Author Produced

開発マウス内耳への遺伝子導入による

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

マウス内耳は、その発達プログラム妊娠中に詳述されているプラ​​コード由来の感覚器官である。我々は定義され

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

、卵形嚢と球形嚢の斑およびコイル蝸牛のコルチ器官半規管の膨大部の3クリステ:哺乳類の内耳は、6異なる感覚上皮を持っています。コルチ器官における聴覚有毛細胞は、1を聞くための主要なトランスデューサている間。クリステと斑は、バランスの特別な感覚を補助するために機械的刺激を伝達する前庭有毛細胞が含まれてい三半規管と蝸牛のこれらの感覚上皮および形態形成における細胞運命の仕様では、マウスの妊娠第2週に行われ、大部分は出生2,3前に完了されています。マウス内耳の発達の研究は、日常的に4,5の細胞および/ ​​または形態学的表現型の分子的基盤への洞察を得るために別の胚または出生後の段階でトランスジェニック胚を採取して実施しています。我々は子宮内での開発、マウス内耳にその遺伝子伝達を仮定する</ em>は、利得と損失の機能研究の文脈で哺乳類の内耳の開発6の根底にある遺伝的メカニズムの尋問のための伝統的なマウスの遺伝子組換えへの無料アプローチを表しています。

開発マウス内耳における遺伝子強制発現研究を実施するための実験パラダイムは、ここで示した3つの一般的な手順に解決される:1)腹開腹2)transuterineマイクロインジェクション、3) 生体内エレクトロポレーションインチ腹開腹術は、移植胚は7〜実験的なアクセスを得るために子宮の外部化を可能にするマウスの生存率手術手技である。 Transuterineマイクロインジェクションは、耳胞や耳胞の内腔に発現プラスミドを導入するための面取り、ガラスキャピラリーマイクロピペットを使用することである。in vivoでのエレクトロポレーションでは、前駆細胞の8-10に発現プラスミドを駆動するために方形波、直流パルスのアプリケーションです。

11の各ステップで詳細なメモが含まれています。マウスの実験発生学的テクニックが散文から学び、静止画だけでは困難な場合があります。本研究では、我々は、遺伝子導入の手順の3つのステップを示しています。最も批判的に、我々は正確にどのように表示するためにデジタルビデオ顕微鏡をデプロイします。1) 子宮内で胎児の向きを識別する、2)耳胞に注射を標的とするための胚を再設定する、3)耳胞にトレーサー染料溶液と混合し、DNAを顕微注入胚の日11.5と12.5 4)注入された耳胞をエレクトロポ、5)ラベルは、出生時に出生後の選択のための胚をエレクトロポレーション。一般的な方法論的なエラーを回避する方法について説明;耳胞mistargetingの最も一般的な原因に絵のガイド、私たちは正常にトランスフェクトし、内側の耳の代表的な例を提供し、 子宮 g 書くための本ガイドラインエン転送動物ケアのプロトコル。

Protocol

1。腹開腹

  1. ペントバルビタールナトリウム麻酔液(グラム体重あたり7.5μL)の腹腔内注射によって、その胚を胚11.5日(膣栓が検出された日の正午には胚発生の日0.5ですE11.5)にあるダムを麻酔。麻酔液作業;無水エタノールを100μL、65 mg / mLの水溶液を硫酸マグネシウム(子宮のトーンを調節する)の320μL、50 mg / mLのペントバルビタールナトリウム溶液18​​0μLおよびプロピレングリコール400μL(と車両の混和を、水性および有機コンポーネント)。
  2. 足のスクイズを、テールピンチ、そして頬と鼻毛タッチへの応答を点滅させる:有害刺激テストを実施することにより麻酔の完全性を評価します。角膜に無菌眼軟膏を適用します。
  3. 恥骨部から鋏で胸郭と細かい刃(オスター#40ブレード)に腹部の毛を剃る。 70%エタノールで腹部、10%ポビドンヨード(Betadine)、消毒ND 70%エタノール、順番に。場所は、滅菌ドレープの上にマウス腹部面を下にして、2から5分の加熱パッドや温かいプレート(37℃)に設定された。
  4. ボール先端はさみで腹側正中の腹部皮膚を切開。 10〜14ミリメートルのための切開を拡張します。 白線 、腹壁の腹側正中線に沿って血管、白の結合組織のバンドを識別します。ボールがはさみをひっくり返して白線を切開して切開10〜14ミリメートルを拡張します。すぐに温め(37℃)乳酸リンゲル液で腹部を灌漑。
  5. 注入部位に過度の圧力を適用せずにリング鉗子で子宮の二本の角を外部化します。予熱し、乳酸リンゲル液で外部化された子宮角を灌漑。

2。 Transuterineインジェクション

  1. 12月16日μ:次のような特性を持つ厚肉、ホウケイ酸ガラスキャピラリーマイクロインジェクションピペットを作製メートルの外径と20度のベベル。 、圧力= 200;速度= 46; = 0を引く時間= 100)熱=ランプのテストに加えて3台:小さなボックスフィラメントとサッターP-97ピペットプラーで、次のプログラムを使用します。サッターBV-10 bevelerで、大口径のピペット用104C(金)の研磨ディスクを使用します。カルシウム遊離リン酸で3-4μg/μLのプラスミドで再懸濁し式は液(pH 7.4)緩衝生理食塩水。濃縮されたDNAは、30秒間穏やかにボルテックスし、10秒、10,000 gでスピンに結晶の高速グリーンを追加します。視覚的に注射の有効性を追跡するために要求される高速グリーンの最小量は、経験的に決定されています。 DNA /ファストグリーンソリューションを斜め​​ピペットのバックフィル。圧力インジェクタ(Picospritzerは、ソースガスとして、> 99%純粋な窒素を使用して)ピペットホルダーにロードされたインジェクションピペットを接続します。
  2. 低強度は、その注入サイト内の胚を視覚化するためのハロゲンライトで子宮を光を通過させる。 BEAを識別するティン心臓、脳胞、肢芽、後脳の発生期の 4脳室、アイ。子宮を温めておいで2分毎に灌漑、水和を維持するためにリンゲル液を乳酸。胚の方向、位置を変更すると上記のように解剖学的ランドマークを識別するために、子宮にやさしい圧力を適用します。
  3. 東洋の前部と後部枝脇腹耳胞が存在する間葉系領域のプライマリ頭静脈を識別するための胚。適切な耳胞は、子宮の透視によって見ることができません。耳胞は、静脈の主幹と一緒に、アメリカンフットボールのフィールド上に支柱またはゴールポストの形状を形成し、主頭静脈の前部と後部の枝の間の中間に位置しています。耳胞は、支柱の間に中間です。
  4. 耳胞の推定位置と線の軌跡で子宮を介して注入ピペットを挿入します。 uterを通過した後、一度インジェクターパルスを発生私達は、トレーサー色素およびピペットチップのおおよその位置を可視化する。深さを評価するために、再びマイクロ制御とパルスの下にピペットを進めています。さらに繰り返して外側頭の間充織とパルスにピペットを進めています。成功した耳胞のターゲティングは、背側リンパ管と前庭のホタテ貝殻形状のテーパー形状を明らかにする。子宮に圧力を解放し、1モーションで胚/子宮からピペットを削除し、すぐに温めて子宮を灌漑、リンゲル液は乳酸。

(3)in vivoでのエレクトロポレーション

  1. 乳酸リンゲル液で子宮を灌漑。新たに適用された乳酸リンゲル液は、電気的にカップルパドルスタイルの電極に子宮に必要である。乳酸リンゲルと電極のタングステンの表面を湿らせます。電極のパスの中心に注入耳胞。静かにエレクトロポレーションpaで子宮を圧迫ddles。カソードは、注入された耳胞に横方向の子宮壁に接触しているとアノードuninjected耳胞に隣接した子宮壁と接触している。エレクトロでフットペダルスイッチ付方形波パルス列をトリガします。エレクトロポレーションパラメータは次のとおりです。パルスあたりの43ボルト、950ミリ秒のパルス間の遅延で5、50ミリ秒のパルス。パルスが配信された直後に子宮を灌漑。組織に供給される電流を記録する:60から100 mAmpsは、耳の上皮前駆細胞をトランスフェクトするのに十分である。ダムごとに4-6、E11.5の胚を注入し、エレクトロポ。
  2. 内側の耳のあるそれらの胚の 4脳室への水性蛍光デキストラン(発現プラスミドは、緑色蛍光タンパク質をコードしている場合のAlexa Fluor 488発現プラスミドは、赤色蛍光タンパク質またはアレックスFluor 594のをエンコードしている場合)の第二の、独立したtransuterineマイクロインジェクションを実行します。正確に注入し、パルス当たりの電流の少なくとも60 mAmpsは事実であったエレクトロポレーション中ンプのほう。蛍光デキストランは、後脳では出生時に検出でき、内側の耳(3.5を参照)胚発生時に操作された仔の選択が可能になります。
  3. 乳酸リンゲルと子宮角を灌漑。腹腔内に子宮角を挿入します。予熱し、乳酸リンゲル液2-4 mLで子宮腔をフラッシュし、オーバーフローが滅菌ドレープに切開部位の外に排出することができます。乾燥、滅菌材料とドレープを交換してください。非切削針と6から0吸収性縫合糸で腹壁を縫合。我々は腹壁と皮膚の両方について、他のすべてのステッチをロックして、ランニングステッチを好む。
  4. ダムの毛皮を乾燥させ、皮下注射により非ステロイド性抗炎症などのメロキシカムとして管理することができます。滅菌ドレープで温め回復ケージにダムを返します。ダム '呼吸、切開部位の開存性と、流血の放電のために膣を監視し、記録します。出血は、RAである彼女は全身麻酔下にある間、再が存在し、衰えない場合には、ダムを安楽死させる。彼女は意識と歩き回るしようとする試みを取り戻す時間に注意してください。彼女は食べたり飲んだりの兆候を示しており、巣を構築し始めたときにマウスの植民地にダムを返します。通常、これは12時間以内に発生します。
  5. 出生時(生後0日目)、フラッシュGFPまたはテキサスレッドフィルタでstereofluorescence解剖顕微鏡を用いた蛍光デキストランを検出するごみの各子犬の後脳領域は、必要に応じて設定します。後脳のラベルを表示し、それらの仔だけ授乳中のダムに戻ります。

4。代表的な結果

図1
図1。開発蝸牛へエレクトロポレーションによる遺伝子導入。E11.5耳胞をコードする発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)とエレクトロポレーション(パルスTRAを注入したパラメータ:5、50ミリ秒/パルス、950ミリ秒のパルス間の遅延)で43ボルトのパルス。耳胞蝸牛の中間ターンを介して基地からEGFP発現を示すE11.5で注入し、エレクトロポレーションされた子犬生後6日目(P6)からA)代表的な内耳。蝸牛の外側壁は、中間ターンの頂点のみから削除されました。頂点を生じさせるE11.5前駆細胞はトランスフェクションしていませんでした。 B)で蝸牛の免疫染色ホールマウント(A)は、有毛細胞のマーカーで、ミオシン7aの(MYO7A)は、そのEGFPの発現はコルチ器官の軌跡をたどり、著しく髪細胞有利子感覚上皮に局在していることを示します。耳胞E11.5で注入し、エレクトロポレートしたE18.5胚からC)代表的な内耳。レーザー共焦点投影MYO7A陽性感覚毛細胞のEGFP発現を示しています。 EGFP expressioを示すコルチE18.5臓器から蝸牛感覚上皮のD)レーザー共焦点顕微鏡投影nの内側の有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、インナーphalangial細胞(IPC)、柱細胞(PC)、およびダイテルス '細胞(DC)であった。 (B)中のスケールバーは()に適用されます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

開発マウス内耳への遺伝子導入:マウス内耳は、着床後の開発12,13の最初の週の間に耳プラコードから発生する。胎生9.5(E9.5)で、プラコードは陥入しており、耳胞2と呼ばれる液体で満たされた小胞に変身。小胞の耳前駆体は、成熟した内耳など前庭と聴覚感覚上皮に機械的に敏感な有毛細胞を支配するニューロン内の感覚と非感覚細胞を生じさせる。後期胚の段階では、内耳の膜迷路の複雑な3次元形態は3,12を確立されています。ゲインおよび機能喪失実験的な治療法は、典型的には、細胞の運命仕様とパターン形成などの発生過程の遺伝的調節への洞察を得るために、マウスの遺伝子組換えによって実行されます。開発マウス内耳のダイナミックな遺伝子操作子宮は、マウスの実験発生学6,11夫婦の遺伝子導入技術、マウスの遺伝子組換えへの無料アプローチを表しています。

ウイルスやエレクトロポレーションによる遺伝子導入技術が開発内耳6,11,14,15で遺伝子発現を操作するために開発されている。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、感覚や非感覚細胞型を生じさせるとマウスの有毛細胞16内のカルシウム依存性エキソサイトーシスの分子基盤を調べるために使用されている耳の前駆細胞に感染します。 AAVベクターは、内耳の幅広い表現を可能にする高力価を生成し、別のウイルスの血清型は、差動細胞発現のために有利であるかもしれませんユニークな親和性を表示します。欠点はmisexpressedすることができる遺伝子の大きさや、作る、精製、およびウイルスの力価にウイルス学的専門知識の必要性を制限する固定スタッフィング容量が含まれています。エレクトロポレーションによる遺伝子TRansferは、 生体内 6 感覚有毛細胞の運命を指定することで基本的なヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子の役割を評価するために使用されています。ゲートウェイのサブクローニング技術に適応した発現プラスミドは、目的遺伝子とIRES配列17からの蛍光マーカータンパク質の発現を駆動するユニークなプロモーターとベクトルの迅速かつ効率的な構築を可能にします。興味のある遺伝子が使用されるプロモーターに応じて出生後の内耳に固執することができるエレクトロポレーションと表現の24時間以内に耳前駆体で表現することができます。プラスミド構築、精製、濃縮、定量は標準的な分子生物学的技術を必要とします。欠点は、〜8キロバイト上記のプラスミドサイズが大きくなると、ほとんどのウイルスベクターに比べて胚性致死率が高いように、in vivoトランスフェクション効率低下しています。エレクトロポレーションおよびウイルス媒介遺伝子導入技術の両方がマウスの実験発生学的技術の習得を必要とするniques:生存胚の子宮内操作手術、およびtransuterineマイクロインジェクション。本稿の目的は、デジタルビデオ顕微鏡により各重要な方法論のステップを示すことによって、後者の問題に対処することです。

ビデオの方法論ノート:我々は故意に視聴者がダムの肉眼解剖学との関係で腹側正中の位置を見ることができるので、撮影しながら滅菌フィールドに切開部位をドレープしないことを選んだ、すなわち、意図的にほとんどのぼやけた頭(フレームが認識できる)、四肢、尾。切開部位を立体裁断することを効果的に、このビューをブロックして、腹開腹および注入シーケンスの間に空間的に関連する解剖学的関係を理解するための努力を混乱させることができます。しかし、我々は外科的無菌状態を維持するために無菌のフィールド上に外部化された子宮角の残りの部分というダムの腹部をドレープをお勧めします。さらに、意図的に悪魔にしようとしなかったこれらのメソッドは、獣医師または有資格の手術技術の専門家の指導によって学習する必要があるため、腹壁と皮膚の外科的切開の縫合をtrate。博士マルセルI.ペレ-Gentilの(サンアントニオのテキサス大学)は、 "獣医縫合の原則"は、彼の資料では、絵の表現に完了し、このトピックの優れた議論を提示する18

手続きの推奨事項:開発マウス内耳への遺伝子導入は、技術的に挑戦されています。変動のかなりの量を排除し、成功した成果を確保するためのベストプラクティスのシリーズがあります。我々は、この実験的なアプローチを学習を促進するには、以下の具体的な提言を行う。

マウスの生存手術動物のケアのプロトコルを開発するために獣医スタッフを参照してください:哺乳類の生存手術のため動物のケアプロトコルが生成するために要求しているので、麻酔、鎮痛、および周術期ケアを定義し、調整する必要があります。申請者のプロトコルの中核を形成することができる言語を含む動物ケアプロトコルの開発、の詳細については、補足情報( "を参照してください。として提供されている動物ケアプロトコルの開発 ")。さらに、ご自宅の機関の動物のケアおよび使用委員会(IACUC)と獣医スタッフは間違いなく要求に応じて適切なプロトコルの策定に追加のガイダンスを提供します。

子宮内遺伝子導入のための専用のマウスの生存手術領域を確立する:それは体腔を危うくするので、腹開腹手術は大手術に分類されています。最もIACUCsは、主要なマウスの生存手術用の滅菌、クラス100の環境を必要としません。むしろ、適切な照明、ベンティを含む専用領域lation、補助暖房、ハード、非多孔性、駆除の表面は、おそらく必要になります。我々は、感染からマウスを保護する生理的ストレスを低減し、水平層流フード内で私たちの生存の手術を実施し、それによって設備の術後回復することを好む。電源遺伝子導入装置に拡張された電気回路;我々は、双方向、低ワットのハロゲントラック照明を含む振動減衰、水平層流フード(Envirco LF 630)にカスタム一連の変更を定義し、ベンチトップの切り欠きと凹の電源コンセントコー​​ド通路のために。これらの変更の詳細な回路図は、補足情報( "を参照してください。として提供されている子宮内遺伝子導入の層流フードを ")。あなたはマウスのsuに特化されている適切な場所を定義するには、あなたの動物のケアのプロトコルを開発するようにIACUCを参照してください手術rvival。

ペントバルビタールナトリウム麻酔を投与する前に最寄りの0.1グラムにダムの重量を量る:ペントバルビタールナトリウムは、効果的な麻酔薬であると推奨される投与スケジュールが続いているときに作業時間の少なくとも105分を提供します。注入する麻酔薬の混合物の投与量を計算する前に、各ダムの正確な体重を決定します。ダムの体重を推定することはありません。ベクトンDikisonからアレルギーシリンジトレイ針と注射器を使用します。人間のベベルは、妊娠マウスへの非外傷性腹腔内注射に適しています。また、この注射器は非常に低いデッドスペースの容積を持ち、一般的に、その胚E11.5またはE12.5であるダムのために必要な麻酔薬量の範囲で校正されています。

胚の生存率をサポートするために予防的鎮痛をデプロイします。など、縫合線に局所麻酔薬を管理するBupivicaine、およびそれ以前の鎮痛薬は、ダムは麻酔から回復する時間によってボード上にあるように、リカバリ·ケージ内にダムを配置するなどメロキシカムとして全身、非ステロイド性抗炎症薬、、。ダムに不快感を減らすことは健康な妊娠の術後の回復と維持を容易にします。

ベベルマイクロインジェクションピペットしっかりと外径の制約:胚性致死の単一の最も一般的な原因は、組織および/ ​​または不完全に構築され、マイクロインジェクションピペットから血管の損傷です。 E11.5マウス耳胞にマイクロインジェクションTransuterineは、古い胚における大規模な臓器(すなわち、脳胞、目、手足など)への注入とは異なる制約を運びます。 Unbeveled、悪い面取り、または不適切に大きな外径のピペットは、胚の生存率を減少させる子宮、内臓卵黄嚢の血管系、および/またはE11.5で胚の血管からの出血の原因となります。それは可能ですするための適切なベベルを運ぶ小さな直径の耐久性のあるピペットを手で破るが、それはそう定期的に行うことは困難である。その小さな耳胞のターゲットであるE11.5マウス胚は、容赦のないであろう。ピペットの設計と製造19完全な会話のサッター·インスツルメンツのP-1000 P-97ピペットクックブック2011を参照してください。本研究で使用したピペットのパラメータは、上記のされ、その製造は、完全に以前に11議論されています。サッター·インスツルメンツBV-10 bevelerの取扱説明書の手続きノートも優れたリソースです。

transuterineマイクロインジェクションによって耳胞をmistargetingが発生した理由を理解する:ビデオでは、E11.5およびE12.5耳胞にマイクロインジェクションtransuterineための理想的な結果を提示します。耳胞をMistargetingは、通常、あまりに深く、あまりにも表面的に注入するから、あるいは不十分な作製ピペットからの結果。図2は、これらの条件を示しています。パネル耳胞への高速グリーンソリューションの成功transuterineマイクロインジェクション後、透視により撮像されたE12.5胚の左側の側面図を示しています。後脳(HB)は、耳胞の背側楔形ノッチとして表示されます。目(e)は、その外周に沿って、顔料の輪があり、左前肢は顕著である。主頭静脈(PHV)の主なトランクがちょうど耳胞の下にある。耳胞は、黒が表示され、高速グリーンで満たされている:背、内リンパ管(ED)と耳胞の前庭(OC)が識別できる。 E11.5-12.5耳胞の正常なターゲティングは常に明確に識別できる内リンパ管と前庭を提示します。パネル "は、注入された耳胞の重要なレビューを容易にするために、白いラベルなしの場合と同じイメージを示しています。

図2
図2。 transuterine microinjecで耳胞をmistargetingに絵のガイドる。すべてのパネルには、後脳、中脳領域の背側ビューでパネルHを除いて、脳までと脳の左とE12.5胚の左側の側面図を示しています。各行のパネルは同じ胚のイメージを表しています。耳胞mistargetingの原因の詳細な説明の説明を参照してください。略語:E、左眼、ED、リンパ管、FG、ファストグリーン、HB、後脳、ポンド、肢芽、OC、耳胞、OT、耳領土、P、ピペット、PHVは、プライマリ頭静脈、PT、ピペットチップ。

表面的な注入はmistargetingの一般的な原因です。パネルは、E12.5受胎に表面的な注入を実証することができます。後脳(HB)ノッチと耳領土(OT、サークル)は、この左、側面図で明らかである。マイクロインジェクションピペット(p)はフォアグラウンドになっています。ファストグリーン(FG)は、ピペットチップ(B)から、圧力インジェクタ(CD)、楕円形に染料拡散からの後続のパルスを取り出すことから始まります。番目の分布電子染料は、それが子宮壁および内臓卵黄嚢、exocoelomic空洞を包んで体外膜との間に導入されたことを示唆している。実験者は、この胚の耳胞を再ターゲットを試みるべきではありませんが、次の胚へ移動する必要があります。複数回の注入が減少した胚の生存率、E12.5よりE11.5でより深刻である効果と相関する。

深い注入はmistargetingのより一般的な原因です。パネルFHは、後脳に耳領土を通過する射出軌跡を示しています。主頭静脈(PHV)は、左眼(E)、およびピペット(p)はE12.5胚のこの側面図で明らかである。ファストグリーン(FG)の最初の放出は、主頭静脈/耳の領土に関して背ずれている。後続のパルスで、くさび形の後脳(HB)が完全にファストグリーン(パネルG)で満たされていた。注入された胚の90度の回転がhindbra内での高速グリーンを検出することができます。背のビュー(パネルH)から空洞インチそれは子宮との接触を落札後、マイクロインジェクションピペットの深さを感知することができないから、両方の表面と深部の注射の結果。うまく実践的なアプローチは、子宮を介してピペットを進め、その直後に速いグリーンのパフを探すために一回パルスすることです。パフの位置は、ピペットチップのおおよその位置を示しています。この測距パルスに基づいて深さを調整します。

不十分な試作ピペットはmistargetingの最も一般的な原因です。パネルのIKに示すように、注入の試みは手動で壊れていますが、面取りされていないピペットの先端を行った。 E12.5胚の側面図は、後脳(HB)、左眼(e)、およびマイクロインジェクションピペット(p)を示しています。ピペットチップ(PT)が大幅に弓であり、(パネルI)子宮を貫通して失敗したことに注意してください。付加的な力のアプリケーションでは、PIPを残して、ピペットの先端(パネルJ、矢印)をハサミETTE先端が子宮内に埋め込まれた。ファストグリーン(FG)に少量の骨折ピペットから排出され、子宮の表面を発見しました。埋め込まれたピペットチップは、(パネルK)の罰金、滅菌ピンセットで除去すると鋭利物廃棄物として廃棄しなければならない。ピペットチップが置かれたり、正常に削除できない場合は、麻酔下でダムを安楽死させる。

マウスの生存の手術のデータシート上の文書、手続きの観測:これらの方法を学習する重要な要素は、観測を文書化し、それらの観察に基づいて調整を行うことです。マウスの生存の手術のデータシートを生産し、術前の手術、および術後の情報に注意してください。術前のデータは、ダムの重量、麻酔配信の投与量、プラスミド注入などの手術データ(すなわち、R2は右子宮角の卵巣から二番目胚である)胚の注入を含む、注射の品質(すなわち、内リンパが含まれていダクトは、4の染料を検出マウスのサバイバル術データシート ")。品質·ノートでは、成功した成果につながる生産的な方法論の改良を行うための基礎を形成する。

43volt、950msec間で50ミリ秒パルス、方形波パルス列が5で構成されています。トランスフェクション効率を最適化するために、パルスごとに供給される電流を使用しパルス遅延。 5ミリメートルプラチナ、パドルスタイルの電極は、全体の耳の領土が電界内に含まれていることを確認してください。彼らは正確に位置がより困難であるけれども同じようなトランスフェクション効率は、3ミリメートルパドルを実現することができます。パルスパラダイムがない電圧を介して掃引し、トランスフェクション効率を評価することによって、最後のパルスの間に胚に転送電流を評価することによって最適化された。根拠は、パルス当たりの供給される電流は、子宮と白金電極間の電気的結合の開存性に応じて一定の電圧で変化することです。子宮は、新たに直前キャリアが過剰に存在するパドルや電荷を配置する乳酸リンゲル液で洗浄していると仮定すると、チーフ変数はパドルで子宮に適用される "カップリング"圧力の量です。最高の状態で現在配信され、散発的なトランスフェクションの<60mAmpsで43volts結果で穏やかな圧力。 43Vでの適度な圧力60 100mAmpsでOLTS結果が配信され、最も効率的なトランスフェクション。 >の100mAmpsで43volts結果に重い圧力が配信され、永続的に変更され、心拍数と相関すると胚性致死を増加させた。過度の圧力は、内臓卵黄嚢(以下、 "ポップ"はパドルを介して感じられる場合があります)破裂と胚性致死を引き起こします。それが適用された変数は圧力が供給される電流に影響を与える電極間のインピーダンスを変化させる可能性があります。 1Hzの(1秒あたり50ミリ秒パルス)のパルス周波数は、胚の生存のための相関が正である胚の心臓サイクルに少なくとも破壊として定義されています。我々 、in vivoエレクトロポレーションのパラダイム効率を確立するために監視するための最も重要なパラメータは、パルスごとに供給される電流であると結論付けている。任意のパルスパラダイムの変更は、パルスごとに供給される電流の慎重なモニタリングを含める必要があります。

学習番目にモジュラーアプローチを採用電子技術:モジュール1:子宮の表出と偽手術を練習しますが、注入またはエレクトロポません。ダムは非常によく腹開腹手術に耐え、手術手技に関連した術後の合併症を経験するべきではありません。マウスの生存率外科手術のスキルは、間違いなくそう適切な訓練を追求する家庭機関に常駐しています。続行する前に、手術スキルの習得を実現しています。モジュール2:麻酔下でダムを安楽死させる注入された胚を分離し、耳胞の注入の品質を評価する:生存の手術を完了するのを期待せずに麻酔をかけたダムの耳胞に実践transuterineマイクロインジェクション。モジュール3:ターゲットの高速グリーンと2つの異なる胚のわずか2 otocysts、エレクトロポ手術を完了し、下流の胚の生存率を検証しません。モジュール4:DNA /ファストグリーンソリューションは、エレクトロポ下流の胚の生存率を検証し、把握するトランスフェクションEFのターゲットは2胚FICIENCY。モジュール5:DNA /ファストグリーンソリューションを持つ唯一の2胚ターゲット、エレクトロポ、操作胚にラベルを付ける 4脳室にのAlexa Fluor®を注入し、P0で標識した胚を選択し、トランスフェクション効率を確かめる。

手続き型の学習曲線:マウスの生存手術技術の習得、自分の在籍大学の獣医や手術スタッフから適切な指導とは、かなり迅速であり、専門知識を得るために初心者のための練習の3-5ダム·価値のみを要求する必要があります。有用トランスフェ内耳を生成するTransuterineマイクロインジェクションおよび in vivoエレクトロポレーションでは、6有効な妊娠当たりの胚およびモジュラーアプローチが続いているがあると仮定して、努力の10から50のダム-価値がある必要があります。 (すなわち、楽器、ミシン、モデル作り、または競争力陸上競技を再生)細かい運動のスキルを必要とする活動を楽しむそれらの学生は、カントーより短い研修期間を持っているしないSE。これらのメソッドの成功を習得するための重要な相関関係は、詳細(すなわち、マイクロインジェクションピペット製作、血管の解剖学、明示的なノートの取り方)と合理的に穏やかな物腰に細心の注意があります。

ワークフロー:一度専門知識が得られる、1は4-6ダムあたりの胚に注入し、electroporating予想することができます。3月5日胚は生き残るでしょう。と2-4胚の有用分析のために内側の耳をトランスフェクトしています。出生時にソートするためのラベルの胚の後脳のAlexa Fluor®標識法は、各エレクトロ胚の後脳の追加注入を必要としますが、これは良好な忍容されており、悪影響手続きの効率化には影響しません。したがって、in vivoでのエレクトロポレーションより便利にトランスフェクトし、内側の耳の回収率はheterogygous繁殖パラダイムからホモ接合体変異マウスの回収率に好意的に比較しています。経験と、日あたりの実験2〜3ダムは、合理的な作業です流量:1.5手術のためのダムごとに時間と術後モニタリングのための1.5から2時間の合計。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgements

私たちは、もともとリファレンス11の130ページに登場し、マイクロインジェクションピペットの作製図を公開する許可をヒューマナプレスに感謝し、ビデオ撮影のためにラリーDlugasとスティーブン·ウォン、教育コミュニケーションのOHSU部、ビデオのデザインと編集のためのラリーDlugas、アダムM. O "クイン、シニアデザイナー、技術的な回路図を提供するため、カスタムの水平層流フードとLesゴールドスミスを設計するためのトリオン/ Envirco、ビクターMonterroso、MV、MS、PhDは、トム·Chatkupt、DVM、比較医学のOHSU部、指導のための私達の動物のケアのプロトコル、手術手技、および予防的鎮痛療法、マルセル·ペレ-Gentilの、DVM、MS、獣医縫合のテクニックで彼の資料を共有するため、私たちのAdobe Premiere Proのビデオ顕微鏡のコンピュータワークステーションを設計するためのエドワードPorsov、MS、およびリア白と(ポートランド、オレゴン州)キャプションLNSのジョナスヒンクリー。この作品は、難聴とオットの国立研究所からの補助金によって支えられてrのコミュニケーション障害:DC R01 008595とDC R01 008595-04S2(JB)およびP30 DC005983(オレゴン聴覚研究センターコアグラント、ピーター·ガレスピー、主任)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Sterilizing Case Roboz Surgical Instruments Co. RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12
Needle driver Fine Science Tools 12502-12
Allergy Syringe Tray BD Biosciences 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter Internationl Inc. 2B2323
Fast green Sigma-Aldrich F7258
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Micr–lectrode Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International, Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International, Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin Corporation 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056
Horizontal laminar flow clean bench Envirco Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers www.ssponline.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. Sutter. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics