोपी उपयोग बंदी fluorescein photolysis प्रेरित क्रम में करने के लिए जल्दी भ्रूण चरणों में कोशिकाओं को चिह्नित करने और उसके बाद विकासशील zebrafish मस्तिष्क में लेबल की कोशिकाओं के वंश का पता लगाने. लेजर और फ्लैश दीपक, जो z अक्ष 4,5 में कोशिकाओं और संकल्प की कमी के कुछ दसियों, दो photon आधारित photoactivation में ट्रेसर डाई की सक्रियण में परिणाम द्वारा photoactivation की तुलना में एक स्थानिक संकल्प तक पहुँच सकते हैं कुछ एक proximally एक करने के लिए दो सेल 2,3 पंक्तियों के axial संकल्प प्राप्त करने micrometers .

प्रक्रिया की रिपोर्ट के साथ साथ रहते नमूनों में एक एकल कोशिका संकल्प पर यौगिकों की एक किस्म के सक्रियण के लिए उपयोग किया जा सकता. उदाहरण के लिए, Kaede प्रोटीन इसी तरह एक हरे रंग से लाल fluorescenct 6,7 प्रोटीन के लिए photoconversion के बाद किया जा सकता है लेबल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया. अन्य प्रकाश सक्रिय प्रोटीन है कि लागू किया जा सकता है प्रकाश gated आयन चैनल, Channelrhodopsin, जो neuronal गतिविधि 8 और KillerRed, जो प्रकाश विकिरण 9 पर कोशिका मृत्यु लाती है जैसे photosensitizers न्यूनाधिक कर सकते हैं शामिल हैं.

बंदी के अणुओं की एक किस्म की सूचना दी गई है, शारीरिक प्रक्रियाओं के बाह्य और intracellular 10 यौगिकों के हेरफेर से मॉडुलन की अनुमति . ये, सक्रिय (11,12 ग्लूटामेट जैसे न्यूरोट्रांसमीटर) और दूसरा दूत (जैसे 13 कैल्शियम) और स्टेरॉयड हार्मोन (जैसे retinoic एसिड 14) शामिल हैं. अन्त में, जीन और zebrafish में सक्रियण मुंह बंद करने के नियंत्रण फोटो मध्यस्थता शुरू की गई है. बंदी antisense (morpholinos) oligonucleotides और RNAs के दो photon आधारित photoactivation जीन मारकर गिरा दिया और एक जीवित zebrafish भ्रूण 15,16 प्रतिबंधित सेल की आबादी में लाभ के समारोह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

संक्षेप में, दो photon आधारित रहते zebrafish भ्रूण में तस्वीर सक्रियण है: 1) दो एक्स, वाई, z axes साथ सेल पंक्तियों में सटीक एक. 2) मात्रात्मक photoactivation की हद तक नियंत्रित किया जा सकता है. 3) बहुमुखी फोटो परिवर्तनीय प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

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Acknowledgments

धन्यवाद आंकड़ा ग्राफ़िक्स के लिए Genia Brodsky कारण हैं, व्याचेस्लाव Kalchenko, डगलस Lutz, और तकनीकी सलाह और दो photon uncaging के साथ सहायता के लिए लियोनिद Roitman, Maayan Tahor और तकनीकी सहायता के लिए Suliman Elsadin, Uwe Strahle कृपया neurogenin1 संवाददाता लाइन प्रदान करने के लिए अमोस Gutnick इस पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए. इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 928/08) और हेरिएट और मार्सेल डेकर फाउंडेशन; Levkowitz प्रयोगशाला में अनुसंधान जर्मन - इजरायल फाउंडेशन (अनुदान संख्या 183/2007) के द्वारा समर्थित है. जीएल Tauro कैरियर विकास चेयर जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक अवलंबी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) Invitrogen D-3310 molecular probes
Agarose for injection trough and coated plates Sigma-Aldrich A9539
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments, Inc. TW100F-6
Micropipette puller Sutter Instrument Co. P-97
Microloader tip Eppendorf 5242 956.003
Pneumatic picopump World Precision Instruments, Inc. PV820
Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich 22290-9
Low melting point agarose for embryo mounting Ultra Pure LMP agarose 16520100
Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments Roche Group 11426338910
Fast Red Roche Group 11496549001

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References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. University of Oregon Press. (1995).
  2. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  3. Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
  4. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
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