Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel vil fokusere på den generation af humane hepatiske endoderm fra humane embryonale stamceller populationer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Trods fremskridt i modellering human lægemiddeltoksicitet, undlader mange forbindelser under de kliniske studier på grund af uforudsete bivirkninger. De omkostninger ved kliniske studier er betydelige, og det er derfor afgørende, at mere forudsigende toksikologi-skærme er udviklet og installeret tidligt i lægemiddeludvikling (Greenhough et al 2010). Humane hepatocytter repræsenterer den nuværende guldstandarden model for vurdering lægemiddeltoksicitet, men er en begrænset ressource, der udviser variabel funktion. Derfor er brugen af ​​udødeliggjort cellelinjer og animalsk væv modeller rutinemæssigt ansættes på grund af deres overflod. Mens begge kilder er informative, de er begrænset af dårlig funktion, arter variabilitet og / eller ustabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotente stamceller (PSC) er et attraktivt alternativ kilde til humane hepatocytter lignende celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSC er i stand til selv fornyelse og differentiering på alle somatiske celletyper der findes i den voksne og dermed repræsentereren potentielt uudtømmelig kilde af differentierede celler. Vi har udviklet en procedure, der er enkel, yderst effektiv, gøres til genstand for automatisering og udbytter funktionelle menneskelige HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 og Hay et al 2011). Vi mener, at vores teknologi vil føre til skalerbare produktionen af ​​HLCs for lægemiddelforskning, sygdom modellering, opførelse af ekstra-kropslige enheder og muligvis cellebaserede transplantation behandlingsformer.

Protocol

1. Indledende forberedelse af alle kemiske lagre og belægning af kultur plastvarer

Alle skridt, der skal gennemføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold.

  1. Udarbejdelse af menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (hbFGF)
    1. Forbered 10% BSA løsning i PBS og filtreres gennem et 0,22 mm filter.
    2. Fra 10% BSA oploesning fremstilles en 0,2% BSA løsning.
    3. Tilsæt 10 mL 0,2% BSA opløsning/100 mikrogram hbFGF.
    4. Pre-våde en 0,22 mm filter ved at filtrere 5 ml 10% BSA løsning gennem filteret. Kassér 10 mL BSA vask.
    5. Filtrer hbFGF gennem forvasket filter.
    6. Alikvot de hbFGF i steril eppendorfs og opbevares ved -20 ° C.
  2. Udarbejdelse af menneskelige activin en stamopløsning
    1. Tilsæt 1 mL 0,2% BSA i en sprøjte og præ våde filteret.
    2. Fortynd activin A i 0,2% BSA til et lager koncentration på 100 mikrogram / ml.
    3. Filtrer aktivitetern En løsning og alikvot i sterile eppendorfs, opbevares ved -20 ° C.
  3. Udarbejdelse af Mouse Wnt3a Stamopløsning
    1. Tilsæt 200 μl af PBS til en 2 mg hætteglas med Wnt3a til en bestand koncentration på 10 mikrogram / ml.
    2. Alikvot i sterile eppendorfs og opbevares ved -20 ° C.
  4. Udarbejdelse af menneskelige HGF stamopløsningen (1000x)
    1. Fortynd HGF i PBS til et lager koncentration på 10 mikrogram / ml.
    2. Filtrer HGF løsning og alikvot i sterile eppendorfs, opbevares ved -20 ° C.
  5. Udarbejdelse af Oncostatin M stamopløsningen (1000x)
    1. Fortynd OSM i PBS til et lager koncentration på 20 mikrogram / ml.
    2. Filtrer OSM løsning og alikvot i sterile eppendorfs, opbevares ved -20 ° C.
  6. Coating af kultur plastvarer med Matrigel
    1. Optø de 10 mL bestanden flaske Matrigel natten over ved 4 ° C på is, og derefter tilsættes 10 ml af KO-DMEM. Bland omhyggeligt ved hjælp af kølede pipetter og Store 1ml alikvoter ved -20 ° C.
    2. Tø en portion af Matrigel ved 4 ° C i mindst 2 timer eller natten over for at undgå dannelse af en gel.
    3. Tilsættes 5 ml kold KO-DMEM til matrigel, bland godt med en pipette.
    4. Der fyldes op til 15 ml med koldt KO-DMEM og blandes med en pipette.
    5. Tilføj matrigel til pladen eller kolben skal behandles (Tabel (i))
Plade / Kolbe Volume / brønd eller Flask
12-brønds plade 0,5 mL per brønd
6-brønds plade 1 ml pr godt
25cm 2 kolbe 2 ml pr flaske

Tabel 1. Anbefalede mængder matrigel for belægning typiske plastvarer for hESC kultur.

    1. Inkubér coatede plade eller kolbe natten over ved 4 ° C eller værelsetempature i 1 time før brug.
    2. Plader eller beholdere, der er belagt med matrigel kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge. De skal være tydeligt mærket med dato, de blev belagt. Kassér alle plader eller kolber ikke anvendes inden for en uge.
      1. Før brug tillader belagt kultur containeren til at komme op til stuetemperatur i en vævskultur hætte.
      2. Umiddelbart før brug aspirer matrigel og tilføje cellesuspension til godt eller kolben.

2. Rutinemæssig vedligeholdelse af hESC kulturer og karakterisering

  1. Genoplivning af hESC linjer
    1. Fjern hESCs fra flydende nitrogen opbevaring og hurtigt tø i en 37 ° C vandbad.
    2. Overførsel cellesuspensionen forsigtigt til et sterilt rør, der indeholder flere mL varmt medium.
    3. Pellet cellerne ved centrifugering @ lav hastighed i 5min (1000 RPM).
    4. Aspirer off supernatanten og meget forsigtigt resusPend cellerne i varme ES mellemstore og pladen ud på en MEF feeder lag.
    5. Refeed celler dagligt med frisk ES medium og på subconfluence, de celler, kræver cellerne passaging.
  2. Rutinemæssig hESC vedligeholdelse
    ES-celler dyrkes i plader eller kolber belagt med matrigel. Cellerne skal undersøges og fodres dagligt:
    1. Undersøg under lup for forurening, celle morfologi og sammenløbet.
    2. Aspirer det brugte medie.
    3. Tilsæt en passende mængde af frisk Mouse Embryonale fibroblast-conditioned Medium (MEF-CM) + menneskelige bFGF (slutkoncentration 4 ng / ml) eller andre serum frie medier 6.
  3. Passaging celler med collagenase
    hESC linjer (H1, H9 og RCM-1) vil nå sammenløb hver 5-7 dage efter passaging på en 1:3 delingsforholdet. Tidligt passage hESCs i overværelse af stroma vokser langsommere og tid på de matrigel kan blive en vigtig faktor. Menneskelige økonomiske og sociale råd bør ikke stå længere end 14dage på samme matrigel på grund af matrix nedbrydning og i dette tilfælde kan det være nødvendigt at passage cellerne i 1:1 eller 1:2 delingsforholdet hvis cellerne er subconfluent.

    Enzym Inkubation
    1. Alle skridt, der skal gennemføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold.
    2. Sikre, at der er en ny matrigel belagt parabol eller kolbe forberedt efter § 1.6.
    3. Beslut dig for den ønskede delingsforholdet for cellerne. En række faktorer er med til at beslutte delingsforholdet:
      1. Høj grad af stroma med et lavt antal kolonier: kan inkuberet tilbage til en mindre god størrelse eller kan inkuberet 01:01, der vil slippe af med nogle stroma og dermed øge koloni til stroma-forholdet, fremme hESC vækst.
      2. Høj grad af stroma med store kolonier, afhængigt af antallet af kolonier, kan inkuberet 1:1 eller 1:2, hvis der er nok store hESC kolonier.
      3. Typisk vokser hESCs med en lille strOMA eller intet stroma og / eller nogle differentiering kan inkuberet 01:02 eller 3.
      4. Aspirer medierne fra brønden eller kolben.
      5. Vask gang med 2 ml PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      6. Tilsæt en passende mængde collagenase (200 U / ml fortyndet i KO-DMEM) og inkuberes ved 37 ° C i 2-5 min. Fra 2 minutter og fremefter undersøger regelmæssigt under lup (1 minut intervaller). På det tidspunkt differentierede celler begynder at løfte og kolonierne begynder at løfte på kanten cellerne er klar til at blive inkuberet.
    Skrabning og Pooling de hESCs
      1. Aspirer collagenase.
      2. Vask gang med 2 ml PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      3. Tilsæt en passende mængde af MEF-CM afhængigt af delingsforholdet, og ved hjælp af en celle skraber fysisk fjerne celler fra overfladen af ​​godt eller kolben, så triturate Gently ved pipettering op og ned 2-3 gange ved hjælp af en 10 ml pipette. Det er vigtigt, at hESCs holdes i klumper af celler og er ikke delt op i enkelte celler.
    Replating de hESCs
      1. Replate den resulterende cellesuspensionen på den nye matrigel coatede kolber eller brønde.
      2. Gør mængden af ​​MEF-CM op til 4 ml til en brønd i en 6-brønds plade.
      3. Ved placering af celler i rugemaskinen agitere vævskultur containeren for at sikre så jævn som muligt en fordeling af kolonier, som de kolonier har tendens til at bosætte sig i midten af ​​vævskultur plade / kolbe påvirker celle replating og differentiering.
  4. Rutinemæssig karakterisering af hESC befolkning ved flowcytometri
    1. hESC befolkningsgrupper undersøges via flowcytometri en gang om måneden for stamcelle markører såsom oktober 3 / 4, Tra 1-60 og SSEA-4.
    2. hESCpopulationer er fjernet fra deres substrat som single cellesuspensioner efter en 5 minutters behandling med trypsin / EDTA (Invitrogen).
    3. Resuspender enkelte celler på 1x10 6 celler / ml hos PBS suppleret med 0,1% BSA og 0,1% natriumazid.
    4. Inkuber cellepræparationer ved 4 ° C med de relevante antistoffer i 40 minutter.
    5. Vask celler to gange med PBS suppleret med 0,1% BSA og 0,1% natriumazid til at fjerne ubundet antistof og resuspender til et endeligt volumen på 100 μL og analysere ved flowcytometri.
    6. Data for 30000-40000 "live" begivenheder er erhvervet til hver prøve at bruge en FACS Caliber cytometer udstyret med en 488-nm laser og analyseres ved hjælp af CellQuest software (Becton Dickinson, San Jose, CA). Ufarvet celler indgår som kontroller. Døde og apoptotiske celler sammen med snavs blev udelukket fra analysen ved hjælp af et elektronisk live-port på forward scatter og side scatter parametre.

3. Differentiereation af hESCs til hepatisk endoderm

  1. Udarbejdelse af Medier til differentiering af hESCs til hepatisk endoderm. Alle medier forberedelse skal udføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold.
    1. Udarbejdelse af RPMI: B27 priming medie til endoderm differentiering
      1. For RPMI-B27 medium, mix RPMI 1640 (500 ml) og B27 (50x, 10 ml)
      2. Swirl at blande komponenter.
      3. Tilføj alle komponenter til et filter og et filter under vakuum, opbevares ved 4 ° C.
    2. Udarbejdelse af SR-DMSO medie til hepatocytter differentiering
      1. For SR-DMSO medium, mix 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 0,1 mm β-mercaptoethanol og 1% DMSO.
      2. Opløsningen filtreres under vacum, opbevares ved 4 ° C og alikvot og opbevares ved -20 ° C, hvis det kræves.
      3. Brug 4 ml pr brønd i en 6-brønds plade, og 6 ml pr T25 kolbe.
    3. Udarbejdelse af L15 modning medium for hepatitistocyte modning
      1. For L-15 medium, 500 ml Leibovitz L-15 medium, Tryptose fosfat bouillon (slutkoncentration 8,3%), varme inaktiveret føtalt bovint serum (slutkoncentration 8,3%), 10 ìm hydrocortison 21-hemisuccinate, 1 μM Insulin (kvæg bugspytkirtlen ), 1% L-Glutamin, 0,2% ascorbinsyre.
      2. Opløsningen filtreres under vacum, opbevares ved 4 ° C og alikvot og opbevares ved -20 ° C, hvis det kræves.
    4. Udarbejdelse af den endelige RPMI: B27 priming medium
      1. Dispenser den nødvendige mængde priming medium for eksperimentet (1 ml pr brønd i en 6-brønds plade, og 2 ml pr T25 kolbe).
      2. Tilføj activin A til en endelig koncentration på 100 ng / ml.
      3. Tilføj rekombinant Wnt3a til en endelig koncentration på 50 ng / ml.
      4. Bland godt, og medierne er nu klar til brug.
      5. Denne endelige medier bør bestå frisk hver dag.
    5. Udarbejdelse af den endelige L-15 modning medium
      1. Doser den ønskedemængden af ​​L-15 medie for eksperimentet (4 ml pr brønd i en 6-brønds plade, og 6 ml pr T25 kolbe).
      2. Tilføj HGF til en endelig koncentration på 10 ng / ml.
      3. Tilføj OSM til en endelig koncentration på 20 ng / ml.
      4. Bland godt, og medierne er nu klar til brug.
      5. Denne endelige medier bør bestå frisk hver dag.
  2. Grunding hESCs til definitiv endoderm
    1. Kultur hESCs (H1, H9 og RCM-1) og udbrede den matrigel plader med musen embryonale fibroblast MEF-CM suppleret med bFGF.
    2. Igangsætte nedsat differentiering, når hESCs nå et confluency niveau på omkring 30% -60% (afhængigt af hESC linje) ved at erstatte den MEF-CM med priming medium (RPMI 1640-B27 suppleret med 100 ng / mL activin A og 50 ng / mL Wnt3a.
    3. Cellerne dyrkes i grunding medie til 3 dage (skiftende mellemlang hver 24 timer), og endelig grunding medium med activin A og Wnt3a består frisk hver dag.
    4. På dag 8 kultur cellerne i modning og vedligeholdelse medium (L-15) suppleret med 10 ng / ml hHGF og 20 ng / ml OSM i 9 dage (skiftende mellem hver 48 timer). Modning og vedligeholdelse medium med hHGF og OSM består frisk hver dag.
    5. De celler gradvist udstiller morfologiske ændringer fra en spiky / trekantet form til et karakteristisk leveren morfologi vise en polygonal udseende (figur 2A).
    6. Skematisk for hepato-cellulær differentiering:

4. Karakterisering af hESC afledt nedsat endoderm

  1. Immunfarvning
    1. Vask hESC afledt HLCs med PBS to gange, 1 minut hver vask.
    2. Fastgør HLCs med 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur, (cellens kan opbevares i PBS ved 4 ° C og farves på et senere tidspunkt). Cellerne kan også fastgøres med iskolde methanol i 10 minutter ved -20 ° C.
    3. Vask cellerne to gange med PBS, 5 minutter hver vask.
    4. Inkuber cellerne i 2 minutter ved stuetemperatur med 100% ethanol til nukleare farvning (dette trin er ikke påkrævet, hvis methanol fiksering anvendes).
    5. Vask cellerne to gange med PBS, 5 minutter hver vask.
    6. Bloker celler med PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA i 1 time ved stuetemperatur.
    7. Fjern blokerende buffer, og tilføje de respektive primære antistof, fortyndet i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur, eller natten over ved 4 ° C med agitation.
    8. Vask cellerne 3 gange med PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA ved stuetemperatur, 5 minutter hver vask.
    9. Tilsæt de relevante sekundære Alexa Fluor antistof (1:400) fortyndet i PBS til de celler og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time i mørke med agitation. Vask cellerne 3 gange med PBS, 5 minutter hver vask.
    10. Mount hver brønd med MOWIOL 4-88 og DAPI (1:1000). Dæk godt med en dækning slip, trykke på dækglasset forsigtigt for at sikre, at alle luftbobler fjernes og opbevares ved 4 ° C i mørke.
  2. RNA isolation og udvinding
    1. Vask hESC afledt HLCs med PBS og aspirer.
    2. Tilsæt 1 mL TRIZOL reagens og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter.
    3. Skrab celler og sted i en 1,5 ml Eppendorf (opbevares ved -80 ° C til senere brug, hvis nødvendigt).
    4. Tilsæt 0,5 ml kloroform til Eppendorf og bland ved at vende, skal du sørge for dette sker i et stinkskab.
    5. Oploesningen centrifugeres ved 13.000 RPM i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Saml det vandige lag og anbringes i en ren Eppendorf, skal du sørge for der er ingen forurening fra grænsefladen.
    7. Tilsæt 1 ml isopropanol og blandes ved at vende, henstår ved stuetemperatur i 10 minutter til nedbør,Tate RNA.
    8. Centrifugeres ved 13.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C.
    9. Aspirer supernatanten og sørg for ikke at forstyrre RNA pellet. Vask med 0,5 ml 70% ethanol og henstår ved stuetemperatur i 5 minutter.
    10. Centrifugér ved 8.000 RPM i 5 minutter ved 4 ° C.
    11. Aspirer ethanol og lad det tørre ved stuetemperatur i 5-10 minutter.
    12. Når alle ethanol er fordampet, resuspender pellet i 30 μl af deioniseret vand. Opbevar RNA ved -80 ° C til senere brug.
    13. Kvantificere RNA-koncentrationen ved hjælp af en nanodrop.
  3. Reverse transcription PCR
    1. Opsæt en reaktion ved hjælp af tidligere isolerede RNA (200 ng), tilfældige hexamerer, nukleotider (10mm) reverse transkriptase og de respektive buffer i en tynd walled 0,5 ml Eppendorf.
    2. Opsæt en negativ RT ovenstående reaktion uden revers transkriptase.
    3. Placer rør ind i en termo variator, PCR-maskine, og oprettet følgende program:
      1. 37 ° C - 5 minutter (1 cyklus)
      2. 42 ° C - 1 time (1 cyklus)
      3. 95 ° C - 5 minutter (1 cyklus)
    4. Opbevar cDNA ved -20 ° C til senere brug, hvis det kræves.
  4. TaqMan kvantitativ reverse transcriptase polymerase chain reaction Harvest cellerne på forskellige tidspunkter i hele differentiering protokollen. Uddrag af RNA og udføre reverse transkription qPCR ved hjælp af følgende primere og Assay on-demand, (Applied Biosystems) protokol:
    1. 4 oktober Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumin Hs00910225_m1
    4. Alpha-føtoprotein Hs00173490_m1

For RNA isolation og udvinding henvises til afsnit 3.3.2

  1. Reverse transskription og TaqMan qPCR
    1. Tag 1 mg af RNA og omvendt transskribere til cDNA bruge Invitrogen er Hævet III reverse transkriptionkit, som ifølge producentens anvisninger.
    2. 1 ml af cDNA anvendes i en 25 μl TaqMan reaktion bestående af de relevante primere fra Applied Biosystems, 18S ribosomale kontrol primere og Invitrogen er 2x platin qPCR supermix UDG med rox og en passende mængde vand.
    3. Bland godt og sted 10 μl af hver prøve i to brønde i enten en 96 eller 384 godt qPCR pladen.
    4. Når alle prøver er indlæst, plus den fornødne kontrol), forsegle skiltet, og analysere på Applied Biosystems 7900HT TaqMan maskine.
    5. Resultaterne udtrykkes som relative udtryk over en kontrolprøve.
  1. Funktionel Analyse af hESC afledt Nedsat endoderm Cytochrom P450 Analyser - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Inkuber Dag 17 hESC afledt han med det specifikke substrat i 5 timer ved 37 ° C (n = 3). Brug vævskultur medier som ennegative kontrol, og inkuberes ved 37 ° C i 5 timer.
    2. Saml supernatanter og udføre analysen i henhold til fabrikantens anvisninger.
    3. Mål den relative niveau af basal aktivitet og normalisere til Per mg protein som fastsat af BCA Assay (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Noter

  1. Alle værdier er baseret på en 6-brønds plade format. Juster volumen i overensstemmelse hermed for den ønskede plade eller kolbe.
  2. Alle priming, differentiering og modning medie er filtreres under vakuum før brug.
  3. Grunding, differentiering og modning medie er opbevaret ved 4 ° C i længere end 2 uger. Vurdere, hvor meget medium er nødvendige for at eksperimentere og prøve de resterende medier og opbevares ved -20 ° C til senere brug.
  4. Matrigel er sammensat i henhold til fabrikantens anvisninger, 1 ml aliquoter kan opbevares ved -20 ° C indtil brug.
  5. Growth faktorer, der engang gjorde op og alikvoteres kan opbevares ved -20 ° C og når optøet kan opbevares ved 4 ° C i længere end 2 uger.
  6. Det primære antistof normalt bruges til at karakterisere hESC afledt HLCs er albumin (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Repræsentative resultater:

Karakterisering af hESCs vedligeholdes forud for nedsat differentiering

For at karakterisere stamceller status for H9 hESCs brugt i undersøgelsen har vi undersøgt en række parametre. Cellerne udstillet hESC morfologi, lille, tætpakket celler vokser i definerede kolonier (Figur 1A) og udtrykt pluripotente stamceller genmarkører Okt-3 / 4 og Nanog (Figur 1B). Vi fandt ikke signifikante forskelle i udtryk af disse gener i forhold til en H7 hESC linje positiv kontrol. Derudover, 90,1% af den hESCs befolkning var positiv for stamceller markør SSEA-4 (Figur 1C).

hanSC differentiering til nedsat endoderm

Humane embryonale stamceller effektivt kan differentieres til nedsat endoderm in vitro (Hay et al 2008). På dag 9 af differentiering, blev cellerne høstet og differentiering af hESC til HLCs blev vurderet. Som tidligere rapporterede hESCs udstillet en række dybtgående morfologiske ændringer, og ved Dag 9, tidlig hepatocyt morfologi udvikle en polygonal udseende (figur 2A) udstillet. Desuden blev nedregulering af oktober-3 / 4 i løbet af de 9 dage kursus observeret (figur 2B). I modsætning hertil var leveren udskrifter AFP og albumin opreguleret (Figur 2C) fra dag 7 og fremefter.

In vitro modning af hepatisk endoderm

Nedsat endoderm blev modnet in vitro med den fastlagte procedure (Hay et al 2008). På den sidste dag i differentiering kulturer var immunostained for menneskers lever markører albumin, AFP og E-cadherin. Udbyttet af HLCs bruge vores Proceduren er typisk 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). HLCs farvede positiv for albumin, alpha-føtoprotein og E-cadherin (Figur 3).

Figur 1
Figur 1. Karakterisering af hESCs anvendt i denne undersøgelse. (A) fasekontrast mikroskopi billeder repræsentant for hESC morfologi observeret i kultur på 4x og 10x forstørrelse. Billederne blev taget med et Nikon TE3000 / U inverteret mikroskop (B) kunstigt hESCs er Octamer (okt-3 / 4) positive og Nanog positiv. H7 hESCs blev brug som en kontrol for pluripotency genekspression niveauer. Relativ udtryk refererer til folderne i induktion sammenlignet med den endogene genet kontrol, β-2-mikroglobulin. (C) FACS parceller viser hESC overflade markør udtryk niveauer, herunder fase specifikke embryonale antigener SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
Figur 2. (A) fasekontrast mikroskopi repræsentative billeder af hESC afledt nedsat endoderm morfologi på dag 9 i differentiering observeret i kulturen, på x4 og x10 forstørrelse. (B) karakterisering af ændringer i genekspression. RNA blev udvundet og cDNA blev analyseret ved kvantitativ polymerase kædereaktion, der viser progressive nedregulering af udifferentieret celle genekspression (okt-3 / 4) og (C) opregulering af hepatocyt genekspression (albumin og α-føtoprotein). Relativ udtryk refererer til folderne i induktion sammenlignet med den endogene genet kontrol, β-2-mikroglobulin på dag 0 af differentiering. P <0,05 betegnes * og P <0,001 betegnes *** målt ved studerende t-test i forhold til hESCs på dag 0. Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse.

Figur 3
Figur 3. Characterisation af hESC-afledte nedsat endoderm
Immuncytokemi Viser udtryk for hepatocyt markører, albumin, AFP og E-cadherin i hESC (H9) afledt nedsat endoderm. Negative kontroller blev udført med tilsvarende immunglobulin G (IgG) og repræsentanter billeder skal vises.

Figur 4
Figur 4. HESC (H9) afledt HLCs udviser metaboliske aktivitet. På Dag 17, H9 differentieret til HLCs udstillet CYP3A metaboliske aktivitet (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har udviklet en enkel, ensartet og højt reproducerbare in vitro model til at generere skalerbare niveauer af menneskelig HLCs. Vores model er blevet godkendt af en række eksterne samarbejder laboratorier. Vi rutinemæssigt karakterisere stamceller udledt HLCs ved hjælp af vores i hus værktøjskasse af udviklingsforstyrrelser markører og lever specifikke funktionelle assays (hvoraf de fleste er kommercielt tilgængelige). Den kritiske stadier i vores proces, er: vedligeholdelse af stamceller pluripotency, evnen til direkte stamceller differentiering til endelig endoderm, specifikationen af homogene kulturer af hepatisk endoderm og evnen til at udlede modne nedsat endoderm udstiller en bred vifte funktion in vitro.

En begrænsning til anvendelse i stor skala af stamceller udvundet HLC teknologi har været på kort sigt differentierede funktion af modne hepatisk endoderm i kultur (~ 4 dage på matrigel). Som sådan har vi screenet en polymerbibliotek til bio-aktive og nye cellulære understøtter. Dette har ført til identifikation af en ny støtte, som fastholder leverfunktionen i mindst 15 dage. Den fremtidige retninger for denne teknologi er i første omgang industriel anvendelse i lægemiddelforskning processen (Hay et al 2011). Midtvejs gevinster udgør denne teknologi vil sandsynligvis være humaniserede ekstra kropslige leveren hjælpemidler til at bygge bro eller behandling af patienter med leversygdom. Langsigtede gevinster ved denne teknologi kunne i cellebaserede transplantation behandling for leversygdom, men de aktuelle data viser, at denne strategi kræver en betydelig indsats, før det kan anvendes sikkert i klinikken (Payne et al 2011).

Konklusionen er, at betydningen af vores in vitro-teknologi, evnen til at generere homogene og ubegrænset kulturer af high fidelity menneskelige HLCs for anvendt biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Dr. Hay blev støttet af et RCUK Fellowship, var Dr. West støttet af Department of Surgery, var Dr. Medine støttet af en bevilling fra BHF Core fonden, var Mr. Baltasar Lucendo-Villarin støttet af en MRC ph.d. Studenship. Dr. Zhou blev støttet af et legat fra den kinesiske regering.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics