मानव भ्रूण स्टेम सेल जनसंख्या से hepatocyte तरह प्रकोष्ठों के मजबूत पीढ़ी

Biology

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Summary

इस लेख मानव भ्रूण स्टेम सेल आबादी से मानव यकृत अन्तस्त्वक् की पीढ़ी पर ध्यान दिया जाएगा.

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Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

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Abstract

मॉडलिंग मानव दवा विषाक्तता में प्रगति के बावजूद, कई यौगिकों नैदानिक ​​परीक्षणों के दौरान unpredicted दुष्प्रभाव कारण असफल. नैदानिक ​​अध्ययन की लागत पर्याप्त हैं, इसलिए यह जरूरी है कि अधिक पेशीनगोई विष विज्ञान स्क्रीन विकसित कर रहे हैं पर जल्दी दवा के विकास (Greenhough एट अल 2010) में तैनात है. मानव hepatocytes दवा विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान सोने के मानक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन एक सीमित संसाधन है कि चर समारोह प्रदर्शन कर रहे हैं. इसलिए, अमर सेल लाइनों और पशु ऊतक मॉडल का उपयोग नियमित उनकी बहुतायत की वजह से नियोजित कर रहे हैं. जबकि दोनों स्रोतों जानकारीपूर्ण हैं, वे गरीब समारोह, प्रजातियों परिवर्तनशीलता और / या संस्कृति में अस्थिरता (Dalgetty एट अल 2009) द्वारा सीमित हैं. Pluripotent स्टेम सेल (PSCs) मानव hepatocyte की कोशिकाओं की तरह एक आकर्षक वैकल्पिक स्रोत (HLCs) (२०१० Medine एट अल) कर रहे हैं. PSCs आत्म नवीकरण और सभी दैहिक सेल वयस्क में पाया प्रकार के भेदभाव के सक्षम हैं और इस तरह का प्रतिनिधित्वविभेदित कोशिकाओं का एक संभावित अटूट स्रोत. हम एक प्रक्रिया है कि सरल, अत्यधिक कुशल स्वचालन और कार्यात्मक मानव (HLCs, फ्लेचर एट अल 2008, Hannoun एट अल 2010; पायने एट अल 2011 और सूखी घास एट अल 2011 सूखी घास एट अल 2008) की पैदावार करने के लिए उत्तरदायी है विकसित किया है. हमें विश्वास है कि हमारी प्रौद्योगिकी दवाओं की खोज, रोग मॉडलिंग, अतिरिक्त भौतिक उपकरणों के निर्माण और संभवतः सेल आधारित प्रत्यारोपण उपचार के लिए HLCs की स्केलेबल उत्पादन के लिए नेतृत्व करेंगे.

Protocol

1. सभी रासायनिक शेयरों की आरंभिक तैयारी और संस्कृति plasticware की कोटिंग

सभी कदम एक टिशू कल्चर हुड में सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाता है.

  1. मानव बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (hbFGF) की तैयारी
    1. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से 10% पीबीएस और फिल्टर में BSA समाधान तैयार करें.
    2. 10% BSA समाधान से एक 0.2% BSA समाधान तैयार करते हैं.
    3. 10 एमएल 0.2% BSA solution/100 μg hbFGF जोड़ें.
    4. पूर्व गीला 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से 5 एमएल 10% BSA समाधान फ़िल्टरिंग द्वारा फिल्टर. 10 एमएल BSA धोने त्यागें.
    5. पूर्व धोया फिल्टर के माध्यम से hbFGF फ़िल्टर.
    6. अशेष भाजक eppendorfs बाँझ -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान में hbFGF
  2. मानव एक स्टॉक समाधान Activin की तैयारी
    1. एक सिरिंज और पूर्व गीला फिल्टर में 0.2% BSA के 1 एमएल जोड़ें.
    2. Activin 0.2% BSA में 100 μg / एमएल के एक शेयर की एकाग्रता के लिए एक पतला.
    3. गतिविधियों फ़िल्टरn एक समाधान और बाँझ eppendorfs में विभाज्य, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
  3. माउस Wnt3a स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. Wnt3a के 2 μg 10 μg / एमएल के एक शेयर एकाग्रता के लिए शीशी पीबीएस के 200 μl जोड़ें.
    2. बाँझ eppendorfs और दुकान में -20 डिग्री सेल्सियस पर अशेष भाजक
  4. मानव HGF स्टॉक समाधान (1000x) की तैयारी
    1. 10 μg / एमएल के एक शेयर एकाग्रता पीबीएस में HGF पतला.
    2. HGF समाधान और बाँझ eppendorfs में विभाज्य, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान फ़िल्टर
  5. Oncostatin एम स्टॉक समाधान (1000x) की तैयारी
    1. पीबीएस में 20 μg / एमएल के एक शेयर एकाग्रता OSM पतला.
    2. OSM समाधान और बाँझ eppendorfs में विभाज्य, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान फ़िल्टर
  6. संस्कृति की कोटिंग Matrigel साथ plasticware
    1. 4 में Matrigel की 10 एमएल शेयर की बोतल रात भर पहले गला लें ° सी बर्फ और तब को DMEM के 10 एमएल जोड़ने पर. मिश्रण अच्छी तरह से ठंडा pipettes और एक दुकान का उपयोग-20 डिग्री सेल्सियस पर एमएल aliquots
    2. 4 Matrigel के एक डिग्री सेल्सियस कम से कम 2 घंटे या रातोंरात एक जेल के गठन से बचने के लिए विभाज्य पहले गला लें.
    3. Matrigel KO-DMEM ठंड के 5 एमएल जोड़ें, एक विंदुक के साथ मिश्रण अच्छी तरह से.
    4. ठंड को DMEM और एक मिश्रण का उपयोग विंदुक के साथ 15 एमएल बनाओ.
    5. थाली या कुप्पी matrigel जोड़ें करने के लिए लेपित (तालिका (i))
प्लेट फ्लास्क / वॉल्यूम / खैर या फ्लास्क
12 अच्छी तरह से थाली अच्छी तरह से प्रति 0.5 एमएल
6 अच्छी तरह से थाली अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल
25cm 2 फ्लास्क दो एमएल प्रति फ्लास्क

तालिका 1 matrigel की कोटिंग hESC संस्कृति के लिए ठेठ plasticware के लिए अनुशंसित मात्रा.

    1. लेपित थाली या कुप्पी 4 रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस या कमरेउपयोग करने से पहले 1 घंटे के लिए tempature.
    2. प्लेट्स या बोतल जो matrigel के साथ लेपित किया गया है 4 ° C में 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. वे तारीख को वे लेपित रहे थे के साथ स्पष्ट रूप से लेबल किया जाना चाहिए. एक सप्ताह के भीतर प्रयोग नहीं किया किसी भी प्लेटों या बोतल त्यागें.
      1. पहले का उपयोग लेपित संस्कृति कंटेनर एक टिशू कल्चर हुड के अंदर कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं.
      2. तुरंत पहले matrigel महाप्राण (व्यंजन) का उपयोग करने के लिए और अच्छी तरह से या कुप्पी सेल निलंबन जोड़ने.

2. HESC संस्कृतियों और लक्षण वर्णन के नियमित रखरखाव

  1. HESC लाइनों के पुनर्जीवन
    1. तरल नाइट्रोजन भंडारण से hESCs निकालें और जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल.
    2. सेल निलंबन ध्यान से एक बाँझ गर्म मध्यम के कई एमएल युक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    3. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं गोली @ 5min के लिए कम गति (1000 आरपीएम).
    4. बंद और बहुत धीरे सतह पर तैरनेवाला resus महाप्राण (व्यंजन)गर्म ES मध्यम और एक MEF फीडर परत पर बाहर थाली में कोशिकाओं लटकना.
    5. Refeed ताजा ES माध्यम से और subconfluence, कोशिकाओं पर दैनिक कोशिकाओं, कोशिकाओं passaging की आवश्यकता होती है.
  2. नियमित hESC रखरखाव
    ES कोशिकाओं प्लेटें या matrigel साथ लेपित बोतल में उगाई जाती हैं. कोशिकाओं की जांच की और खिलाया दैनिक जरूरत है:
    1. संदूषण, सेल आकारिकी और संगम के लिए खुर्दबीन के नीचे की जांच करना.
    2. खर्च मध्यम महाप्राण (व्यंजन).
    3. ताजा माउस भ्रूणीय मध्यम fibroblast वातानुकूलित (MEF - मुख्यमंत्री) + 6 मानव bFGF (अंतिम एकाग्रता 4 एनजी / एमएल) या अन्य सीरम स्वतंत्र मीडिया के एक उचित मात्रा में जोड़ें.
  3. Collagenase साथ passaging कोशिकाओं
    hESC लाइनों संगम (H1, H9 और RCM-1) हर 5-7 दिनों 01:03 विभाजन अनुपात में passaging निम्नलिखित पहुँच जाएगा. Stroma की उपस्थिति के प्रारंभिक दिनों में पारित होने hESCs धीमी बढ़ने और matrigel समय पर एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है. मानव ESCs 14 की तुलना में अब नहीं छोड़ा जाना चाहिएवही मैट्रिक्स गिरावट के कारण matrigel पर और इस उदाहरण में यह आवश्यक हो सकता है एक 1:1 या 01:02 विभाजन के अनुपात में कक्षों के पारित होने के लिए अगर कोशिकाओं subconfluent हो सकता है दिन.

    एनजाइम ऊष्मायन
    1. सभी कदम एक टिशू कल्चर हुड में सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाता है.
    2. सुनिश्चित करें कि वहाँ एक नया matrigel लेपित डिश या कुप्पी के रूप में 1.6 प्रति अनुभाग तैयार है.
    3. कोशिकाओं के लिए इच्छित विभाजन अनुपात पर तय करो. कारकों की एक संख्या विभाजन अनुपात तय करने में शामिल हैं:
      1. कालोनियों की कम संख्या के साथ stroma के उच्च स्तर: एक छोटे से अच्छी तरह से आकार करने के लिए वापस passaged कर सकते हैं या 1:01 जो कुछ stroma से छुटकारा पाने के लिए और इस तरह stroma अनुपात करने के लिए कॉलोनी में वृद्धि, hESC विकास को बढ़ावा देने passaged किया जा सकता है.
      2. Stroma के बड़े कालोनियों के साथ उच्च स्तर पर, कालोनियों की संख्या पर निर्भर करता है, 1:1 या 01:02 passaged किया जा सकता है अगर वहाँ पर्याप्त बड़ी hESC कालोनियों कर रहे हैं.
      3. एक छोटे से str के साथ विशिष्ट बढ़ रही hESCsओमा या नहीं stroma और / या कुछ भेदभाव 1:02 या 3 passaged किया जा सकता है.
      4. मीडिया अच्छी तरह से या कुप्पी से महाप्राण (व्यंजन).
      5. 2 MLS पीबीएस (MgCl - 2, - CaCl 2) के साथ एक बार धोएं .
      6. Collagenase का एक उचित मात्रा (200 यू / एमएल KO-DMEM में पतला) जोड़ें और 37 में सेते ° 2-5 मिनट के लिए सी. 2 मिनट से आगे खुर्दबीन (1 मिनट के अंतराल) के अंतर्गत नियमित रूप से जांच. बिंदु पर विभेदित कोशिकाओं को बंद लिफ्ट शुरू और कालोनियों बढ़त कोशिकाओं को passaged बनने के लिए तैयार हैं लिफ्ट शुरू.
    Scraping और hESCs Pooling
      1. Collagenase महाप्राण (व्यंजन).
      2. 2 MLS पीबीएस (MgCl - 2, - CaCl 2) के साथ एक बार धोएं .
      3. MEF - मुख्यमंत्री विभाजन अनुपात के आधार पर, और शारीरिक रूप से अच्छी तरह से या कुप्पी की सतह से कोशिकाओं को हटाने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग कर के एक उचित मात्रा में जोड़ें, तो जनरल महीन चुर्ण बनानाtly ऊपर और नीचे 2-3 बार एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग pipetting द्वारा. यह महत्वपूर्ण है कि hESCs कोशिकाओं के clumps में रखा जाता है और एकल कक्षों में टूट रहे हैं नहीं है.
    HESCs Replating
      1. नए matrigel लेपित बोतल या कुओं पर जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन Replate.
      2. 6 अच्छी तरह से एक थाली के लिए एक अच्छी तरह से 4 एमएल MEF - मुख्यमंत्री की मात्रा.
      3. जब इनक्यूबेटर घबरा देना में कोशिकाओं रखकर टिशू कल्चर कंटेनर के रूप में संभव कालोनियों के एक वितरण के रूप में भी यह सुनिश्चित करने के लिए के रूप में कालोनियों थाली / फ्लास्क सेल replating और भेदभाव को प्रभावित टिशू कल्चर के केंद्र में व्यवस्थित करते हैं.
  4. प्रवाह cytometry द्वारा hESC आबादी की दिनचर्या लक्षण वर्णन
    1. hESC आबादी 3 / 4 अक्तूबर, 1-60 Tra और SSEA-4 के रूप में स्टेम सेल मार्कर के लिए एक महीने में एक बार प्रवाह cytometry के माध्यम से जांच कर रहे हैं.
    2. hESCआबादी उनके सब्सट्रेट से हटा रहे हैं के रूप में एकल कक्ष निलंबन trypsin / EDTA (Invitrogen) के साथ एक 5 मिनट के इलाज के बाद.
    3. 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल पीबीएस में में 0.1% BSA और 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक पर एकल कक्षों Resuspend.
    4. 4 ° C पर 40 मिनट के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ सेल की तैयारियाँ सेते हैं.
    5. पीबीएस में 0.1% BSA और 0.1% सोडियम azide अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने और 100 μL के अंतिम मात्रा resuspend और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के साथ पूरक के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
    6. 30000-40000 "जी" घटनाओं के लिए डेटा प्रत्येक FACS कैलिबर 488 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित कोशिकामापी का उपयोग नमूने के लिए अधिग्रहीत कर रहे हैं और CellQuest सॉफ्टवेयर (Becton Dickinson, सैन जोस, CA) विश्लेषण का उपयोग कर. बेदाग कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में शामिल हैं. मलबे के साथ साथ मृत और apoptotic कोशिकाओं आगे तितर बितर और साइड स्कैटर मापदंडों पर एक इलेक्ट्रॉनिक रहते गेट का उपयोग विश्लेषण से बाहर रखा गया है.

3. DifferentihESCs के यकृत अन्तस्त्वक् के लिए समझना

  1. यकृत अन्तस्त्वक् hESCs के भेदभाव के लिए मीडिया की तैयारी. सभी मीडिया तैयारी एक टिशू कल्चर हुड में बाहर चाहिए सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाता है.
    1. RPMI की तैयारी: B27 अन्तस्त्वक् भेदभाव के लिए भड़काना मध्यम
      1. RPMI B27 मध्यम, मिश्रण RPMI 1640 (500 एमएल) और B27 (50x, 10 एमएल) के लिए
      2. भंवर घटक मिश्रण.
      3. एक फिल्टर यूनिट और 4 बजे के तहत निर्वात, दुकान फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस करने के लिए सभी घटकों जोड़ें
    2. Hepatocyte भेदभाव के लिए SR-DMSO के माध्यम की तैयारी
      1. SR-DMSO के माध्यम के लिए, 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0.5 एल glutamine%, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 0.1mm β Mercaptoethanol और 1% DMSO के मिश्रण.
      2. 4 में vacum के तहत समाधान, स्टोर फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस और विभाज्य की दुकान और -20 डिग्री सेल्सियस पर यदि आवश्यक हो.
      3. 4 के प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से एक थाली, एमएल, और T25 फ्लास्क 6 प्रतिशत एमएल का प्रयोग करें.
    3. L15 HEPA के लिए मध्यम परिपक्वता की तैयारीtocyte परिपक्वता
      1. के लिए L-15 मध्यम, मिश्रण 500 एमएल लेबोविट्ज़ एल 15-मध्यम, tryptose फॉस्फेट शोरबा (अंतिम एकाग्रता 8.3%), निष्क्रिय गर्मी भ्रूण गोजातीय सीरम (अंतिम एकाग्रता 8.3%), 10 सुक्ष्ममापी hydrocortisone 21-hemisuccinate, 1 सुक्ष्ममापी इंसुलिन (गोजातीय अग्न्याशय ), 1% एल Glutamine, 0.2% ascorbic एसिड.
      2. 4 में vacum के तहत समाधान, स्टोर फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस और विभाज्य की दुकान और -20 डिग्री सेल्सियस पर यदि आवश्यक हो.
    4. अंतिम RPMI की तैयारी: B27 भड़काना मध्यम
      1. प्रयोग (1 6 अच्छी तरह से एक थाली के साथ प्रति एमएल, और T25 फ्लास्क प्रति 2 एमएल) के लिए भड़काना माध्यम से आवश्यक मात्रा बग़ैर.
      2. 100 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक Activin जोड़ें.
      3. 50 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पुनः संयोजक Wnt3a जोड़ें.
      4. अच्छी तरह मिक्स और मीडिया अब इस्तेमाल के लिए तैयार है.
      5. यह अंतिम मीडिया प्रत्येक दिन के ताजा बनी होनी चाहिए.
    5. अंतिम एल 15 परिपक्वता माध्यम की तैयारी
      1. आवश्यक बांटनाL-15 मध्यम के प्रयोग के लिए मात्रा (4 6 अच्छी तरह से एक थाली के साथ प्रति एमएल, और T25 फ्लास्क 6 प्रतिशत एमएल).
      2. 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता HGF जोड़ें.
      3. 20 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता OSM जोड़ें.
      4. अच्छी तरह मिक्स और मीडिया अब इस्तेमाल के लिए तैयार है.
      5. यह अंतिम मीडिया प्रत्येक दिन के ताजा बनी होनी चाहिए.
  2. निश्चित अन्तस्त्वक् भड़काना hESCs
    1. संस्कृति hESCs (H1, H9 और RCM-1) और माउस भ्रूण fibroblast MEF मुख्यमंत्री bFGF के साथ पूरक के साथ matrigel लेपित प्लेट पर प्रचार.
    2. यकृत भेदभाव आरंभ करें जब hESCs भड़काना मध्यम के साथ MEF मुख्यमंत्री (RPMI 1640 B27 100 एनजी / एमएल Activin एक और 50 एनजी / एमएल के साथ पूरक की जगह -60% (hESC लाइन पर निर्भर करता है) लगभग 30% की एक confluency स्तर तक पहुँचने Wnt3a.
    3. कोशिकाओं को भड़काना मध्यम में 3 दिन (मध्यम हर 24 घंटे में बदल) के लिए संवर्धित कर रहे हैं, और Activin एक और Wnt3a के साथ अंतिम भड़काना मध्यम प्रत्येक दिन किया जाता है ताजा.
    4. दिन 8 संस्कृति से कम परिपक्वता और रखरखाव के माध्यम से कोशिकाओं (एल 15) 9 दिन (हर 48 घंटे मध्यम बदलने) के लिए 10 एनजी / एमएल hHGF और 20 एनजी / एमएल OSM के साथ पूरक. HHGF और OSM के साथ परिपक्वता और रखरखाव मध्यम प्रत्येक दिन नए सिरे से बनाया है.
    5. कोशिकाओं को धीरे - धीरे एक काँटेदार / त्रिकोणीय आकार से एक विशेषता जिगर आकारिकी एक polygonal उपस्थिति (2A चित्रा) प्रदर्शित करने के लिए morphological परिवर्तन दिखा रहे हैं.
    6. Hepato सेलुलर भेदभाव के लिए योजनाबद्ध:

4. HESC व्युत्पन्न यकृत अन्तस्त्वक् के Characterisation

  1. Immunostaining
    1. HESC व्युत्पन्न HLCs पीबीएस दो बार, 1 मिनट प्रत्येक धोने के साथ धोएं.
    2. HLCs 4% पीएफए ​​के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए, ठीक करें (सेलएस 4 ° C में पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है है और एक बाद की तारीख पर दाग). कोशिकाओं को भी -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए बर्फ का ठंडा मेथनॉल के साथ तय किया जा सकता है
    3. Pbs, 5 मिनट प्रत्येक धोने के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
    4. परमाणु धुंधला हो जाना (इस कदम अगर मेथनॉल निर्धारण प्रयोग किया जाता है की आवश्यकता नहीं है) के लिए 100% इथेनॉल के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    5. Pbs, 5 मिनट प्रत्येक धोने के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
    6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस / टी (0.1% के बीच) / 10% BSA के साथ कोशिकाओं ब्लॉक.
    7. अवरुद्ध बफर निकालें और संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी / पीबीएस टी (0.1% के बीच) / BSA 1% और सेते में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पतला जोड़ने के लिए, या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस आंदोलन के साथ.
    8. कोशिकाओं पीबीएस / टी (0.1% के बीच) / कमरे के तापमान पर 1% BSA, 5 मिनट प्रत्येक धोने के साथ 3 बार धोएं.
    9. उपयुक्त माध्यमिक Alexa Fluor (1:400) प्रतिरक्षी कोशिकाओं और आंदोलन के साथ अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते पीबीएस में पतला जोड़ें. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक धो धो लें.
    10. 4-88 MOWIOL और DAPI (1:1000) के साथ एक अच्छी तरह से माउंट. एक कवर पर्ची के साथ अच्छी तरह से कवर, coverslip धीरे दबाने करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं और 4 बजे दुकान ° C अंधेरे में.
  2. शाही सेना अलगाव और निष्कर्षण
    1. पीबीएस और महाप्राण (व्यंजन) के साथ hESC व्युत्पन्न HLCs धो लें.
    2. TRIZOL अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. परिमार्जन 1.5 एमएल Eppendorf (-80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस के लिए बाद में उपयोग यदि आवश्यक) में कोशिकाओं और जगह.
    4. Inverting द्वारा Eppendorf और मिश्रण करने के लिए क्लोरोफॉर्म की 0.5 एमएल जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि यह एक धूआं हुड में किया जाता है.
    5. 15 मिनट के लिए 13,000 RPM में 4 बजे समाधान अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    6. एक साफ Eppendorf में जलीय परत और जगह ले लीजिए, सुनिश्चित करें कि वहाँ इंटरफ़ेस से कोई संदूषण है.
    7. Inverting द्वारा isopropanol के 1 एमएल और मिश्रण जोड़ें, precipi से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ देंशाही सेना टेट.
    8. 4 में 10 मिनट के लिए 13,000 RPM में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    9. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और आरएनए गोली परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें. 70% इथेनॉल 0.5 एमएल के साथ धो और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
    10. 4 में 5 मिनट के लिए 8,000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    11. इथेनॉल महाप्राण (व्यंजन) और 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखे छोड़.
    12. एक बार सभी इथेनॉल सुखाया गया है, deionised पानी के 30 μl में गोली resuspend. -80 में शाही सेना स्टोर डिग्री सेल्सियस बाद में उपयोग के लिए.
    13. शाही सेना एकाग्रता का उपयोग कर एक nanodrop यों.
  3. रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर
    1. एक पहले से पृथक (200 एनजी) शाही सेना, यादृच्छिक hexamers, nucleotides (10mm) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और एक पतली दीवारों 0.5 एमएल Eppendorf में संबंधित बफर का उपयोग प्रतिक्रिया सेट.
    2. सेट एक नकारात्मक आरटी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के बिना ऊपर प्रतिक्रिया.
    3. एक थर्मामीटरों cycler, पीसीआर मशीन में ट्यूबों प्लेस, और निम्नलिखित p सेटrogram:
      1. 37 ° C - 5 मिनट (1 चक्र)
      2. 1 घंटा (1 चक्र) - 42 डिग्री सेल्सियस
      3. 95 डिग्री सेल्सियस - 5 मिनट (1 चक्र)
    4. -20 डिग्री सेल्सियस पर यदि आवश्यक बाद में उपयोग के लिए सीडीएनए स्टोर.
  4. TaqMan मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन हार्वेस्ट भेदभाव प्रोटोकॉल भर में अलग अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं. शाही सेना निकालें और रिवर्स प्रतिलेखन qPCR ले मांग पर निम्नलिखित प्राइमरों और परख (एप्लाइड Biosystems) प्रोटोकॉल का उपयोग:
    1. 4 Hs03005111_g1 अक्टूबर
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumin Hs00910225_m1
    4. अल्फा fetoprotein Hs00173490_m1

शाही सेना अलगाव और निष्कर्षण कृपया के लिए खंड 3.3.2 देखें

  1. रिवर्स प्रतिलेखन और TaqMan qPCR
    1. शाही सेना के एक μg लो और सीडीएनए नक़ल रिवर्स Invitrogen सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स प्रतिलेखन का उपयोगकिट, निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
    2. सीडीएनए के एक 25 μl TaqMan एप्लाइड Biosystems, 18s ribosomal नियंत्रण प्राइमरों और Invitrogen 2x प्लेटिनम rox के साथ qPCR supermix UDG से उपयुक्त प्राइमरों और पानी की एक उचित मात्रा से मिलकर प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया 1 μl.
    3. अच्छी तरह मिक्स और या तो एक 96 या 384 अच्छी तरह से qPCR थाली के दो कुओं में प्रत्येक नमूना के 10 μl जगह.
    4. एक बार सभी नमूनों लोड कर रहे हैं, अधिक उपयुक्त नियंत्रण), थाली मुहर और एप्लाइड Biosystems 7900HT TaqMan मशीन पर विश्लेषण.
    5. परिणाम एक नियंत्रण नमूना पर रिश्तेदार अभिव्यक्ति के रूप में व्यक्त कर रहे हैं.
  1. - HESC व्युत्पन्न यकृत अन्तस्त्वक् के कार्यात्मक विश्लेषण P450 Assays साइटोक्रोम http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. सेते दिन 17 hESC महामहिम 37 डिग्री सेल्सियस (n = 3) में 5 घंटे के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट के साथ निकाली गई. एक के रूप में टिशू कल्चर मीडिया का उपयोग करेंनकारात्मक और 37 पर नियंत्रण सेते ° सी 5 घंटे के लिए.
    2. Supernatants लीजिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख ले.
    3. बेसल गतिविधि के रिश्तेदार का स्तर मापने के लिए और के रूप में बीसीए परख (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101) द्वारा निर्धारित मिलीग्राम प्रति प्रोटीन के लिए सामान्य है.

नोट्स

  1. सभी संस्करणों 6 अच्छी तरह से एक थाली प्रारूप पर आधारित हैं. आवश्यक थाली या कुप्पी के लिए संस्करणों तदनुसार समायोजित करें.
  2. सभी भड़काना, भेदभाव, और परिपक्वता के माध्यम वैक्यूम के अंतर्गत प्रयोग करने से पहले फ़िल्टर्ड है.
  3. भड़काना, भेदभाव, और परिपक्वता के माध्यम 4 में संग्रहीत है ° सी 2 सप्ताह की तुलना में अब नहीं के लिए. आकलन कितना मध्यम प्रयोग विभाज्य और शेष मीडिया और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस की दुकान में के लिए आवश्यक है.
  4. Matrigel निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है, 1 एमएल aliquots उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  5. Growth एक बार बना और aliquoted कारकों -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और जब thawed 4 में संग्रहीत किया जा सकता है है ° सी के लिए 2 सप्ताह की तुलना में अब नहीं.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी आमतौर पर hESC व्युत्पन्न HLCs विशेषताएँ किया albumin (1:250, सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO).

5. प्रतिनिधि परिणाम:

HESCs के Characterisation पहले यकृत भेदभाव को बनाए रखा

H9 अध्ययन में इस्तेमाल hESCs के स्टेम सेल की स्थिति विशेषताएँ क्रम में हम मानकों का एक नंबर का अध्ययन किया. कोशिकाओं hESC आकारिकी, छोटे कसकर बांध परिभाषित कालोनियों (चित्रा 1 ए) में बढ़ कोशिकाओं का प्रदर्शन किया और pluripotent स्टेम सेल जीन मार्कर, Oct-3 / 4 और Nanog (चित्रा 1 बी) व्यक्त किया. हम H7 hESC लाइन सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में इन जीनों की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण मतभेद नहीं मिला. इसके अतिरिक्त, hESCs जनसंख्या का 90.1% स्टेम सेल मार्कर SSEA 4 (चित्रा 1C) के लिए सकारात्मक था.

वहयकृत अन्तस्त्वक् करने के लिए अनुसूचित जाति भेदभाव

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं कुशलतापूर्वक इन विट्रो में यकृत अन्तस्त्वक् (सूखी घास एट अल 2008) से विभेदित किया जा सकता है . भेदभाव के 9 दिन में, कोशिकाओं काटा गया और HLCs के लिए hESC के भेदभाव मूल्यांकन किया गया था. जैसा कि पहले बताया hESCs गहरा morphological परिवर्तन की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया, और 9 दिन से, जल्दी hepatocyte एक polygonal उपस्थिति (2A चित्रा) के विकास आकारिकी का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, Oct-3 / 4 के 9 दिन का समय कोर्स पर downregulation (चित्रा 2B) मनाया गया. इसके विपरीत, जिगर टेप एएफपी और albumin दिन 7 के बाद से विनियमित (चित्रा 2C) थे.

यकृत अन्तस्त्वक् की इन विट्रो परिपक्वता में

यकृत अन्तस्त्वक् इन विट्रो में परिपक्व की स्थापना की प्रक्रिया (सूखी घास एट अल 2008) का उपयोग किया गया था . भेदभाव संस्कृतियों के अंतिम दिन में मानव यकृत albumin, एएफपी, और ई cadherin मार्करों के लिए immunostained थे. हमारी का उपयोग HLCs की उपज प्रक्रिया आम तौर पर 90% (, Hanoun एट अल 2010, पायने एट अल 2011 सूखी घास एट अल 2008) है. HLCs albumin, अल्फा fetoprotein और ई cadherin (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक दाग.

चित्रा 1
चित्रा 1. इस अध्ययन में इस्तेमाल hESCs के Characterisation. (ए) चरण hESC आकारिकी के विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों प्रतिनिधि 4x और 10x बढ़ाई संस्कृति में मनाया. छवियों को एक Nikon / TE3000 यू उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर (बी) सुसंस्कृत hESCs Octamer (Oct-3 / 4) सकारात्मक और Nanog सकारात्मक कब्जा कर लिया गया. H7 hESCs pluripotency जीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. सापेक्ष अभिव्यक्ति अंतर्जात जीन नियंत्रण के साथ तुलना प्रेरण की सिलवटों को संदर्भित करता है, β 2 - microglobulin (सी) FACS भूखंडों hESC सतह मार्कर मंच विशिष्ट भ्रूण प्रतिजनों 4 SSEA सहित अभिव्यक्ति के स्तर, दिखाने के.

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चित्रा 2. (ए) hESC व्युत्पन्न संस्कृति में मनाया भेदभाव के 9 दिन में यकृत अन्तस्त्वक् आकारिकी के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी प्रतिनिधि छवियाँ, x4 और x10 बढ़ाई (बी) जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की विशेषता है . आरएनए निकाला था और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा सीडीएनए विश्लेषण किया गया था, undifferentiated सेल जीन अभिव्यक्ति के प्रगतिशील downregulation (Oct-3 / 4) और (सी) hepatocyte जीन अभिव्यक्ति की upregulation (albumin और α-fetoprotein) दिखा. सापेक्ष अभिव्यक्ति अंतर्जात जीन नियंत्रण, भेदभाव के 0 दिन में β-2-microglobulin के साथ तुलना प्रेरण की सिलवटों को संदर्भित करता है. <0.05 पी चिह्नित है * और पी <.001 टी परीक्षण के छात्रों द्वारा मापा *** 0 दिन में hESCs की तुलना में चिह्नित है. त्रुटि सलाखों 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. ChhESC व्युत्पन्न यकृत अन्तस्त्वक् के aracterisation
Hepatocyte मार्करों, albumin, एएफपी, और hESC में ई cadherin (H9) व्युत्पन्न यकृत अन्तस्त्वक् की अभिव्यक्ति दिखा Immunocytochemistry. नकारात्मक नियंत्रण इसी immunoglobulin (आईजीजी) जी और चित्र दिखाया प्रतिनिधियों के साथ प्रदर्शन किया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4. HESC (H9) व्युत्पन्न HLCs चयापचय गतिविधि दिखा रहे हैं. 17 दिन, H9 HLCs विभेदित पर CYP3A चयापचय गतिविधि (n = 6) का प्रदर्शन किया.

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Discussion

हम एक सरल, सजातीय और इन विट्रो में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव HLCs स्केलेबल स्तर उत्पन्न मॉडल विकसित किया है. हमारे मॉडल बाहरी सहयोग प्रयोगशालाओं के एक नंबर के द्वारा मान्य किया गया है. हम नियमित रूप से स्टेम सेल व्युत्पन्न विकास मार्करों और जिगर विशिष्ट कार्यात्मक assays (जिनमें से अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं) के घर उपकरण बॉक्स में हमारी का उपयोग HLCs विशेषताएँ. स्टेम pluripotency सेल के रखरखाव, निश्चित अन्तस्त्वक् स्टेम सेल भेदभाव को सीधा करने की क्षमता, यकृत अन्तस्त्वक् के सजातीय संस्कृतियों के विनिर्देश और क्षमता परिपक्व यकृत अन्तस्त्वक् प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में व्यापक रेंज समारोह प्रदर्शन: हमारे प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों रहे हैं .

एक स्टेम सेल व्युत्पन्न एचएलसी प्रौद्योगिकी का बड़े पैमाने पर तैनाती के लिए सीमा संस्कृति में परिपक्व यकृत अन्तस्त्वक् (~ matrigel पर 4 दिन) के अल्पकालिक विभेदित समारोह किया गया है. जैसे हम एक बहुलक जांचजैव सक्रिय और उपन्यास सेलुलर का समर्थन करता है के लिए पुस्तकालय. यह एक उपन्यास का समर्थन है जो कम से कम 15 दिनों के लिए यकृत समारोह का कहना है की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया गया है. इस प्रौद्योगिकी के लिए भविष्य दिशाओं के शुरू में दवाओं की खोज की प्रक्रिया में औद्योगिक अनुप्रयोग (सूखी घास एट अल 2011) हैं. मध्यावधि लाभ के रूप में इस तकनीक humanised ब्रिजिंग या जिगर की बीमारी के इलाज के साथ रोगियों के लिए अतिरिक्त मूर्त जिगर समर्थन उपकरणों के होने की संभावना हैं. इस तकनीक से लंबी अवधि के लाभ के जिगर की बीमारी के लिए सेल आधारित प्रत्यारोपण चिकित्सा में, लेकिन मौजूदा डेटा दर्शाता सकता है कि इस रणनीति का महत्वपूर्ण प्रयास की आवश्यकता है पहले यह क्लिनिक (पायने एट अल 2011) में सुरक्षित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है.

अंत में, इन विट्रो प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हमारे महत्व लागू जीव विज्ञान के लिए उच्च विश्वस्तता मानव HLCs के सजातीय और असीम संस्कृतियों को उत्पन्न करने की क्षमता है .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

डॉ. सूखी घास का एक RCUK फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, डॉ. पश्चिम सर्जरी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था, डॉ. Medine BHF कोर कोष से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, श्री Lucendo Villarin Baltasar MRC पीएचडी Studenship द्वारा समर्थित किया गया. डॉ. झोउ चीनी सरकार की ओर से एक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

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References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
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  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
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  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

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