Author Produced

Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мышь внутреннее ухо плакоды производных органа чувств чье развитие программа разработана во время беременности. Мы определяем

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Брюшной Лапаротомия

  1. Обезболить плотины, эмбрионы которых находятся в эмбриональном день 11.5 (E11.5; полдень в день вагинальным вилка обнаруженного день 0,5 эмбрионального развития) путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия раствор анестетика (7,5 мкл на грамм массы тела). Рабочий раствор анестетика: 180 мкл 50 мг / мл раствора натрия фенобарбитала, 100 мкл абсолютного этанола, 320 мкл 65 мг / мл водного сульфата магния (модулирует тонус матки) и 400 мкл пропиленгликоля (транспортное средство смешивается с водной и органической компонентов).
  2. Оценка полноты анестезией путем проведения испытаний вредных раздражителей: сжатие лапы, хвост щепотку, и мигают ответ на щеке и вибриссы ощупь. Применять мазь стерильной глазной для роговицы.
  3. Бритье брюшной мех из надлобковой области, грудной клетки при помощи ножниц и штраф лезвия (Остер № 40 лопасти). Лечить живот с 70% этанола, 10% повидон йод (Бетадин),70%-го этилового спирта, последовательно. Место мыши живота стороной вниз на стерильной драпировки, а затем установить на грелку или теплую плиту (37 ° C) в течение 2-5 минут.
  4. Надрезать кожу с живота на вентральной срединной линии с шаровым наконечником ножницами. Расширить разрез на 10-14 мм. Определить белой линии, асептического, белая полоса соединительной ткани вдоль брюшной средней линии брюшной стенки. Надрезать белой линии с шаровым наконечником ножницы и расширить разрез 10-14 мм. Сразу орошения брюшной полости с нагретого (37 ° С) раствором лактата Рингера.
  5. Воплощать два рога матки с кольцом щипцы без применения избыточного давления на имплантацию сайтов. Промывать вовне рога матки с нагретого, лактата раствор Рингера.

2. Transuterine Микроинъекция

  1. Изготовление толстостенных, боросиликатного стекла капиллярной пипетки микроинъекции со следующими характеристиками: 12-16 μм и наружным диаметром 20 градусов фаски. На Саттер P-97 Съемник пипетки с небольшим нить окна, используйте следующие программы: тепло = тест рампы и 3 единицы; давление = 200; тянуть = 0, скорость = 46; время = 100). С Саттер BV-10 beveler, используйте 104C (золото) абразивный диск для большого диаметра пипетки. Ресуспендируйте выражение плазмида на 3-4 мкг / мкл кальция бесплатно фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4). Добавить зеленый кристаллический быстро к концентрированному ДНК, вихревые мягко в течение 30 секунд, а спина в 10000 г на 10 секунд. Минимальная сумма быстро зеленый требуется визуально отслеживать эффективность инжекции определяется эмпирически. Засыпки скошенной пипеткой с ДНК / быстрый зеленый раствор. Подключите загруженных пипетки микроинъекции в пипетку владельца давление инжектора (Picospritzer использовании> 99% чистого азота в качестве источника газа).
  2. Transilluminate матки с низкой интенсивностью, галогенная лампа для визуализации эмбриона в его имплантации. Определить BEATing сердца, головного мозга пузырьки, конечности почки, зарождающийся 4-го желудочка задний мозг и глаза. Промывать матки каждые 2 минуты с нагретого, лактата раствор Рингера для поддержания гидратации. Применить мягкое давление на матку переориентировать эмбрион и определить анатомические ориентиры, указанных выше.
  3. Восток эмбриона для выявления первичных вен головы которых передние и задние ветви фланге мезенхимальных территории, на которой проживает отоциста. Отоциста надлежащее не видно на просвет матки. Отоциста находится на полпути между передней и задней ветвей основной вен головы, которая, наряду с основной ствол вены, образуют форму стойками или стойками на американском футбольном поле. Отоциста находится на полпути между стойками.
  4. Вставьте инъекции пипетки через матку в траекторию в соответствии с предполагаемым расположение отоциста. Импульсный microinjector раз после прохождения Утэрнам визуализировать красителя трассирующими и приблизительное расположение кончика пипетки. Предварительный пипетки под контролем микрометра и пульс снова оценить глубину. Дальнейшее продвижение пипетки в боковой мезенхимы голову и пульс несколько раз. Успешное таргетинг отоциста покажет конической формы эндолимфатического канал сверху и гребешка оболочку форма вестибюля. Отпустите давление на матку, удалите из пипетки эмбриона / матки в одно движение, и сразу орошения матки с нагретого, лактата раствор Рингера.

3. В естественных условиях Электропорация

  1. Промывать матки раствором лактата Рингера. Решение Свеженанесенный лактата Рингера необходимо электрически пару весло стиля электроды к матке. Смочите вольфрамовой поверхности электродов с лактата Рингера. Центр вводится отоциста на пути электродов. Мягко сжатие матки с электропорации годовыхddles. Катод находится в контакте с боковой стенки матки вводят в отоциста и анод находится в контакте с стенке матки, прилегающих к uninjected отоциста. Запуск поезда квадратных пульсовой волны с ножным переключателем педали электропоратора. Электропорация параметры: 5, 50 мс импульсы на 43 вольт в импульсе и 950 мс межимпульсным задержки. Сразу орошения матки после импульсов поступает. Запись текущей доставлены в ткани: 60-100 mAmps достаточно для трансфекции слухового эпителия прародителей. Вводите и electroporate 4-6 E11.5 эмбрионов в плотине.
  2. Выполнение второго, независимого transuterine микроинъекции водных люминесцентные декстрана (Alexa Fluor 488, если выражение плазмида кодирует красный флуоресцентный белок или Алекс Fluor 594, если выражение плазмида кодирует зеленый флуоресцентный белок) в 4-й желудочек тех эмбрионов, внутренняя уши точно вводить не менее 60 mAmps текущего импульса в де-сель в электропорации. Люминесцентные декстран будет обнаружить при рождении в задний мозг и позволяют выбор щенков, чей внутренний слух манипулировать во время эмбриогенеза (см. 3.5).
  3. Промывать рога матки с лактата Рингера. Вставьте рога матки в брюшную полость. Промойте полости матки с 2-4 мл нагретого, лактата раствор Рингера и позволяют переполнения для слива из разреза на стерильной драпировки. Замените драпировки с сухим, стерильным материалом. Ушивания брюшной стенки с не режущей иглы и 6-0 рассасывающиеся нити. Мы предпочитаем работает стежка, блокируя все остальные строчки, как брюшной стенки и кожу.
  4. Сухой мех плотин и управление нестероидные противовоспалительные, такие как мелоксикам в виде подкожных инъекций. Вернуться плотины на подогретую клетке восстановление на стерильной драпировки. Мониторинг и запись плотины "дыхания, проходимость разреза, и влагалище кровавые выделения. Кровотечение раповторно, но если они присутствуют, и ослабевает, усыпить плотины в то время как она все еще под наркозом. Обратите внимание, когда она приходит в сознание и пытается передвигаться. Вернуться плотины мыши колонию, когда она проявляет признаки есть и пить и начал строить гнездо. Как правило, это происходит в течение 12 часов.
  5. При рождении (постнатальный день 0), флэш-задний мозг области каждого щенка в помете обнаружить люминесцентные декстран помощью stereofluorescence рассечения микроскоп с GFP или Texas Red набор фильтров по мере необходимости. Вернуться на кормящих плотины только щенков, которые отображают задний мозг маркировки.

4. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Электропорация-опосредованного переноса генов в развивающихся улитки. E11.5 отоциста вводили с выражением плазмиды, кодирующей расширения зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и электропорации (импульс трав параметрах: пять, 43 вольт импульсов 50 мс / импульс и 950 мс межимпульсным задержки). А) представитель внутреннее ухо от послеродовой день 6 (Р6) щенок которого отоциста вводили и электропорации в E11.5 демонстрируя EGFP выражении от основания до середины поворота улитки. Боковой стенке улитки был отстранен от середины поворота и вершина всего. E11.5 предшественников, которые приводят к вершине, не трансфицированных. B) Всего крепление иммунной из улитки (A) с маркером клетки волос, миозин 7а (Myo7a), показывает, что EGFP выражение следует траектории органа Корти и грубо локализуется в волосковых клеток, несущих сенсорного эпителия. C) представитель внутреннее ухо от E18.5 эмбрион которого отоциста вводили и электропорации в E11.5. Лазерной конфокальной проекция показывает EGFP выражение в Myo7a-положительных волосковых клеток. D) лазерный конфокальный проекцию улитки сенсорного эпителия из E18.5 органа Корти указывает EGFP expressioл во внутренних волосковых клеток (IHC), наружных волосковых клеток (НВК), внутренний phalangial клеток (МПК), столб клеток (ПК), и клетки Дейтерса (постоянного тока). Шкалы (В) относится к (А).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Перенос генов в развивающихся мыши внутреннего уха: мышь внутреннее ухо развивается из слуховой плакоды в течение первой недели постимплантационных развитии 12,13. В эмбриональном день 9,5 (E9.5), плакоды был инвагинировать и превратился в заполненных жидкостью пузырьков называется отоциста 2. Otic предшественников в пузырьков приводит к сенсорной и nonsensory клеток в зрелые внутреннего уха, а также нейроны, которые иннервируют механически чувствительных волосковых клеток в вестибулярных и слуховых сенсорных эпителия. К концу эмбриональной стадии, комплекс, 3-мерные морфологии перепончатого лабиринта внутреннего уха установлен 3,12. Усиление и потерей функции экспериментальных условиях, как правило, осуществляется с помощью мыши трансгенез, чтобы разобраться в генетической регуляции процессов развития, таких как сотовые спецификации судьбу и характер образования. Динамический генетических манипуляций развивающихся мыши внутреннего ухавнутриутробно представляет собой бесплатный подход к мыши трансгенез, что пары, методы переноса генов с помощью мыши экспериментальной эмбриологии 6,11.

Вирус-и электропорации опосредованного методы переноса генов были разработаны для управления экспрессией генов в развивающихся внутреннего уха 6,11,14,15. Адено-вирусной связанные (ААВ) векторы заражения ушной предшественников, которые приводят к сенсорной и nonsensory типов клеток и были использованы для допроса молекулярной основе кальций-зависимый экзоцитоз в волосковых клеток мыши 16. AAV векторов производят высокие титры, которые позволяют широкому выражения во внутреннем ухе и различных вирусных серотипов представлены уникальные тропизм, что может быть выгодно для дифференциальных сотовой выражение. К недостаткам можно отнести фиксированный начинкой потенциал, который ограничивает размер гена, которые могут быть misexpressed и требования для вирусологического опыта, чтобы сделать, очистить, и титр вирусов. Электропорация опосредованного генной трansfer была использована для оценки роли основных спираль-петля-спираль транскрипционный фактор в определении судьбы сенсорных волосковых клеток в естественных условиях 6. Выражение плазмиды адаптированы для шлюза технологии субклонирования позволяют быстро и эффективно строительство векторов с уникальными промоутеров вождения экспрессию гена интересов, и флюоресцентного из последовательности IRES 17. Гены интерес может быть выражено в ушной предшественники в течение 24 часов электропорации и выражения могут сохраняться в послеродовом внутреннего уха в зависимости от промоутера используется. Плазмиды строительства, очистки, концентрации и количественного требуется только стандартный молекулярно-биологических навыков. К недостаткам можно отнести снизилась в естественных условиях эффективность трансфекции плазмиды, как увеличивается размер выше 8kb ~ и более высокий уровень эмбриональной смертности по сравнению с большинством вирусных векторов. Оба электропорации и вирус-опосредованной методы переноса генов требует мастерства мыши экспериментальных эмбриологических технологийniques: выживание операции, внутриутробной манипуляции эмбрионов, и transuterine микроинъекции. Цель этой рукописи для решения последнего вопроса, демонстрируя каждый критический методологический шаг за цифровой микроскопии видео.

Методические заметки о видео: Мы сознательно решили не драпировать разреза стерильным поле во время съемок, так что зритель мог видеть положение вентральной срединной линии по отношению к общей анатомии плотины, т.е. головы (сознательно размыты в большинстве кадров, но узнаваемый), конечности и хвост. Драпировки разреза эффективно блокирует эту точку зрения и может посрамить усилия оценить пространственно соответствующих анатомических отношений в вентральной лапаротомии и инъекции последовательности. Тем не менее, мы рекомендуем драпировки живота плотины так, чтобы вовне матки остальные рога на стерильном поле для поддержания хирургической асептики. Кроме того, мы сознательно не пытались демоновtrate ушиванием хирургические разрезы в брюшной стенке и кожи, потому что эти методы должны быть изучены экспертами руководством ветеринара или квалифицированной хирургической технике. Доктор Марсель I. Перре-Жантиль (Техасский университет в Сан-Антонио), представляет собой отличное обсуждение этой темы, в комплекте с живописных представлений, в раздаточный материал, «Основы ветеринарной сшивания» 18.

Процедурные рекомендации: Перенос генов в развивающихся мыши внутреннего уха является технически сложной задачей. Есть ряд передовых методов, который позволит устранить значительную изменчивость и обеспечения успешных результатов. Мы делаем конкретные рекомендации ниже, чтобы облегчить изучение этого экспериментального подхода.

Обратиться ветеринарного персонала для разработки операции мышь выживания ухода за животными протокола: Протокол по уходу за животными для млекопитающих операции выживание требует производить санестезия, обезболивание, и интраоперационной помощи должны быть определены и согласованы. Детальное обсуждение по уходу за животными протоколов, в том числе язык, который может стать основой протокол заявителя, предоставляется в качестве дополнительной информации (см. « Animal Care Протокол развития "). Кроме того, в вашем доме учреждений по уходу и использованию животного комитета (IACUC) и ветеринарного персонала, несомненно, обеспечит дополнительные указания по разработке подходящего протокола по запросу.

Создание выделенного мышью выживание операция в области для переноса генов внутриутробно: Брюшной лапаротомия это объявление в серьезной операции, поскольку она ставит под угрозу полости тела. Большинство IACUCs не требует стерильной, класс 100 условия для серьезной операции выживаемость мышей. Скорее всего, выделенные области, которая включает в себя надлежащего освещения, вентиляцииlation, дополнительное отопление, и жесткий, не пористая, дезинфекции поверхностей, скорее всего, не потребуется. Мы предпочитаем вести наше выживание операция в горизонтальном ламинарном боксе, который защищает мышей от инфекции, уменьшает физиологический стресс, и, таким образом средств послеоперационного восстановления. Мы определили ряд пользовательских модификаций колебания затухающие, горизонтальный капот ламинарного потока (Envirco LF 630), которые включают направленный, низкая мощность галогенных дорожке освещение, расширенное электрических схем для питания оборудования перенос генов и встраиваемые розетки с вырезами настольного Шнур для прохода. Подробная схема этих изменений предусмотрено в качестве дополнительной информации (см. « Ламинарные Худ В переноса генов Utero "). Проконсультируйтесь с Вашим IACUC как вы развивать свой протокол по уходу за животными, чтобы определить подходящее место, которое посвящено исключительно мышь суrvival операции.

Взвесьте плотины с точностью до 0,1 грамма до введения анестезии пентобарбитала натрия: натрия фенобарбитала является эффективным обезболивающим и обеспечит по крайней мере 105 минут рабочего времени, когда рекомендуемой дозировкой график следования. Определить точный вес для каждой плотины до расчета дозы смеси анестетик для введения. Никогда не оценить вес тела плотины. Используйте лоток аллергии иглу шприца и шприц с Becton Dikison: человеческий внутрикожные конических идеально подходит для атравматической внутрибрюшинного введения в беременных мышей. Кроме того, этот шприц имеет чрезвычайно низкий мертвый объем пространства и откалиброван для диапазона анестезии объемы обычно требуется для плотин, эмбрионы которых находятся на E11.5 и E12.5.

Развертывание профилактическое обезболивание для поддержки эмбрионального выживания: Администрирование анестетик на шов, например,Bupivicaine, а также системный, нестероидные противовоспалительные препараты, такие как мелоксикам, до размещения плотины в восстановлении клетку так, что анальгетики находятся на борту к тому времени дамба оправится от анестезии. Сокращение дискомфорта в плотину облегчает послеоперационного восстановления и поддержания здоровой беременности.

Bevel микроинъекции пипетки и плотно ограничивать внешний диаметр: самая распространенная причина эмбриональной летальности является ткани и / или повреждения сосудов в плохо построены пипетки микроинъекции. Transuterine микроинъекции в E11.5 мыши отоциста осуществляет различные ограничения, чем введение в больших органов в более ранних эмбрионов (т.е. мозг пузырьки, глаза, конечности и т.д.). Unbeveled, плохо скошенный или несоразмерно большую внешнюю пипетки диаметра вызовет кровотечение из сосудов в матке, висцеральный желтка сосудистой и / или эмбрион на E11.5, который будет уменьшать эмбриональной выживаемости. Вполне возможно,передать-брейк прочный пипеток малого диаметра, которые несут соответствующие конические, но это трудно сделать в установленном порядке. Эмбриона E11.5 мышь, которой крошечные отоциста является целевой, будет неумолим. Обратитесь к P-1000 P-97 Внесите Cookbook 2011 от Саттер инструменты для полного дискурса на пипетку проектирование и изготовление 19. Параметры для пипеток, используемые в этой работе было отмечено выше, и их производство было полностью описано выше 11. Замечания по процедуре в инструкции по эксплуатации для Sutter Instruments BV-10 beveler также отличный ресурс.

Понять, почему mistargeting отоциста по transuterine микроинъекции происходит: видео представляет идеальный результат для transuterine микроинъекции в E11.5 и E12.5 отоциста. Mistargeting отоциста обычно возникает в результате инъекционного слишком поверхностно, слишком глубоко, или неадекватно сфабриковано пипетки. На рисунке 2 показаны эти условия. ПанельПоказывает, боковой вид на левой стороне E12.5 эмбриона изображено просвечивание после успешного transuterine микроинъекции быстро зеленый раствор в отоциста. Задний мозг (HB) выглядит как клин-образным вырезом на спинной отоциста. Глаз (е) имеет кольца пигмента по периферии и левой передней лапы является заметным. Основной ствол основной вены головы (PHV) только под отоциста. Отоциста наполняется быстро зеленых, которая появляется черный: спинной, эндолимфатического канал (ЭД) и вестибюль отоциста (OC) можно различить. Успешное нападение на E11.5-12.5 отоциста всегда будет представлять ясно различимы канал эндолимфатического и вестибюль. Группа "показывает и то же изображение, как в белой, без маркировки, чтобы облегчить критическое рассмотрение вводится отоциста.

Рисунок 2
Рисунок 2. Живописные руководство по mistargeting отоциста по transuterine microinjecТион. Все панели показывают левой боковой вид E12.5 эмбриона мозга и левого переднего мозга, за исключением группы H, который является вид сверху на задний мозг, средний мозг региона. Панели в каждой строке представления изображений одного и того же эмбриона. См. обсуждение для детального объяснения причин отоциста mistargeting. Сокращения: е, левый глаз; издание, эндолимфатического проток; FG, быстрый зеленый, HB, задний мозг, фунт, зачатка конечности; оо, отоциста, OT, ушной территории; р, пипетки, PHV, первичная вен головы, пт, пипетки.

Поверхностная инъекция является общей причиной mistargeting. Панели БЫТЬ продемонстрировать поверхностное введение в E12.5 зародыш. Задний мозг (HB) выемка и слуховым территории (а, круг) очевидны в этом слева, сбоку. Микроинъекции пипетки (р) находится на переднем плане. Быстрый зеленый (FG) начинает извлечь из пипетки (B), и с последующими импульсами давления инжектор (CD), краситель проникает в овальной форме. Распределение йэлектронной красителя означает, что она была введена между стенкой матки и внутренних органов желточного мешка, внеэмбриональной мембрана, которая окутывает exocoelomic полости. Экспериментатор не следует пытаться повторно целевой отоциста в зародыше, но должны двигаться к следующему эмбриона. Несколько инъекций коррелирует со снижением эмбриональной выживаемости, эффект, который стоит более остро, чем в E11.5 E12.5.

Глубокое введение является более частой причиной mistargeting. Панели FH продемонстрировать инъекции траектории, которая проходит через слуховой территории в задний мозг. Основной вены головы (PHV), левый глаз (е) и пипетка (р), которые очевидны в этом сбоку от E12.5 эмбриона. Первоначальный выброс быстро зеленый (FG) смещается дорсально по отношению к основной вены головы / ушной территории. В последующие импульсы, клиновидный задний мозг (HB) был полностью заполнен быстрыми зеленый (группа G). 90 градусов вращение вводят эмбрионов позволяет обнаруживать быстро зеленый в hindbraВ полость от спинной стороны (группа H). Обе поверхностные и глубокие инъекции в результате неспособности воспринимать глубину микроинъекции пипетки после того, как вступает в контакт с маткой. Практический подход, который хорошо работает заключается в продвижении пипетки через матку, а затем сразу импульсы раз искать порыв быстро зеленый: расположение слоеного показывает приблизительное положение пипетки. Регулировка глубины на основе этого диапазона вывод импульса.

Недостаточно сфабриковано пипетки являются наиболее распространенной причиной mistargeting. Инъекций попытка показано на панели ИК было проведено с кончиком пипетки, которая была сломана вручную, но не скошенный. Боковой вид на E12.5 эмбрион показывает задний мозг (HB), левый глаз (е), и микроинъекции пипетки (р). Обратите внимание, что пипетки (пт) резко поклонился и не удалось проникнуть в матку (панель I). Применение дополнительных сил ножницы кончике пипетки (группа J, стрелка), в результате чего пунктЕТТЕ кончик встроенный в матке. Небольшое количество быстро зеленый (FG) был изгнан из пипетки перелом и увидел на поверхности матки. Встроенный пипетки (группа К) должны быть удалены с тонкой, стерильные щипцы и удаления в виде отходов острых предметов. Если кончик пипетки не могут быть расположены или полностью удален, усыпить плотины под наркозом.

Документ процедурные замечания по хирургии мыши лист выживание данных: важный элемент в обучении этих методов к документу замечания и внести коррективы на основе этих наблюдений. Подготовка операции мышь выживания спецификации и обратите внимание предоперационной, оперативного и послеоперационного информации. Предоперационная данные включают плотины вес, дозу анестетика доставлено, плазмиды впрыском и т.д. Оперативные данные включают в зародыше впрыском (например, R2 является второй эмбрион из яичника в правый рога матки), качество инъекций (т.е. не эндолимфатического канала обнаружения красителя в 4 Мышь выживания хирургии Data Sheet "). Качество примечания являются основой для принятия продуктивных методологических уточнений, что приведет к успешным результатам.

Использовать текущие доставлен в импульсе для оптимизации эффективности трансфекции: площадь импульсов волна состоит из 5 43volt, 50 мс импульсы с 950msec средизадержки импульса. 5 мм, платина, электроды веслом стиль гарантировать, что весь слуховой территория содержится в электрическом поле. Подобные эффективность трансфекции может быть достигнуто с 3мм весла, хотя они более трудно точно позиционировать. Парадигма импульса была оптимизирована путем оценки текущего переданы в эмбрион во время финального импульса, а не охвативший напряжения и оценки эффективности трансфекции. Это объясняется тем, что нынешний доставлен в импульсе меняется при постоянном напряжении в зависимости от проходимости электрической связи между маткой и платиновыми электродами. Предполагая, что матка недавно орошаемых раствором лактата Рингера непосредственно перед размещением весел и носителей заряда присутствует в избытке, главный переменная количество "связи" давление на матку с веслами. Нежное давление на 43volts результаты <60mAmps текущего доставлен и спорадические трансфекции в лучшем случае. Умеренное давление на 43vизмерение потерь приводит к 60-100mAmps доставки и наиболее эффективным трансфекции. Тяжелое давление на 43volts результаты> 100mAmps доставлены и коррелирует с постоянно изменили частоту сердечных сокращений и повышение эмбриональной смертности. Избыточное давление разрывает висцерального желточного мешка ("поп" может ощущаться через весла) и приводит к эмбриональной летальности. Вполне вероятно, что переменная давление, изменяет сопротивление между электродами, которые влияют на текущие доставки. Импульс частотой 1 Гц (один 50 мс импульс в секунду) был определен как наименее разрушительным для сердечного цикла эмбриона, что является позитивным коррелируют для эмбрионального выживания. Мы считаем, что наиболее важным параметром для мониторинга в создании эффективной парадигмы электропорации естественных является текущим доставлен в импульсе. Модификация любой импульс парадигма должна включать в себя тщательный мониторинг текущей доставлен в импульсе.

Принять модульный подход к обучению гоэлектронной техники: Модуль 1: Практика хирургии притворство при маточных экстернализации, но не вводить или electroporate. Плотины терпеть вентральной лапаротомия очень хорошо и никогда не должны испытывать послеоперационные осложнения, связанные с хирургической техники. Мышь выживание хирургические навыки, несомненно, проживающий в доме учреждение так проводить адекватную подготовку. Достижение мастерства хирургических навыков, прежде чем приступить. Модуль 2: Практика transuterine микроинъекции в отоциста на анестезию плотины без ожидания завершения операции выживания: усыпить плотины под наркозом, изолировать впрыском эмбрионов, а также оценить качество отоциста инъекций. Модуль 3: Цель только 2 otocysts в 2 разных эмбрионов с быстрым зеленый, не electroporate, завершить операцию, и проверки вниз эмбриональной выживаемости. Модуль 4: Цель только 2 эмбрионов с ДНК / быстрый зеленый раствор, electroporate, проверки вниз эмбриональной выживаемости, и выяснить трансфекции эффекттивность. Модуль 5: Цель только 2 эмбрионов с ДНК / быстрый зеленый раствор, electroporate, вводить Alexa Fluor в 4-й желудочек для обозначения манипуляций эмбрионов, выбрать помечены эмбрионов на P0, и выяснить эффективность трансфекции.

Процедурные кривой обучения: Овладение методами выживания мышей хирургии, с соответствующим руководством ветеринарных и хирургических сотрудников своей родной вуз, достаточно быстрый и требуется только 3-5 плотин на сумму практики для новичков, чтобы получить знания. Transuterine микроинъекции и в естественных условиях электропорации для получения полезно трансфицированных внутреннего уха потребуется 10-50 плотины, стоит усилий, предполагая, что существует 6 работоспособной эмбрионов на беременность и модульный подход следует. Те студенты, которые пользуются виды деятельности, требующие тонкой моторики (например, игре на музыкальных инструментах, шитье, модель решения, или конкурентные легкая атлетика) имеют более короткие сроки, чем подготовка Тхосебе, что это не так. Критическая коррелирует для успешного овладения этими методами скрупулезное внимание к деталям (например, микроинъекции пипетки изготовление, анатомия сосудов, явно заметок) и достаточно спокойное поведение.

Рабочий процесс: после экспертизы получили, можно ожидать и инъекционных electroporating 4-6 эмбрионов в плотине, 3-5 эмбрионов выживут, а 2-4 эмбрионов будет полезно трансфицированных внутреннего уха для анализа. Задний мозг Alexa Fluor маркировка техники для маркировки эмбрионов для сортировки при рождении требуются дополнительные инъекции задний мозг в каждом электропорации эмбриона, но это хорошо переносится и не оказывает отрицательного влияния процедурной эффективности. Таким образом, скорость восстановления полезно трансфицированных внутреннего уха от электропорации в естественных условиях выгодно отличается от скорости восстановления гомозиготных мутантных мышей с heterogygous парадигмы разведения. С опытом, 2-3 плотин в экспериментатор в день является разумным работырасход: 1,5 часа на плотине к операции и в общей сложности 1,5-2 часа для послеоперационного мониторинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Sterilizing Case Roboz Surgical Instruments Co. RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12
Needle driver Fine Science Tools 12502-12
Allergy Syringe Tray BD Biosciences 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter Internationl Inc. 2B2323
Fast green Sigma-Aldrich F7258
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Micr–lectrode Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International, Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International, Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin Corporation 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056
Horizontal laminar flow clean bench Envirco Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers www.ssponline.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. Sutter. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics