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Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par

Neuroscience

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Summary

L'oreille interne de souris est un organe placode dérivé sensorielle dont le développement du programme est élaboré pendant la gestation. Nous définissons un

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Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

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Abstract

L'oreille des mammifères intérieure dispose de 6 épithélium sensoriel distincte: 3 crêtes dans les ampoules des canaux semi-circulaires; macules de l'utricule et le saccule, et l'organe de Corti dans la cochlée enroulée. Le crêtes et macules contiennent des cellules ciliées vestibulaires que transduisent stimuli mécaniques servent les sens particulier de l'équilibre, tandis que les cellules ciliées auditives dans l'organe de Corti sont les principaux transducteurs pour entendre 1. Spécification du destin cellulaire dans ces épithéliums sensoriels et de la morphogenèse des canaux semi-circulaires et la cochlée se déroulera durant la deuxième semaine de gestation chez la souris et sont en grande partie achevé avant la naissance 2,3. Des études de développement de l'oreille de souris intérieure sont effectuées régulièrement par la récolte d'embryons transgéniques à différents stades embryonnaires ou postnatale afin de mieux comprendre la base moléculaire de cellulaire et / ou morphologique phénotypes 4,5. Nous émettons l'hypothèse que le transfert de gène à l'oreille de souris en développement in utero intérieure </ Em> dans le contexte de gain de-et la perte de fonction des études représente une approche complémentaire à la transgenèse souris traditionnelle pour l'interrogation sur les mécanismes génétiques qui sous-tendent le développement des mammifères oreille interne 6.

Le paradigme expérimental de mener des études dérégulation de gènes dans l'oreille interne de souris en développement ont démontré ici résout en trois étapes principales: 1) une laparotomie ventrale; 2) la microinjection transutérine et 3) électroporation in vivo. Laparotomie ventrale est une technique chirurgicale la survie des souris qui permet l'externalisation de l'utérus pour accéder expérimental aux embryons implantés 7. Microinjection transutérine est l'utilisation de verre, biseautées micropipettes capillaires à introduire le plasmide d'expression dans la lumière de la vésicule otique ou otocyst. In vivo électroporation est l'application d'onde carrée, impulsions de courant pour diriger l'expression plasmide dans des cellules progénitrices 8-10.

11. Souris techniques expérimentales embryologiques peut être difficile à apprendre de la prose et les images fixes uniquement. Dans le présent travail, nous démontrons les 3 étapes de la procédure de transfert de gène. La plupart des critiques, nous déployons la microscopie vidéo numérique pour montrer précisément comment: 1) déterminer l'orientation embryon in utero; 2) réorienter embryons à des fins de ciblage des injections à l'otocyst; 3) micro-injection d'ADN mélangé avec un traceur colorant dans la solution otocyst aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5; 4) électroporer la otocyst injecté, et 5) embryons d'étiquettes électroporés pour la sélection postnatale à la naissance. Nous fournissons des exemples représentatifs de succès transfectées oreille interne, un guide illustré sur les causes les plus courantes de mauvais ciblage otocyst; discuter de la façon d'éviter les erreurs communes méthodologiques et des lignes directrices actuelles pour l'écriture d'un in utero gène protocole de transfert des soins aux animaux.

Protocol

1. Laparotomie ventrale

  1. Anesthésier un barrage dont les embryons sont à jour embryonnaire 11,5 (E11.5; midi le jour un bouchon vaginal est détecté, c'est le jour de 0,5 développement embryonnaire) par injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium solution anesthésique (7,5 uL par gramme de poids corporel). Solution de travail anesthésique: 180 ul de 50 mg / ml solution de pentobarbital sodique, 100 uL d'éthanol absolu, 320 ul de 65 mg / ml de sulfate de magnésium aqueuse (module tonus utérin), et 400 ul de propylène glycol (miscible véhicule avec aqueuse et organique composants).
  2. Évaluer l'exhaustivité de l'anesthésie en effectuant des tests de stimuli nocifs: squeeze patte; réponse et un clin d'tactile joue et vibrisses; pincement de la queue. Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les cornées.
  3. Rasez la fourrure abdominale de la zone sus-pubienne à la cage thoracique avec des ciseaux et une lame fine (Oster n ° 40 de la lame). Désinfecter l'abdomen avec de l'éthanol 70%, povidone iodée 10% (Bétadine), une éthanol 70%, de manière séquentielle. Placer la souris l'abdomen vers le bas sur un champ stérile et puis définissez sur un coussin chauffant ou une assiette chaude (37 ° C) pendant 2-5 minutes.
  4. Incisez la peau de l'abdomen sur la ligne médiane ventrale avec le ballon-ciseaux à bouts. Elargir l'incision pour 10-14 mm. Identifier la ligne blanche, un avasculaire, bande blanche du tissu conjonctif le long de la ligne médiane ventrale de la paroi abdominale. Incisez la ligne blanche avec boule ciseaux à bouts et d'étendre l'incision 10-14 mm. Rincer immédiatement l'abdomen avec préchauffé (37 ° C) solution de Ringer lactate.
  5. Externaliser les deux cornes de l'utérus avec une pince à anneaux, sans appliquer une pression excessive sur les sites d'implantation. Irriguer les cornes utérines externalisés avec préchauffé, solution de Ringer lactate.

2. Microinjection transutérine

  1. Fabriquer une paroi épaisse, une pipette capillaire en verre borosilicate microinjection avec les caractéristiques suivantes: 12-16 μm diamètre extérieur et un biseau de 20 degrés. Sur un extracteur Sutter P-97 de la pipette avec filament petite boîte, utiliser le programme suivant: test de rampe de chaleur = plus de 3 unités; pression = 200; tirez = 0; vitesse = 46; temps = 100). Avec le Sutter BV-10 chanfreiner, utilisez la 104C (d'or) disque abrasif pour les pipettes de grand diamètre. Expression Resuspendre plasmide à pg 3-4 / uL dans le phosphate de calcium libre une solution saline tamponnée (pH 7.2-7.4). Ajouter cristallin vert rapide à l'ADN, tourbillon concentré doucement pendant 30 secondes, et tourner à 10.000 g pendant 10 secondes. Le montant minimum de vert rapide nécessaire de suivre visuellement l'efficacité de l'injection est déterminé de manière empirique. Remblayer la pipette biseauté avec l'ADN / solution rapide vert. Connecter le pipette micro-injection chargé au support de pipette de la pression (Picospritzer utilisant> 99% d'azote pur comme gaz de source) d'injecteur.
  2. Transilluminez l'utérus avec une faible intensité, la lumière halogène pour visualiser l'embryon au sein de son site d'implantation. Identifier le BEATing coeur, du cerveau, les bourgeons des vésicules des membres, naissante 4 e ventricule du cerveau postérieur et les yeux. Irriguer l'utérus toutes les 2 minutes avec préchauffé, de solution de Ringer lactate pour maintenir l'hydratation. Appliquez une légère pression sur l'utérus pour réorienter l'embryon et d'identifier les repères anatomiques indiqué ci-dessus.
  3. Orient l'embryon afin d'identifier la veine primaire dont la tête antérieure et postérieure flanc branches sur le territoire mésenchymateuse dans lequel le otocyst réside. Le otocyst adéquate ne peut être vu par transillumination de l'utérus. Le otocyst est situé à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine tête primaire qui, avec le tronc principal de la veine, former la forme des montants ou des montants de but sur un terrain de football américain. Le otocyst est à mi-chemin entre les montants.
  4. Insérer la pipette d'injection dans l'utérus dans une trajectoire en ligne avec l'emplacement présumé de l'otocyst. Impulsions de micro-injecteur l'une fois après avoir traversé le uterde visualiser le colorant marqueur et le approximative l'emplacement de la pointe de pipette. Avancez la pipette sous le contrôle de micromètre et pulser à nouveau pour évaluer la profondeur. Faire progresser la pipette dans le mésenchyme latérale de la tête et le pouls à plusieurs reprises. Ciblage otocyst réussie permettra de connaître la forme conique du conduit endolymphatique dorsalement et le pétoncle shell-forme du vestibule. Relâcher la pression sur l'utérus, retirer la pipette de l'embryon / utérus en un seul mouvement, et immédiatement irriguer l'utérus avec préchauffé, solution de Ringer lactate.

3. Électroporation in vivo

  1. Irriguer l'utérus avec une solution de Ringer lactate de. Solution fraîchement appliqué Ringer lactate est nécessaire pour coupler électriquement les électrodes à aubes de style à l'utérus. Humidifier les surfaces de tungstène des électrodes avec de Ringer lactate. Centre l'otocyst injecté dans le trajet des électrodes. Compresser doucement l'utérus avec le pa électroporationddles. La cathode est en contact avec la paroi utérine en dehors de la otocyst injecté et l'anode est en contact avec la paroi utérine adjacente à la otocyst non-injecté. Déclencher un train d'impulsions d'ondes carrées avec le commutateur pédale sur le électroporateur. Paramètres d'électroporation sont les suivants: 5, 50 ms à 43 volts impulsions par impulsion et de 950 ms d'interruption d'retard. Rincer immédiatement l'utérus après le train d'impulsions est livré. Enregistrez le courant délivré au tissu: 60-100 mAmps est suffisante pour transfecter otiques progéniteurs épithéliaux. Injecter et électroporer 4-6, les embryons E11.5 par barrage.
  2. Effectuer une seconde, la micro-injection d'une solution aqueuse indépendante transutérine fluorescente dextrane (Alexa Fluor 488 si le plasmide d'expression codant pour une protéine fluorescente rouge ou Alex Fluor 594 si le plasmide d'expression codant pour une protéine fluorescente verte) dans le ventricule 4 ème de ces embryons intérieure duquel sont oreilles précision injecté et au moins 60 mAmps de courant par impulsion était delivered pendant électroporation. Le dextran fluorescent sera détectable à la naissance dans le cerveau postérieur et permettre la sélection des chiots dont les oreilles ont été manipulés intérieure cours de l'embryogenèse (voir 3.5).
  3. Irriguer les cornes utérines avec de Ringer lactate. Réinsérez les cornes utérines dans la cavité abdominale. Rincer la cavité utérine avec 2-4 ml de préchauffée, solution de Ringer lactate et de permettre le débordement de s'écouler du site d'incision sur le champ stérile. Remplacer le drapage à sec, du matériel stérile. Suturer la paroi abdominale avec une aiguille non-coupe et une suture résorbable 6-0. Nous préférons un point en cours d'exécution, chaque point de blocage d'autres, à la fois pour la paroi abdominale et la peau.
  4. Séchez la fourrure des barrages et d'administrer des non-stéroïdiens anti-inflammatoires tels que le méloxicam par injection sous-cutanée. Retour du barrage à la cage de récupération préchauffé sur un champ stérile. Surveiller et enregistrer la respiration des barrages, la perméabilité du site d'incision et le vagin pour la décharge sanglante. Le saignement est rare, mais si elle est présente et sans relâche, euthanasier le barrage alors qu'elle est encore sous anesthésie. Notez le temps qu'elle reprenne conscience et tente de se déplacer. Retour du barrage de la colonie de souris quand elle montre des signes de manger et de boire et a commencé à construire le nid. Typiquement, cela se produit dans les 12 heures.
  5. À la naissance (jour postnatal 0), le flash de la région du cerveau postérieur de chaque chiot dans la litière pour détecter la fluorescence de dextrane en utilisant un microscope à dissection avec un stereofluorescence GFP ou le Texas Red jeu de filtres, le cas échéant. Retour au barrage en lactation seulement les chiots qui affichent étiquetage rhombencéphale.

4. Les résultats représentatifs

Figure 1
Figure 1. Le transfert de gènes à médiation électroporation de la cochlée de développement. Le otocyst E11.5 a été injecté avec une expression accrue de codage plasmide protéine fluorescente verte (EGFP) et électroporé (TRA d'impulsionsdans les paramètres: cinq, 43 impulsions volts à 50 ms / impulsion et 950 msec d'interruption d'attente). A) représentant l'oreille intérieure à partir d'un jour après la naissance 6 (P6) dont la chiot otocyst a été injecté et une électroporation à E11.5 démontrant l'expression EGFP de la base à travers la spire médiane de la cochlée. La paroi latérale de la cochlée a été retiré de la spire médiane et le sommet seulement. Progéniteurs E11.5 qui donnent lieu à l'apex n'ont pas été transfectées. B) de montage entier immunocoloration de la cochlée à (A) avec le marqueur de cellules ciliées, 7a myosine (Myo7a), indique que l'expression EGFP suit la trajectoire de l'organe de Corti et est grossièrement localisée sur les cheveux cellule-palier épithélium sensoriel. C) Une oreille intérieure représentant d'un embryon dont E18.5 otocyst a été injecté et une électroporation à E11.5. La projection laser confocal montre expression de l'EGFP dans Myo7a-positifs cellules ciliées sensorielles. D) Laser de projection confocale de l'épithélium sensoriel cochléaire de l'organe de Corti E18.5 indiquant EGFP expression dans les cellules ciliées internes (IHC), les cellules ciliées externes (OHC), les intérieurs des cellules phalangial (IPC), les cellules pilier (PC), et les cellules de Deiters (dc). La barre d'échelle en (B) s'applique à (A).

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Discussion

Le transfert de gènes à l'oreille de souris en développement interne: L'oreille de la souris intérieure se développe à partir de la placode otique pendant la première semaine du développement post-implantation 12,13. Par jour embryonnaire 9.5 (E9.5), la placode a invaginé et transformé en une vésicule remplie de liquide appelé le otocyst 2. Précurseurs otiques dans la vésicule donner lieu à des cellules sensorielles et non sensorielles au sein de l'oreille interne matures ainsi que les neurones qui innervent les cellules ciliées mécaniquement sensibles dans l'épithélium vestibulaire sensoriel auditif et. En fin stades embryonnaires, le complexe, en 3 dimensions la morphologie du labyrinthe membraneux de l'oreille interne est établi 3,12. Gain-et la perte de fonction des modalités expérimentales sont généralement effectuées par transgenèse de la souris pour mieux comprendre la régulation génétique des processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et la formation de structures. Dynamique manipulation génétique de l'oreille de souris en développement interne enutero représente une approche complémentaire à la transgenèse de la souris que les couples techniques de transfert de gènes avec la souris l'embryologie expérimentale 6,11.

-Virus et l'électroporation à médiation techniques de transfert de gènes ont été développées pour manipuler l'expression des gènes dans le développement de l'oreille interne 6,11,14,15. Viral adéno-associé (AAV) infecter les progéniteurs auriculaires qui donnent lieu à des types de cellules sensorielles et non sensorielles et ont été utilisés pour interroger la base moléculaire de l'exocytose dépendante du calcium dans les cellules ciliées de la souris 16. Produire des vecteurs AAV des titres élevés qui permettent l'expression large dans l'oreille interne et les différents sérotypes viraux afficher tropisme unique qui peut être avantageux pour l'expression cellulaire différencié. Les inconvénients comprennent une capacité de bourrage fixe qui limite la taille du gène qui peut être mal exprimés et l'exigence d'expertise virologique à faire, purifier, et le titre des virus. Tr gène électroporation à médiationansfer a été utilisé pour évaluer le rôle d'un facteur de transcription hélice-boucle-hélice de base en précisant le destin des cellules sensorielles de cheveux in vivo 6. Plasmides d'expression adaptés à la technologie sous-clonage passerelle permettre la construction rapide et efficace des vecteurs avec des promoteurs uniques entraîner l'expression d'un gène d'intérêt et une protéine marqueur fluorescent à partir d'une séquence IRES 17. Les gènes d'intérêt peuvent être exprimées en précurseurs otiques dans les 24 heures de l'électroporation et d'expression peut persister dans l'oreille interne postnatale selon le promoteur utilisé. Construction du plasmide, la purification, la concentration, et la quantification ne nécessitent que moléculaire standard compétences biologiques. Les inconvénients comprennent diminué l'efficacité de transfection in vivo que la taille augmente au-dessus plasmide 8kb ~ et un taux plus élevé de létalité embryonnaire par rapport à des vecteurs viraux les plus. Les deux électroporation et de virus à médiation techniques de transfert de gènes exigent la maîtrise de la souris expérimentale technologie embryologiqueniques: la chirurgie de survie, dans la manipulation des embryons in utero, et la micro-injection transutérine. L'objectif de ce manuscrit est d'aborder la dernière question en démontrant chaque étape critique méthodologique par microscopie vidéo numérique.

Notes méthodologiques sur la vidéo: Nous avons délibérément choisi de ne pas se draper du site de l'incision avec un champ stérile pendant le tournage de sorte que le spectateur pouvait voir la position de la ligne médiane ventrale par rapport à l'anatomie du barrage, c'est à dire, la tête (délibérément floue dans la plupart des des cadres, mais reconnaissables), des membres et la queue. Draper le site de l'incision bloque efficacement ce point de vue et peut confondre les efforts visant à apprécier l'espace pertinentes rapports anatomiques lors de la laparotomie ventrale et une séquence d'injection. Toutefois, nous recommandons de drapage de l'abdomen de la mère de sorte que le reste externalisée utérine cornes sur un champ stérile pour maintenir l'asepsie chirurgicale. En outre, nous avons délibérément choisi de ne pas tenter de démonstrer suture des incisions chirurgicales dans la paroi abdominale et la peau, parce que ces méthodes doivent être appris par des conseils d'expert d'un vétérinaire ou un technicien qualifié chirurgicale. Dr Marcel I. Perret-Gentil (Université du Texas à San Antonio), présente une excellente discussion sur ce sujet, avec les représentations picturales, dans son document intitulé «Principes de suture vétérinaire." 18

Recommandations de procédure: transfert de gènes à l'oreille de souris en développement interne est techniquement difficile. Il ya une série de meilleures pratiques qui permettra d'éliminer une quantité substantielle de la variabilité et garantir de bons résultats. Nous formulons des recommandations spécifiques ci-dessous pour faciliter l'apprentissage de cette approche expérimentale.

Consultez le personnel vétérinaire pour développer la survie de la souris la chirurgie des soins protocole sur les animaux: Le protocole de soins des animaux pour la chirurgie de survie chez les mammifères est exigeant pour produire depuissoins d'anesthésie, l'analgésie et périopératoire doit être définis et coordonnés. Une discussion détaillée de l'élaboration du protocole des soins aux animaux, y compris la langue qui peuvent former le noyau d'un protocole d'un candidat, à titre d'information supplémentaire (voir « le soin des animaux d'élaboration de protocole "). En outre, de protection des animaux vos établissements d'origine et du Comité des Utilisations (IACUC) et du personnel vétérinaire sera sans doute fournir des indications supplémentaires sur la formulation d'un protocole adapté à la demande.

Créer un espace dédié de la souris de survie une intervention chirurgicale pour le transfert de gène in utero: laparotomie ventrale est une annonce comme une chirurgie majeure, car elle compromet une cavité du corps. La plupart des IACUC ne nécessitera pas une solution stérile, classe 100 pour la chirurgie de la souris l'environnement de survie majeur. Plutôt, un espace dédié qui comprend un bon éclairage, ventilation, chauffage d'appoint, et dur, non poreux, surfaces pouvant être désinfectés seront probablement nécessaires. Nous préférons mener notre opération de survie dans une hotte à flux laminaire horizontal qui protège la souris de l'infection, réduit le stress physiologique, et donc la récupération post-opératoire des installations. Nous avons défini une série de modifications personnalisées à une oscillation amortie, hotte à flux laminaire horizontal (Envirco 630 LF) qui comprennent directionnelle, l'éclairage à faible puissance piste d'halogène; élargi circuit électrique à l'équipement de transfert de puissance du gène, et prises de courant encastrées avec des découpes paillasse pour le passage du cordon. Un schéma détaillé de ces modifications est fournie en tant qu'information complémentaire (voir " Hotte à flux laminaire en transfert génique in utero »). Consultez votre IACUC que vous développez votre protocole de soins des animaux pour définir un emplacement convenable qui se consacre exclusivement à la souris survival chirurgie.

Peser le barrage à 0,1 gramme avant d'administrer l'anesthésie du pentobarbital de sodium: Le pentobarbital sodique est un anesthésique efficace et fournir au moins 105 minutes de temps de travail lorsque la posologie recommandée est suivie. Déterminer un poids corporel précis pour chaque barrage avant de calculer la dose de mélange anesthésique à injecter. Jamais estimer le poids du corps du barrage. Utilisez l'aiguille Plateau allergie seringue et la seringue de Becton Dikison: le biseau de l'homme par voie intradermique est idéal pour atraumatiques injections intrapéritonéales à des souris enceintes. En outre, cette seringue a un volume de l'espace extrêmement faible morts et est calibré pour la gamme des volumes anesthésiques généralement requises pour les barrages dont les embryons sont à E11.5 E12.5 ou.

Déployer une analgésie prophylactique pour soutenir la survie des embryons: Administrer un anesthésique topique sur la ligne de suture, commeBupivacaïne, et une approche systémique, non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien, comme le méloxicam, avant de placer le barrage dans la cage de récupération de sorte que les analgésiques sont à bord au moment où le barrage se remet de l'anesthésie. Réduire l'inconfort dans le barrage facilite la récupération post-opératoire et l'entretien d'une grossesse saine.

Coniques pipettes de la micro-injection et étroitement limitent le diamètre extérieur: La cause la plus fréquente de la létalité embryonnaire est un tissu et / ou des dommages vasculaires à partir de pipettes microinjection mal construites. Microinjection transutérine dans le otocyst E11.5 souris porte contraintes différentes de celles d'injection dans les grands organes dans les vieux embryons (c.-à-vésicules du cerveau, des yeux, des membres, etc.) Unbeveled, mal biseautée, ou de manière inappropriée grandes pipettes diamètre extérieur sera provoquer des saignements à partir de navires dans l'utérus, le viscéral du sac vitellin système vasculaire, et / ou de l'embryon à E11.5, ce qui diminuera la survie des embryons. Il est possibleà la main briser pipettes durables de petit diamètre qui transportent un biseau approprié, mais il est difficile de le faire régulièrement. L'embryon de souris E11.5, dont la petite otocyst est la cible, sera impitoyable. Consultez le livre de recettes P-1000 P-97 2011 à partir de la pipette Instruments Sutter pour un discours plein sur la pipette conception et la fabrication 19. Paramètres pour les pipettes utilisées dans ce travail sont notés ci-dessus et leur fabrication a été entièrement discuté précédemment 11. Les notes de procédure dans le manuel du propriétaire pour le Sutter Instruments BV-10 chanfreiner sont aussi une excellente ressource.

Comprendre pourquoi le mauvais ciblage otocyst par microinjection transutérine se produit: La vidéo présente le résultat idéal pour la microinjection transutérine dans le E11.5 E12.5 et otocyst. Mauvais ciblage de la otocyst résulte habituellement de l'injection trop superficielle, trop profondément, ou à partir de pipettes mal fabriqués. La figure 2 illustre ces conditions. PanneauUne montre une vue latérale du côté gauche d'un embryon E12.5 imagée par transillumination après microinjection transutérine succès de la solution de vert rapide dans le otocyst. Le cerveau postérieur (hb) apparaît comme une dorsale encoche en forme de coin à l'otocyst. L'oeil (E) présente un anneau de pigment long de sa périphérie et la patte antérieure gauche est proéminente. Le tronc principal de la veine tête primaire (PHV) est juste en dessous de la otocyst. Le otocyst est rempli avec du vert rapide qui apparaît en noir: la dorsale, canal endolymphatique (ed) et le vestibule de la otocyst (oc) peuvent être discernés. Un ciblage réussi de la E11.5-12.5 otocyst présentera toujours un conduit endolymphatique clairement perceptible et le vestibule. Groupe A »montre la même image que dans A sans l'étiquetage blanc pour faciliter l'examen critique de la otocyst injecté.

Figure 2
Figure 2. Un guide illustré de mauvais ciblage de la otocyst par transutérine microinjection. Tous les panneaux montrent la vue latérale gauche d'un embryon E12.5 avec le mésencéphale et la gauche du cerveau antérieur, à l'exception Groupe H, qui est une vue dorsale de la région du cerveau postérieur, le mésencéphale. Panneaux de chaque rangée représentent des images de la même embryon. Voir la discussion pour une explication détaillée des causes de mauvais ciblage otocyst. Abréviations: e, œil gauche; ed, endolymphatique conduit; fg, vert rapide, hb, rhombencéphale; lb branche, bourgeon; oc, otocyst; ot, territoire otique; p, pipette; phv, veine tête primaire; pt, pointe de la pipette.

Injection superficielle est une cause fréquente de mauvais ciblage. Panneaux ÊTRE démontrer une injection superficielle dans les E12.5 conceptus. Le cerveau postérieur (hb) encoche et le territoire otique (ot, cercle) sont évidents dans cette gauche, vue latérale. La pipette de micro-injection (p) est au premier plan. Vert rapide (fg) commence à éjecter de l'embout de pipette (B), et avec des impulsions ultérieures de la pression (CD) d'injecteur, le colorant diffuse dans une forme ovale. La distribution des ee colorant suggère qu'il a été introduit entre la paroi utérine et le viscéral du sac vitellin, une membrane extra-embryonnaire qui enveloppe la cavité exocoelomic. L'expérimentateur ne doit pas tenter de re-cibler le otocyst dans cet embryon, mais devrait passer à l'embryon prochaine. Les injections multiples en corrélation avec la survie des embryons a diminué, un effet qui est plus aigu à E11.5 E12.5 que.

Injection en profondeur est une cause plus commune de mauvais ciblage. Panneaux FH démontrer une trajectoire d'injection qui traverse le territoire otique dans le cerveau postérieur. La veine principale tête (PHV), l'œil gauche (e), et la pipette (p) sont évidents dans cette vue latérale d'un embryon E12.5. L'éjection initiale du vert rapide (fg) est déplacé dorsalement par rapport à la veine la tête primaire / territoire otique. Avec des impulsions ultérieures, le cerveau postérieur en forme de coin (hb) a été complètement rempli avec le vert rapide (Groupe G). Une rotation de 90 degrés de l'embryon injecté permet la détection de vert rapide au sein de la hindbradans la cavité de la vue dorsale (Groupe H). Les deux résultat superficiel et profond injections de l'incapacité à percevoir la profondeur de la pipette de micro-injection après avoir fait contact avec l'utérus. Une approche pratique qui fonctionne bien est de faire progresser la pipette dans l'utérus, puis immédiatement à émettre une impulsion pour chercher une bouffée de vert rapide: l'emplacement de la bouffée indique la position approximative de la pointe de la pipette. Réglez la profondeur à partir de cette impulsion de télémétrie.

Pipettes mal fabriqués sont la cause la plus commune de mauvais ciblage. La tentative d'injection représenté dans les panneaux IK a été réalisée avec une pointe de pipette qui a été brisée manuellement, mais pas biseautés. La vue latérale de l'embryon E12.5 montre le rhombencéphale (HB), l'œil gauche (e), et la pipette de micro-injection (p). Notez que la pointe de la pipette (pt) est fortement inclinée et n'a pas réussi à pénétrer dans l'utérus (groupe I). Application de la force supplémentaire cisaille la pointe de la pipette (Groupe J, flèche), laissant le pipette pointe intégré dans l'utérus. Une petite quantité du vert rapide (fg) a été éjecté de la pipette fracturée et a repéré la surface de l'utérus. La pointe de pipette intégrée (Groupe K) doit être enlevée avec de fines pinces stériles et jetés comme des déchets perforants. Si la pointe de la pipette ne peut pas être localisé ou supprimé avec succès, euthanasier le barrage sous anesthésie.

Documenter les observations de procédure sur une souris chirurgie fiche de survie: Un élément crucial de l'apprentissage de ces méthodes est de documenter les observations et faire des ajustements basés sur ces observations. Produire une survie chirurgie de la souris la feuille de données et de noter des informations pré-opératoire, opératoire et postopératoire. Les données préopératoires comprennent notamment le poids du barrage, dose d'anesthésique délivrée, injecté plasmide, etc données opérationnelles sont notamment l'injection d'embryons (c.-à-R2 est le deuxième embryon de l'ovaire dans la corne utérine droite), la qualité de l'injection (c.-à-pas endolymphatique gaine détectée, 4 colorant dans La survie Chirurgie Souris Fiche de données "). Notes sur la qualité forment la base pour faire productives améliorations méthodologiques qui mèneront à des résultats positifs.

Utilisez courant délivré par impulsion afin d'optimiser l'efficacité de transfection: Le train d'ondes carré d'impulsion se compose de 5, 43volt, les impulsions 50 ms avec un inter 950msecde retard d'impulsion. Le platine 5mm, électrodes de type à aubes en sorte que l'ensemble du territoire otique est contenu dans le champ électrique. Efficacités de transfection similaires peuvent être obtenus avec des palettes de 3mm, si elles sont plus difficiles à positionner avec précision. Le paradigme d'impulsion a été optimisé par l'évaluation du courant transféré à l'embryon au cours de la dernière impulsion, pas en balayant par des tensions et d'évaluer l'efficacité de transfection. La raison en est que le courant délivré par impulsion varie à tension constante en fonction de la perméabilité de couplage électrique entre l'utérus et les électrodes de platine. En supposant que l'utérus est fraîchement irriguée avec une solution de Ringer lactate, immédiatement avant de placer les palettes et les porteurs de charge est présent en excès, la principale variable est la quantité de "couplage" la pression appliquée à l'utérus avec les pagaies. Une légère pression à des résultats 43volts dans 60mAmps moins de transfection de livraison et sporadiques de courant au mieux. Une pression modérée à 43Vrésultats OLTS dans 60 100mAmps livré et la transfection plus efficace. Une forte pression à des résultats en 43volts> 100mAmps livré et est en corrélation avec la fréquence cardiaque persistante remaniée et augmentée létalité embryonnaire. Une pression excessive rompt le viscéral du sac vitellin (un «pop» peuvent se faire sentir à travers les palettes) et provoque une létalité embryonnaire. Il est probable que la pression variable appliquée modifie l'impédance entre les électrodes qui affecte le courant délivré. La fréquence des impulsions de 1 Hz (une impulsion de 50 ms par seconde) a été définie comme étant la moins perturbatrice à cycle cardiaque de l'embryon, ce qui est positif pour corréler la survie des embryons. Nous concluons que le paramètre le plus important à surveiller dans l'établissement d'un paradigme efficace dans électroporation in vivo est le courant délivré par impulsion. Modification de tout paradigme d'impulsion doit inclure une surveillance attentive du courant délivré par impulsion.

Adopter une approche modulaire de l'apprentissage etechnique de e: Module 1: Pratiquer une intervention chirurgicale fictive avec l'externalisation de l'utérus, mais ne pas injecter ou électroporation. Barrages tolérer laparotomie ventrale très bien et ne devrait jamais souffrir de complications post-opératoires liées à la technique chirurgicale. Les techniques de survie de souris chirurgicales sont sans aucun doute résidé dans l'établissement d'accueil afin de poursuivre une formation adéquate. Atteindre la maîtrise des compétences chirurgicales avant de procéder. Module 2: la micro-injection pratique transutérine dans le otocyst sur un barrage anesthésié, sans l'attente de l'achèvement de la chirurgie de survie: euthanasier le barrage sous anesthésie, isoler les embryons injectés, et d'évaluer la qualité des injections otocyst. Module 3: cible à seulement 2 otocystes dans 2 embryons différents avec vert rapide, ne électroporer, compléter la chirurgie, et de valider en aval la survie des embryons. Module 4: cibles seulement 2 embryons avec de l'ADN / solution rapide vert, électroporation, valider aval survie embryonnaire, et de vérifier la transfection efcacité. Module 5: cibles seulement 2 embryons avec de l'ADN / solution rapide vert, électroporation, injecter Alexa Fluor dans le ventricule 4 e à étiqueter l'embryon manipulé, sélectionner des embryons marqués en P0, et de vérifier l'efficacité de la transfection.

Courbe d'apprentissage de procédure: maîtrise des techniques de chirurgie de la souris les de survie, avec des orientations appropriées du personnel vétérinaire et de chirurgie de l'institution chez soi, est assez rapide et ne devrait nécessiter que des barrages 3-5 valeur de la pratique pour le novice d'acquérir une expertise. Microinjection transutérine et électroporation in vivo pour produire utilement transfectées oreille interne, il faudra 10-50 barrages-valeur de l'effort, en supposant qu'il ya 6 embryons viables par la grossesse et l'approche modulaire est suivie. Les étudiants qui aiment les activités qui nécessitent de la motricité fine (c.-à-jouer un instrument de musique, couture, modélisme, ou l'athlétisme de compétition) ont des périodes de formation plus courts que Thosoi qui ne le font pas. Les corrélats critiques pour la maîtrise réussie de ces méthodes sont une attention scrupuleuse au détail (c.-à-microinjection pipette de fabrication, de l'anatomie vasculaire, explicite la prise de notes) et un comportement relativement calme.

Workflow: expertise fois acquise, on peut s'attendre à l'injection et électroporation 4-6 embryons par des barrages; 3-5 embryons survivent, et 2-4 embryons ont utilement transfectées oreille interne pour l'analyse. Le cerveau postérieur Alexa Fluor étiquetage technique pour les embryons d'étiquettes pour le tri à la naissance nécessite l'injection rhombencéphale supplémentaire dans chaque embryon électroporé, mais cela est bien toléré et ne porte pas atteinte efficacité de la procédure. Ainsi, le taux de récupération des utilement transfectées oreille interne de électroporation in vivo se compare favorablement au taux de recouvrement des souris homozygotes mutantes à partir d'un paradigme de la reproduction heterogygous. Avec l'expérience, 2-3 barrages par l'expérimentateur par jour est un travail raisonnabledébit: 1,5 heures par barrage pour la chirurgie et un total de 1,5-2 heures pour surveillance post-opératoire.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier la presse pour Humana la permission de publier le chiffre de fabrication de micro-injection pipette qui a été publié à la page 130 de la référence 11; Larry Dlugas et Steven Wong, OHSU ministère des Communications pour l'éducation, pour la vidéographie; Larry Dlugas pour la conception et le montage vidéo; Adam M. O »Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco pour la conception de notre coutume hotte à flux laminaire horizontal et Les Goldsmith pour fournir le schéma technique; Victor Monterroso, MV, MS, PhD et Tom Chatkupt, DVM, OHSU département de médecine comparée, pour obtenir des conseils avec notre protocole de soins des animaux, des techniques chirurgicales, et prophylactiques analgésie régime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, pour le partage de son document sur les techniques de suture vétérinaires; Edward Porsov, MS, pour la conception de notre Adobe Premiere Pro vidéo microscopie poste de travail informatique, et Leah White et Jonas Hinckley du LNS sous-titrage (Portland, OR). Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national sur la surdité et d'Other troubles de la communication: DC et DC R01 008595 008595 R01-04S2 (à JB) et P30 DC005983 (Oregon audience Centre de recherche de base Grant, Peter Gillespie, chercheur principal).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Sterilizing Case Roboz Surgical Instruments Co. RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12
Needle driver Fine Science Tools 12502-12
Allergy Syringe Tray BD Biosciences 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter Internationl Inc. 2B2323
Fast green Sigma-Aldrich F7258
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Micr–lectrode Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International, Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International, Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin Corporation 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056
Horizontal laminar flow clean bench Envirco Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers www.ssponline.com

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References

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