Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Biology

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Summary

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

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Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

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Abstract

Malgré les progrès dans la toxicité des médicaments de modélisation humaine, de nombreux composés échouent lors des essais cliniques en raison d'effets secondaires imprévus. Le coût des études cliniques sont considérables, il est donc essentiel que plusieurs écrans toxicologie prédictive sont développées et déployées au début du développement de médicaments (Greenhough et al 2010). Hépatocytes humains représentent le modèle actuel de l'or standard pour évaluer la toxicité des médicaments, mais ils sont une ressource limitée qui présentent fonction variable. Par conséquent, l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées et des modèles de tissus animaux sont couramment employées en raison de leur abondance. Alors que les deux sources sont informatifs, ils sont limités par la fonction pauvres, la variabilité des espèces et / ou d'instabilité dans la culture (Dalgetty et al 2009). Les cellules souches pluripotentes (PSC) sont une source intéressante alternative d'hépatocytes humains comme des cellules (CLH) (Medine et al 2010). CPP sont capables d'autorenouvellement et de différenciation à tous les types de cellules somatiques dans l'adulte et représentent ainsiune source potentiellement inépuisable de cellules différenciées. Nous avons développé une procédure qui est simple, très efficace, se prêtent à l'automatisation et les rendements fonctionnels CLH humaine (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 et Hay et al 2011). Nous croyons que notre technologie peut conduire à la production évolutive de CLH pour la découverte de médicaments, la modélisation des maladies, la construction d'appareils extra-corporelle et, éventuellement, les thérapies cellulaires de transplantation base.

Protocol

1. La préparation initiale de tous les stocks de produits chimiques et le revêtement de la culture en matière plastique

Toutes les étapes à réaliser dans une hotte de culture de tissus dans des conditions aseptiques.

  1. Préparation du facteur humain de croissance fibroblastique basique (hbFGF)
    1. Préparer une solution BSA 10% dans le PBS et filtrer à travers un filtre de 0,22 um.
    2. De la solution à 10% de BSA préparer une solution à 0,2% de BSA.
    3. Ajouter 10 ml hbFGF 0,2% de BSA mg solution/100.
    4. Pré-humide, un filtre de 0,22 um en filtrant 5 ml de solution de BSA à 10% à travers le filtre. Jeter les 10 ml de BSA lavage.
    5. Filtrer le hbFGF à travers le filtre pré-lavés.
    6. Aliquoter l'hbFGF dans eppendorfs stériles et conserver à -20 ° C.
  2. Préparation de l'activine homme d'une solution stock
    1. Ajouter 1 mL de BSA à 0,2% dans une seringue pré et mouiller le filtre.
    2. Diluer l'activine A 0,2% de BSA à une concentration stock de 100 pg / mL.
    3. Filtrer les Activin Une solution aliquote dans eppendorfs stérile, conserver à -20 ° C.
  3. Préparation de la solution stock Souris Wnt3a
    1. Ajouter 200 pi de PBS dans un flacon de 2 pg Wnt3a à une concentration stock de 10 pg / mL.
    2. Aliquote dans eppendorfs stériles et conserver à -20 ° C.
  4. Préparation de la solution stock Human HGF (1000X)
    1. Diluer l'HGF dans du PBS à une concentration stock de 10 pg / mL.
    2. Filtrer la solution HGF et aliquote dans eppendorfs stérile, conserver à -20 ° C.
  5. Préparation de la solution stock oncostatine M (1000X)
    1. Diluer l'OSM dans le PBS à une concentration des stocks de 20 ug / ml.
    2. Filtrer la solution de l'OSM et de l'aliquote pour eppendorfs stérile, conserver à -20 ° C.
  6. Revêtement de la culture en matière plastique avec Matrigel
    1. Décongeler le flacon de 10 ml stock de Matrigel nuit à 4 ° C sur la glace, puis ajouter 10 ml de DMEM-KO. Mélangez bien l'aide de pipettes réfrigérée et de stocker unealiquotes ml à -20 ° C.
    2. Dégeler une aliquote de Matrigel à 4 ° C pendant au moins 2 heures ou jusqu'au lendemain pour éviter la formation d'un gel.
    3. Ajouter 5 ml de DMEM froid KO-le Matrigel, bien mélanger avec une pipette.
    4. Compléter à 15 ml avec le froid KO-DMEM et mélanger à l'aide d'une pipette.
    5. Ajouter matrigel à la plaque ou flacon à revêtir (Tableau (i))
Plate / Flask Volume / puits ou Flask
De 12 puits Plaque 0,5 ml par puits
6-même la plaque 1 ml par puits
25cm 2 flacon 2 ml par flacon

Tableau 1. Volumes recommandés pour le revêtement de Matrigel en matière plastique typiques pour la culture des CSEh.

    1. Incuber la plaque revêtue ou flacon nuit à 4 ° C ou la salletempature pendant 1 heure avant utilisation.
    2. Plaques ou flacons qui ont été enduits de Matrigel peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 semaine. Ils doivent être clairement étiquetés avec la date à laquelle ils ont été enduits. Jeter tout plaques ou des flacons non utilisés dans une semaine.
      1. Avant utilisation permettent au conteneur de culture revêtues de venir à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.
      2. Immédiatement avant utilisation aspirer le Matrigel et ajouter la suspension de cellules pour le bien ou le flacon.

2. L'entretien courant des cultures de CSEh et la caractérisation

  1. La réanimation des lignées de CSEh
    1. Retirer les CSEh à partir de stockage d'azote liquide et rapidement dégel dans un bain d'eau à 37 ° C.
    2. Transférer la suspension cellulaire avec soin pour un tube stérile contenant quelques millilitres de milieu chaud.
    3. Pellet les cellules par centrifugation @ basse vitesse pendant 5min (1000 RPM).
    4. Aspirer le surnageant Resus et très doucementPend les cellules ES dans un milieu chaud et la plaque sur une couche nourricière MEF.
    5. Réalimenter les cellules ES moyennes quotidiennes avec fraîcheur et à la sous-confluence, les cellules, les cellules ont besoin de repiquage.
  2. L'entretien de routine de CSEh
    Les cellules ES sont cultivées sur des plaques ou des flacons enduits de Matrigel. Les cellules doivent être examinés et nourris tous les jours:
    1. Examiner au microscope pour la contamination, cellule de la morphologie et la confluence.
    2. Aspirer le milieu épuisé.
    3. Ajouter un volume approprié de fibroblastes embryonnaires de souris fraîche milieu conditionné (MEF-CM) + bFGF humain (concentration finale de 4 ng / ml) ou d'autres milieux exempts de sérum 6.
  3. Le repiquage des cellules avec de la collagénase
    les lignées de CSEh (H1, H9 et MRC-1) atteindra confluent tous les 5-7 jours suivants repiquage à un rapport de division 1:3. CSEh passage précoce en présence du stroma croissance plus lente et le temps sur le matrigel peut devenir un facteur important. CES homme ne doit pas être laissé plus de 14jours sur le matrigel mêmes en raison de la dégradation de la matrice et dans ce cas, il peut être nécessaire pour le passage des cellules à un ratio de 1:1 ou 1:2 divisée si les cellules sont subconfluentes.

    Incubation enzymatique
    1. Toutes les étapes à réaliser dans une hotte de culture de tissus dans des conditions aseptiques.
    2. S'assurer qu'il ya un plat matrigel nouveaux enduits ou flacon préparés conformément à la section 1.6.
    3. Décidez du rapport de division souhaitée pour les cellules. Un certain nombre de facteurs sont impliqués dans les décisions du rapport de division:
      1. Haut niveau de stroma avec un faible nombre de colonies: peut être repiquées revenir à une taille plus petite bien ou peut être passé 1h01 qui vous débarrasser de certains stroma et d'accroître ainsi la colonie ratio stroma, la promotion de la croissance de CSEh.
      2. Haut niveau de stroma avec de grandes colonies, en fonction du nombre de colonies, peuvent être repiquées 1:1 ou 1:2, si il ya des colonies de CSEh assez grand.
      3. Typiques CSEh en croissance avec un peu d'stroma ou pas stroma et / ou une certaine différenciation peut être passé 1h02 ou 3.
      4. Aspirer les médias à partir du puits ou le flacon.
      5. Laver une fois avec 2 ml de PBS (-MgCl 2, CaCl-2).
      6. Ajouter un volume approprié de la collagénase (200 U / ml diluée dans du DMEM-KO) et incuber à 37 ° C pendant 2-5 min. Du 2 minutes dès examiner régulièrement sous le microscope (1 minute d'intervalle). Au point les cellules différenciées de commencer à décoller et les colonies commencent à lever sur le bord des cellules sont prêtes à être repiquées.
    Grattage et mise en commun des CSEh
      1. Aspirer la collagénase.
      2. Laver une fois avec 2 ml de PBS (-MgCl 2, CaCl-2).
      3. Ajouter un volume approprié de MEF-CM selon le rapport de division, et en utilisant un grattoir à cellules supprimer physiquement les cellules de la surface du puits ou du flacon, puis triturer GenTLY par aspiration et refoulement 2-3 fois à l'aide d'une pipette de 10 mL. Il est important que les CSEh sont conservés dans des amas de cellules et ne sont pas divisés en cellules individuelles.
    Replating l'CSEh
      1. Replate la suspension de cellules résultant sur les flacons matrigel nouveaux enduits ou des puits.
      2. Faire le volume du MEF-CM jusqu'à 4 ml pour un puits d'une plaque à 6 puits.
      3. En plaçant les cellules dans la pépinière agiter le récipient de culture de tissus pour assurer aussi uniforme que possible une répartition des colonies que les colonies ont tendance à s'installer dans le centre de la plaque de culture de tissus / flacon affectent replating et la différenciation cellulaire.
  4. La caractérisation de routine des populations CSEh par cytométrie en flux
    1. populations de CSEh sont examinés par cytométrie en flux une fois par mois pour les marqueurs de cellules souches telles que le 3 octobre / 4, Tra 1-60, SSEA-4.
    2. CSEhles populations sont retirés de leur substrat sous forme de suspensions cellulaires simples après un traitement de 5 minutes avec la trypsine / EDTA (Invitrogen).
    3. Resuspendre les cellules unique à 1x10 6 cellules / ml dans du PBS additionné de 0,1% de BSA et de l'azoture de sodium à 0,1%.
    4. Incuber les préparations de cellules à 4 ° C avec les anticorps appropriés pendant 40 minutes.
    5. Laver les cellules deux fois avec du PBS additionné de 0,1% de BSA et de l'azoture de sodium à 0,1% pour éliminer les anticorps non liés et remettre à un volume final de 100 pl et analyser par cytométrie en flux.
    6. Les données de 30000 à 40000 «vivre» les événements sont acquis pour chaque échantillon en utilisant un cytomètre FACS Caliber équipée d'un laser 488 nm et analysées en utilisant le logiciel CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Cellules non colorées sont inclus comme témoins. Les cellules mortes et des débris apoptotiques long ont été exclus de l'analyse en utilisant un portail électronique en direct sur la dispersion vers l'avant et les paramètres de diffusion latérale.

3. Differentition des CSEh au endoderme hépatique

  1. Préparation des milieux de différenciation des CSEh au endoderme hépatique. Tous les médias la préparation doit être effectuée sous une hotte de culture de tissus dans des conditions aseptiques.
    1. Préparation de RPMI: B27 moyenne d'amorçage pour la différenciation endoderme
      1. Pour RPMI-B27 moyen, mélanger RPMI 1640 (500 ml) et B27 (50x, 10 ml)
      2. Tourbillonner pour mélanger les composants.
      3. Ajouter tous les composants d'une unité de filtre et sous vide, conserver à 4 ° C.
    2. Préparation de la SR-DMSO milieu de différenciation hépatocytaire
      1. Pour RS-DMSO moyen, mélanger 80% de KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% de L-glutamine, 1% de non-acides aminés essentiels, 0.1mm β-mercaptoéthanol et 1% de DMSO.
      2. Filtrer la solution sous vacum, conserver à 4 ° C et aliquot et conserver à -20 ° C si nécessaire.
      3. Utilisez 4 ml par puits d'une plaque à 6 puits, et 6 mL par flacon T25.
    3. Préparation du milieu L15 de maturation pour HEPAla maturation tocyte
      1. Pour milieu L-15, mélanger 500 ml Leibovitz milieu L-15, bouillon tryptose phosphate (concentration finale de 8,3%), inactivé par la chaleur sérum fœtal bovin (concentration finale de 8,3%), 10 uM hydrocortisone 21-hémisuccinate, une insuline uM (pancréas de bovin ), 1% de L-glutamine, l'acide ascorbique à 0,2%.
      2. Filtrer la solution sous vacum, conserver à 4 ° C et aliquot et conserver à -20 ° C si nécessaire.
    4. Préparation de la finale du RPMI: B27 moyenne d'amorçage
      1. Distribuer le volume requis de milieu d'amorçage pour l'expérience (1 ml par puits d'une plaque à 6 puits, et 2 mL par flacon T25).
      2. Ajouter activine A à une concentration finale de 100 ng / mL.
      3. Ajouter recombinant Wnt3a à une concentration finale de 50 ng / mL.
      4. Mélangez bien et les médias est maintenant prêt à utiliser.
      5. Ce support final devrait être composée fraîche chaque jour.
    5. Préparation du milieu L-15 maturation finale
      1. Répartir le nécessairevolume de milieu L-15 pour l'expérience (4 ml par puits d'une plaque à 6 puits, et 6 mL par flacon T25).
      2. Ajouter HGF à une concentration finale de 10 ng / mL.
      3. Ajouter l'OSM à une concentration finale de 20 ng / mL.
      4. Mélangez bien et les médias est maintenant prêt à utiliser.
      5. Ce support final devrait être composée fraîche chaque jour.
  2. CSEh Purge pour endoderme définitifs
    1. Culture CSEh (H1, H9 et MRC-1) et se propager sur des plaques enduites de Matrigel fibroblastes embryonnaires de souris MEF-CM complété par le bFGF.
    2. Initier une différenciation hépatique lorsque CSEh atteindre un niveau de confluence d'environ 30% -60% (selon la lignée de CSEh) en remplaçant le MEF-CM avec support d'amorçage (RPMI 1640-B27 supplémenté avec 100 ng / mL activine A et 50 ng / mL Wnt3a.
    3. Les cellules sont cultivées dans un milieu d'amorçage pour 3 jours (changeant le milieu toutes les 24 heures), et moyen d'amorçage finale avec l'activine A et Wnt3a est constitué fraîche chaque jour.
    4. Au jour 8 de la culture des cellules dans le milieu de maturation et d'entretien (L-15) complété avec 10 ng / mL hHGF et 20 ng / mL OSM pendant 9 jours (changement moyen toutes les 48 heures). Milieu de maturation et de maintenance avec hHGF et OSM est constitué fraîche chaque jour.
    5. Les cellules présentent progressivement des changements morphologiques d'une forme hérissés / triangulaire à une morphologie caractéristique du foie affichant une apparence polygonale (figure 2A).
    6. Schéma d'hépato-cellulaires de différenciation:

4. Caractérisation de l'endoderme hépatique CSEh dérivées

  1. Immunocoloration
    1. Lavez CLH CSEh dérivées fois avec du PBS, 1 minute à chaque lavage.
    2. Fixer le CLH avec 4% de PFA pendant 20 minutes à température ambiante, (la cellules peuvent être stockées dans du PBS à 4 ° C et colorés à une date ultérieure). Les cellules peuvent également être fixées avec du méthanol glacée pendant 10 minutes à -20 ° C.
    3. Laver les cellules deux fois avec PBS, à 5 minutes à chaque lavage.
    4. Incuber les cellules pendant 2 minutes à température ambiante avec de l'éthanol à 100% pour la coloration nucléaire (cette étape n'est pas nécessaire si la fixation méthanol est utilisé).
    5. Laver les cellules deux fois avec PBS, à 5 minutes à chaque lavage.
    6. Bloquer les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA pendant 1 heure à température ambiante.
    7. Retirez le tampon de blocage et d'ajouter l'anticorps primaires respectifs dilué dans du PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA et incuber pendant 2 heures à température ambiante, ou une nuit à 4 ° C avec agitation.
    8. Laver les cellules trois fois avec du PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA à température ambiante, à 5 minutes à chaque lavage.
    9. Ajouter le secondaire approprié Alexa Fluor anticorps (1:400) dilué dans du PBS pour les cellules et incuber à température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité avec agitation. Laver les cellules trois fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque lavage.
    10. Montez chaque bien avec Mowiol 4-88 et DAPI (1:1000). Couvrir le puits avec une lamelle, en appuyant sur la lamelle doucement pour s'assurer que toutes les bulles d'air sont éliminées et conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
  2. L'isolement et l'extraction de l'ARN
    1. Laver les CSEh dérivées CLH avec du PBS et aspirer.
    2. Ajouter 1 mL de réactif Trizol et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
    3. Racler les cellules et les placer dans un eppendorf de 1,5 ml (conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure si nécessaire).
    4. Ajouter 0,5 ml de chloroforme à l'eppendorf et mélanger en retournant; s'assurer que cela est fait dans une hotte.
    5. Centrifuger la solution à 13000 rpm pendant 15 minutes à 4 ° C.
    6. Recueillir la couche aqueuse et placer dans un eppendorf propre, s'assurer qu'il n'y ait pas de contamination de l'interface.
    7. Ajouter 1 mL d'isopropanol et mélanger en retournant, laisser à température ambiante pendant 10 minutes pour précipiTate l'ARN.
    8. Centrifuger à 13000 rpm pendant 10 minutes à 4 ° C.
    9. Aspirer le surnageant et veillez à ne pas perturber le culot d'ARN. Laver avec 0,5 mL d'éthanol à 70% et laisser à température ambiante pendant 5 minutes.
    10. Centrifuger à 8000 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C.
    11. Aspirer l'éthanol et laisser sécher à température ambiante pendant 5-10 minutes.
    12. Une fois que tout l'éthanol s'est évaporé, resuspendre le culot dans 30 ul d'eau déminéralisée. Magasin de l'ARN à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
    13. Quantifier la concentration d'ARN en utilisant une Nanodrop.
  3. Reverse Transcription PCR
    1. Mettre en place une réaction à l'aide précédemment isolé l'ARN (200 ng), hexamères aléatoires, les nucléotides (10 mM) de la transcriptase inverse et la mémoire tampon respectives dans une paroi mince 0,5 ml Eppendorf.
    2. Mettre en place un négatif RT, la réaction ci-dessus sans la transcriptase inverse.
    3. Placer les tubes dans un cycleur thermique, machine à PCR, et mettre en place les suivants programme:
      1. 37 ° C - 5 minutes (1 cycle)
      2. 42 ° C - 1 heure (1 cycle)
      3. 95 ° C - 5 minutes (1 cycle)
    4. Magasin de l'ADNc à -20 ° C pour une utilisation ultérieure si nécessaire.
  4. TAQMAN reverse transcriptase quantitative Polymerase Chain Reaction Récolter les cellules à différents moments tout au long du protocole de différenciation. Extrait de l'ARN et de réaliser qPCR transcription inverse en utilisant les amorces suivantes et de dosage à la demande, (Applied Biosystems) protocole:
    1. 4 octobre Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. L'albumine Hs00910225_m1
    4. Alpha-foetoprotéine Hs00173490_m1

Pour l'isolation de l'ARN et l'extraction s'il vous plaît se référer à la section 3.3.2

  1. La transcription inverse et TaqMan qPCR
    1. Prendre 1 ug d'ARN et de transcription inverse en ADNc en utilisant Invitrogen Exposant III transcription inversekit, selon les instructions du fabricant.
    2. 1 pl de l'ADNc utilisé dans une réaction de 25 ul TAQMAN composé des amorces appropriées d'Applied Biosystems, amorces 18S du ribosome et le contrôle d'Invitrogen 2x platine qPCR Supermix UDG avec ROX et un volume d'eau approprié.
    3. Mélangez bien et placez 10 ul de chaque échantillon en deux puits soit d'une plaque de 96 ou 384 qPCR ainsi.
    4. Une fois que tous les échantillons sont chargés, ainsi que les contrôles appropriés), la plaque d'étanchéité et d'analyser sur la machine Applied Biosystems 7900HT TaqMan.
    5. Les résultats sont exprimés comme expression relative sur un échantillon de contrôle.
  1. Analyse fonctionnelle de l'endoderme hépatique CSEh dérivées du cytochrome P450 Tests - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Incuber 17 jours de CSEh dérivées SE avec le substrat spécifique de 5 heures à 37 ° C (n = 3). Utiliser les médias comme une culture de tissuscontrôle négatif et incuber à 37 ° C pendant 5 heures.
    2. Recueillir les surnageants et réaliser le dosage selon les instructions du fabricant.
    3. Mesurer les niveaux relatifs de l'activité basale et normaliser à mg de protéine par tel que déterminé par le test BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Remarques

  1. Tous les volumes sont basés sur un format de plaque à 6 puits. Ajustez le volume en conséquence pour la plaque requise ou le flacon.
  2. Toutes les moyennes d'amorçage, la différenciation et la maturation est filtré sous vide avant utilisation.
  3. Moyenne d'amorçage, la différenciation et la maturation est conservé à 4 ° C pendant plus de 2 semaines. Évaluer la quantité moyenne est nécessaire pour l'expérience et les médias aliquote restante et conserver à -20 ° C pour une utilisation future.
  4. Matrigel est constituée selon les instructions du fabricant; 1 mL peuvent être stockés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  5. Grofacteurs wth fois constitué et aliquoté peuvent être stockés à -20 ° C et une fois décongelés peuvent être conservés à 4 ° C pendant plus de 2 semaines.
  6. L'anticorps primaire habituellement utilisé pour caractériser les CSEh dérivées CLH est l'albumine (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Les résultats représentatifs:

Caractérisation des CSEh maintenu avant de différenciation hépatique

Afin de caractériser l'état de cellules souches de l'H9 CSEh utilisées dans l'étude que nous avons étudié un certain nombre de paramètres. Les cellules exposées morphologie CSEh, de petites cellules serrées croissante dans les colonies définies (figure 1A) et exprimé les marqueurs de cellules souches pluripotentes gène, Oct-3 / 4 et Nanog (figure 1B). Nous n'avons pas trouvé de différences significatives dans l'expression de ces gènes par rapport à un contrôle H7 lignée de CSEh positif. De plus, 90,1% de la population a été CSEh positives pour le marqueur de cellules souches SSEA-4 (figure 1C).

hEDifférentiation SC à l'endoderme hépatique

Cellules souches embryonnaires humaines peuvent être efficacement différenciées pour l'endoderme hépatique in vitro (Hay et al 2008). Au jour 9 de la différenciation, les cellules ont été récoltées et la différenciation des CSEh au CLH a été évaluée. Comme indiqué précédemment l'CSEh expose une série de profonds changements morphologiques et par jour 9, exposée au début morphologie des hépatocytes développer un aspect polygonal (figure 2A). Par ailleurs, la régulation négative de Oct-3 / 4 au cours du temps 9 jours a été observée (figure 2B). En revanche, le foie transcriptions de l'AFP et l'albumine sont régulés à la hausse (figure 2C) du jour 7 et suivantes.

La maturation in vitro de l'endoderme hépatique

Endoderme hépatique a été mûri in vitro en utilisant la procédure établie (Hay et al 2008). Le dernier jour de cultures de différenciation ont été immunocolorés des marqueurs hépatiques de l'albumine humaine, l'AFP et la E-cadhérine. Le rendement de CLH utilisant notre procédure est généralement de 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). CLH une coloration positive pour l'albumine, l'alpha-foetoprotéine et la E-cadhérine (figure 3).

Figure 1
Figure 1. Caractérisation des CSEh utilisées dans cette étude. (A) au microscope à contraste de phase des images représentatives de la morphologie de CSEh observées dans la culture à un grossissement de 4x et 10x. Les images ont été capturées à l'aide d'un Nikon TE3000 / U microscope inversé (B) CSEh sont cultivés octamère (Oct-3 / 4) positif positif et Nanog. H7 CSEh ont été utilisé comme contrôle pour la pluripotence des niveaux d'expression génique. Expression relative se réfère à des plis de l'induction par rapport à la régulation du gène endogène, β-2-microglobuline. (C) parcelles FACS montrent CSEh niveaux de surface de marqueur d'expression, notamment le stade embryonnaire, les antigènes spécifiques AESS 4.

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Figure 2. (A) Phase d'images au microscope à contraste représentant de CSEh dérivées morphologie hépatique endoderme au jour 9 de la différenciation observée dans la culture, à un grossissement x4 et x10. (B) Caractérisation des changements dans l'expression des gènes. L'ARN a été extrait et l'ADNc a été analysée par réaction en chaîne par polymérase quantitative, montrant une régulation négative de l'expression progressive des cellules indifférenciées de gènes (Oct-3 / 4) et (C)-régulation de l'expression génique des hépatocytes (albumine et α-foetoprotéine). Expression relative se réfère à des plis de l'induction par rapport à la régulation du gène endogène, β-2-microglobuline au jour 0 de la différenciation. P <0,05 est noté * et p <0,001 *** est notée mesurée par les étudiants du test t en comparaison de CSEh au jour 0. Les barres d'erreur représentent une déviation standard.

Figure 3
Figure 3. Ch.aracterisation de CSEh dérivées endoderme hépatique
Immunocytochimie montrant l'expression de marqueurs hépatocytaires, l'albumine, l'AFP et la E-cadhérine dans les CSEh (H9) endoderme hépatique dérivés. Des contrôles négatifs ont été effectués avec des immunoglobulines correspondantes G (IgG) et des représentants d'images sont affichées.

Figure 4
Figure 4. CSEh (H9) CLH dérivés présentent une activité métabolique. Au jour 17, H9 différenciée CLH présentaient une activité métabolique du CYP3A (n = 6).

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Discussion

Nous avons développé un modèle simple, homogène et hautement reproductibles in vitro pour générer des niveaux évolutifs du CLH humaine. Notre modèle a été validé par un certain nombre de laboratoires externes collaborent. Nous avons régulièrement de caractériser des cellules souches dérivées CLH utilisant notre boîte à outils dans la maison de marqueurs spécifiques de développement et des tests fonctionnels du foie (dont la plupart sont disponibles dans le commerce). Les étapes essentielles dans notre processus sont: le maintien de la pluripotence des cellules souches, la capacité de différenciation des cellules souches directement à l'endoderme définitif; la spécification des cultures homogènes de l'endoderme hépatique et la capacité à tirer endoderme hépatiques matures présentant la fonction large éventail in vitro.

Une limitation au déploiement à grande échelle de la cellule souche dérivée HLC technologie a été la fonction de court terme différenciés de l'endoderme hépatiques matures en culture (~ 4 jours sur Matrigel). En tant que tel, nous avons projeté un polymèrebibliothèque pour la bio-actives et de nouveaux supports cellulaires. Cela a conduit à l'identification d'un support nouveau qui maintient la fonction hépatique pendant au moins 15 jours. Les orientations futures de cette technologie sont d'abord les applications industrielles dans le processus de découverte de médicaments (Hay et al 2011). Mi gains à long terme sous forme de cette technologie sont susceptibles d'être humanisé extra-corporelle des dispositifs de soutien du foie pour le pontage ou le traitement des patients présentant une maladie hépatique. Gains à long terme de cette technologie pourrait en thérapie transplantation de cellules basées pour la maladie du foie, mais les données actuelles démontrent que cette stratégie nécessite un effort considérable avant qu'il puisse être utilisé sans danger dans la clinique (Payne et al 2011).

En conclusion, l'importance de notre in vitro technologie est la capacité à générer des cultures homogènes et sans limite de CLH haute fidélité de l'homme pour la biologie appliquée.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgements

Dr Hay a été soutenue par une bourse de RCUK, le Dr West a été soutenu par le Département de chirurgie, le Dr Medine a été soutenu par une subvention du Fonds de base BHF, M. Baltasar Lucendo-Villarin a été soutenue par une MRC Studenship doctorat. Dr Zhou a été soutenu par une bourse du gouvernement chinois.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
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  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
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