Den

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Citrobacter rodentium infektion tilvejebringer en værdifuld model til at studere enteriske bakterieinfektioner og vært immunresponser og colitis hos mus. Denne protokol beskriver målingen af ​​barriere integritet, patogen belastning og histologisk skade giver mulighed for grundig karakterisering af patogene og vært bidrag til murine infektiøs colitis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne protokol beskriver de trin, der kræves for at producere en robust model af smitsomme sygdomme og colitis, samt de metoder, der anvendes til at karakterisere Citrobacter rodentium infektion i mus. C. rodentium er en gramnegativ, murine specifikke bakterielt patogen, der er nært beslægtet med det klinisk vigtige humane patogener enteropatogene E. coli og enterohæmoragisk E. coli. Efter infektion med C. rodentium, immunkompetente mus lider af beskeden og forbigående vægttab og diarré. Histologisk er intestinal krypt forlængelse, immun celle infiltration, og bægeret cellereduktion observeret. Clearance af infektion opnås efter 3 til 4 uger. Måling af intestinal epitelbarrieren integritet, bakteriel belastning, og histologiske skader på forskellige tidspunkter efter infektion, tillader karakteriseringen af ​​musestammer modtagelige for infektion.

Virulens mekanismes ved hvilken bakterielle patogener koloniserer tarmkanalen hos deres værter, samt specifikke vært reaktioner, der forsvarer mod sådanne infektioner er dårligt forstået. Derfor C. rodentium model af enterisk bakteriel infektion fungerer som et værdifuldt redskab til at støtte i vores forståelse af disse processer. Enteriske bakterier er også blevet forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme (IBDS). Det er blevet antaget, at de utilpasset kroniske inflammatoriske responser set i IBD-patienter udvikler i genetisk modtagelige individer efter unormal påvirkning af den intestinale mucosale immunsystem til enteriske bakterier. Derfor undersøgelse af modeller for infektiøs colitis har et betydeligt potentiale til at definere potentielt patogene vært reaktioner på enteriske bakterier. C. rodentium induceret colitis er en sådan sjælden model, som giver mulighed for analysen af værts-reaktioner på enteriske bakterier, fremme vores forståelse af potentielle mekanismer i IBD patogenese;afgørende for udviklingen af ​​nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.

Introduction

Infektion med enteriske bakterielle patogener udløser gastrointestinal (GI) inflammation, samt intestinal patologi og patofysiologi, herunder diarré og intestinale epiteliale barriere-dysfunktion. Virulensen mekanismer, hvorved bakterielle patogener koloniserer mavetarmkanalen af ​​deres værter, samt specifikke vært reaktioner, der forsvarer mod sådanne infektioner er dårligt forstået, har dog de seneste fremskridt inden for modellering af enteriske bakterielle infektioner begyndt at hjælpe vores forståelse af disse processer. Enteriske bakterier er også blevet forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme (IBDS). The IBDS Crohns Sygdom (CD) og UC er komplekse sygdomme af ukendt ætiologi, karakteriseret ved kronisk intestinal inflammation og vævsbeskadigelse. Mange musemodeller for tarmbetændelse findes, fra spontan inflammation i genetisk modificerede stammer, såsom IL10 - / - mus, til kemiske udfordringer med forbindelser såsom dextran natriumsulfat (DSS) og dinitrobenzene sulfonsyre (DNBS) 1. Det er blevet antaget, at de utilpasset kroniske inflammatoriske responser stede i IBD-patienter udvikler i genetisk modtagelige individer ved unormal påvirkning af den intestinale mucosale immunsystem til enteriske bakterier 2, således studiet af modeller af infektiøs colitis også betydeligt potentiale til at definere potentielt patogene host . svar på enteriske bakterier Citrobacter rodentium induceret colitis er et af de sjældne modeller af infektiøs colitis, der er blevet godt karakteriseret 1,3, hvilket muliggør analysen af værts-reaktioner på enteriske bakterier og en yderligere forståelse af potentielle mekanismer af IBD patogenese, et væsentligt trin i udvikling af nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.

C. rodentium er en gramnegativ fastgørelse og effacing (A / E), murine specifikke bakterielt patogen, der er tæt forbundet med den vigtige humanepatogener enteropatogene E. coli (EPEC) og entero E. coli (EHEC) 3-8. Familien af ​​A / E patogener tæt vedhæfte til den apikale værtscellemembranen af ​​den coecale og tyktarmsepitel, danner en ikke-invasiv piedestal-lignende struktur af værtscellen. Oral smitte med C. rodentium af 10 8 -10 9 organismer frembringer en robust model for infektiøs colitis kendetegnet ved colon hyperplasi eller forlængelse af krypterne, mononukleær immune celleinfiltration og bægerceller udtømning 3,4. Det oprindelige sted for kolonisering, få timer efter belastning, er på cecal patch, efterfulgt af progression til den distale colon 2 til 3 dage efter infektion 3. Hos immunkompetente musestammer, der clearance af patogenet opnået 3 til 4 uger efter infektion 1,3,4. Imidlertid mange genetisk modificerede stammer, dvs genet deficient eller knockout (- / -) er mus, vist sig at vise increased modtagelighed for infektion resulterer i overdreven skade og / eller kronisk infektion og inflammation 9-14. Brug af denne infektiøs colitis model i disse knockout-stammer, mange mangler medfødte signalproteiner, er blevet uundværlige i afsløre flere værtsproteiner integreret til løsning af intestinal infektion og inflammation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Citrobacter rodentium Inoculum og oral gavage af mus

  1. Forbered og autoklaveres Luria Bertani bouillon (LB).
  2. Opnå levedygtig C. rodentium fra en frossen glycerol lager og streak på LB agarplade med en steril podning løkke eller pipettespids. Inkuber ved 37 ° C natten over. Inokulere 3 ml sterilt LB-bouillon i en falk kultur rør med kolonier fra LB-plade under anvendelse af en podning løkke eller pipettespids. Fremstilling af inoculum bør ske under anvendelse af aseptiske teknikker.
  3. Inkubér C. rodentium kultur aerobt ved 37 ° C natten over i en benchtop inkubation rysteapparat ved 200 rpm. Den podede LB bouillon skal vises uklar efter natten kultur.
  4. Anvend en pære tippes mavesonde kanyle fastgjort til en 1 ml sprøjte til mavesonde hver mus med 100 pi af overnatskulturen C. rodentium kultur. Forsigtigt Scruff musen, ved at holde godt fast i den løse hud over sin nakke og rygmed tommelfinger og fingre. Træk tilbage dyrets hoved med din pegefinger til at immobilisere hovedet og ret spiserøret til indsættelse af tvangsfodring nål.
  5. Fastholde musen i lodret stilling og lede pære spidsen af ​​gavage kanylen langs den side af dens munding og over tungen. Forsigtigt passerer nålen langs ganen og føre det ned i spiserøret. Hvis der er nogen modstand følte under denne procedure, skal du fjerne sonde nål og sætte det i igen.
  6. Langsomt indsprøjtes 100 pi af den bakterielle inokulum og fjern forsigtigt tvangsfodring nål. Overvåg vejrtrækning og opførsel af musen efter returnere det til sit bur.

Bemærkninger:

  • I trin 2 og 3, fremstilles også en falk dyrkningsrør anvendelse af aseptisk teknik med 3 ml sterilt LB-bouillon, der skal dyrket natten over for at sikre, at der ikke er bakteriel forurening af væsken selv. Det LB bouillon skal være klar efter natten kultur.
  • Overnatskultur skal kasseres, hvis det er inokuleret i over 24 timer.
  • Alle C. rodentium infektioner og boliger fra inficerede dyr bør udføres i et biosikkerhedsniveau 2 facilitet.

2. Måling colonic epithelial barriere-permeabilitet i C. rodentium-inficerede mus

  1. Mål barriereintegritet på et ønsket tidspunkt efter infektion.
  2. På dagen for assayet, forbereder nok 4 kDa fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran opløst i phosphatbufret saltvand (PBS) til en koncentration på 80 mg ml-1 til mavesonde hver mus med 150 gl og forberede standardkurven.
  3. Scruff mus og sondeernæring med 150 pi FITC-dextran. Trække fødevarer fra buret på dette tidspunkt.
  4. Bedøve mus 4 timer eftergavaging og indsamle så meget blod som muligt (~ 450 ul) gennem hjertepunktur. Tilsæt blodet til en slutkoncentration på 3% syre-citratdextrose i et mikrocentrifugerør at forhindre koagulation. Aflive musene og indsamle colon væv i PBS i kimtal (trin 3,1 til 3,5) og i 10% formalin for vævsfiksering og i sidste ende immunofluorescens-farvning (trin 4,1-4,8).
  5. Spin blodprøverne ved 1.000 x g i 12 min i en centrifuge ved 4 ° C. Opsaml serum og fortyndes til 1/10 og 1/100 i PBS. Tilsæt 100 pi af hver prøve til disse to fortyndinger til en plade med 96 brønde i replikater.
  6. Til fremstilling standardkurven, fortynd den oprindelige 80 mg ml-1 FITC-dextran anvendes til at gavage musene i PBS til følgende koncentrationer: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 og 0 ug / ml . Tilsæt 100 pi af hver koncentration til en plade med 96 brønde in triplo.
  7. Kvantificere fluorescens i hver prøve ved anvendelse af et fluorometer ved en excitationsbølgelængde wavelength af 485 nm og 535 nm emissionsbølgelængde.
  8. Analysere de rå data ved at plotte standardkurven. Input de rå data for hver prøve i ligningen for linjen genereres af standardkurven til at bestemme koncentrationen af ​​FITC-dextran i hver prøve.

Bemærkninger:

  • Fra trin 4 og frem, holde blodprøver på is og minimere udsættelse for lys.
  • Ved måling epitelbarrieren integritet et tidspunkt ved eller før, 7 dage efter infektion er optimal, så alvorlig vævsbeskadigelse forekommer efter dette tidspunkt. Måling barriere integritet forud for alvorlig skade kan du bestemme maksimale forskelle i permeabilitet under C. rodentium infektion mellem musestammer.
  • Sikre, at ikke-inficerede kontrolmus også testes for epitelbarrieren integritet.

3. Måling af bakterier i væv af C. rodentium-inficerede mus

  1. Tilsæt 1 ml sterilt PBS and en autoklaveret metal perle til en rundbundet 2 ml centrifugeglas med aseptisk teknik. Individuelle væv opsamlet fra hvert dyr vil i særskilte PBS rør. Afvej rørene før tilsætning af vævet.
  2. Fjern coecum og colon fra musen. Adskil coecum fra tyktarmen og skubbe de luminale indhold ved hjælp pincet. Føj indholdet til en PBS rør. Efter adskillelse 0,5 cm sektioner fra den distale colon og coecum for 10% formalin fiksering, skar den resterende colon og coecum på langs og vask med sterilt PBS, før du placerer væv i rør.
  3. Afveje de PBS rør med vævet og derefter homogenisere prøverne under anvendelse af en Bead Beater i 6 minutter ved 30 Hz.
  4. Anvendelse af aseptisk teknik, 180 pi sterilt PBS per brønd tilsættes til en plade med 96 brønde. Der tilsættes 20 ul af hver homogeniserede prøve til den første brønd i hver række. Bland godt og serielt fortyndet, tilsætte 20 pi fra hver tidligere godt at få fortyndinger fra 10 -1 (første vill) til 10 -6. Plade 10 pi af hver fortynding fra hver prøve in triplo på en kvadratisk bund LB-plade med et gitter. Inkuber natten over ved 37 ° C.
  5. Tælle kolonidannende enheder (CFU), derefter gennemsnitlige de 3 tæller og registrerer den fortynding, ved hvilken hver prøve blev talt. Multiplicer gennemsnitlige CFU med 50, som 20 pi af den oprindelige 1 ml prøve blev anvendt, og med fortyndingsfaktoren, ved hvilken prøven blev talt resulterer i CFU / ml. Endelig dividere med vævet vægt til bestemmelse CFU / g.

4. Histologisk vurdering og immunfluorescensfarvning af inficeret Colon Væv

  1. Opsaml væv som i trin 3.2. Store væv i formalin natten over, derefter vaskes med 70% ethanol. Indlejre vævet i paraffin og skåret 5 um snit til farvning. Stain med hæmatoxylin & eosin til histologisk vurdering og gå videre til de følgende trin for immunfluorescensfarvning.
  2. Sådan Afparaffiner væv inden farvning, sted glider ien Coplin farvning beholder og lagt i 65 ° C vandbad i 10 min. Dernæst placer objektglassene i xylen for fire vask af 2 min hver. Objektglassene skal derefter rehydreres med to 5-minutters vaske i 100% ethanol, efterfulgt af en 5 min vask i hver af følgende: 95% ethanol, 75% ethanol og dH 2 0. Disse vaskninger bør ske i et stinkskab for at undgå udsættelse for skadelige dampe.
  3. Anbring objektglassene i Coplin krukke med forvarmet natriumcitratpuffer og derefter anbringes i en damper i 30 min, så lad sidde i 30 minutter. Denne fremgangsmåde bryder protein-tværbindinger dannet af formalinfiksering hente potentielle antigene sites.
  4. Vask med PBS azid i 5 minutter, tre gange. Tørre dias og mark området omkring væv med et PAP pen for at skabe en hydrofob barriere, holde farvningsreagenser lokaliseret på vævet.
  5. Blok væv i 1 time ved stuetemperatur med blokeringspuffer (f.eks α-gedeserum) i et immunfarvning fugt kammer.
  6. Fortynd pænary antistof til ønsket koncentration under anvendelse af antistof fortynding buffer. Hæld blokerende buffer, og der tilsættes 50 til 100 ul primært antistof i væv. Inkuber ved 4 ° C natten over eller ved stuetemperatur i 2 timer.
  7. Vask med PBS azid i 5 minutter, tre gange. Tilsættes fra 50 til 100 pi af sekundært antistof fortyndet i antistoffortynding puffer til væv og inkuber ved stuetemperatur i 1 time i mørke. Vask med dH2O i 5 minutter, tre gange.
  8. Dehydrer dias, tilføje DAPI Forlæng Guld monteringsmedium og der sættes dækglas. Vis slides under et fluorescensmikroskop.

Bemærkninger:

  • PBS azid kan være substitueret med frisk fremstillet PBS som et alternativ at undgå bakterievækst i vaskemediet fra trin 4 og fremefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under en standard infektion eksperiment musene inficeret med cirka 2,5 x 10 8 CFU ved gavage med 100 pi overnight C. rodentium kultur. Infektion af C57BL / 6 mus med C. rodentium resulterer i beskedne og forbigående vægttab og diarré. Selv om en sjælden begivenhed med C57BL / 6 mus, kan dyrene blive syg og kræver aflivning. Derfor bør mus overvåges for graden af ​​vægttab og symptomer på angst, såsom piloerect pels og krum stilling, for at bestemme i hvilket omfang forskellige stammer påvirkes af infektionen.

Resultaterne angivet i figur 1 til 4 er repræsentative for en gjort infektion ved anvendelse af en overnatskultur fremstillet ud fra en frossen glycerolstamopløsning. På dag 7 efter infektion blev musene bedøvet, og blod blev opsamlet ved hjertepunktur. Figur 1 viser FITC-dextran målt i serumaf C57BL / 6 mus, fra såvel som Toll like receptor 2 (TLR2) knockout mus, der tidligere har vist sig at udvise nedsat epitelbarrieren integritet under infektion 9. I nærvær af et intakt intestinal epitelbarrieren, er 4 kDa FITC-dextran dårligt gennemtrængelige gennem dette lag. Derfor forøgede niveauer af FITC-dextran i serum antyder en forringelse af intestinal epitelbarrieren integritet under infektion tillader dette molekyle at sive igennem. Som en kontrol, der serumniveauer i ikke-inficerede mus sondeernæret med FITC-dextran også præsenteret.

En uge efter infektion, er bakterielle belastninger i colon vist sig at toppe omkring 10 9 CFU / g 3,4. Bakterielle belastninger kan måles i den ønskede tidspunkter efter infektion for at bekræfte infektion, såvel som til at vurdere, om forskellige knockout-mus lider af forøgede eller formindskede bakterielle byrder. Som C. rodentium er en luminal patogen, som kan intimt adhere til tarmepitelceller, bakterielle belastninger i de luminale indhold, cecal og colon væv kan måles. Figur 2 viser typiske bakterielle belastning målt på dag 7 efter infektion cecal og colon-væv og i den intestinale lumen i C57BL / 6 mus.

Det meste af patologien iagttaget under C. rodentium infektion hos C57BL / 6 mus forekommer i de distale 2 cm af colon11. Makroskopisk på dag 7 efter infektion, er en fortykkelse af colon mucosa samt en afkortning i længden af ​​tyktarmen observeret, med ringe åbenlys beskadigelse ses i C57BL / 6 mus. Normalt under infektion, C57BL / 6 mus lider kun moderat inflammation og patologi histologisk karakteriseret ved immun celleinfiltration, elongering af colon krypter og bægerceller udtømning (figur 3).

Som det fremgår af H & E sektioner i figur 3, er flere host reaktioner monteret durING infektion med C. rodentium. For yderligere at karakterisere disse ændringer, kan immunfluorescensfarvning udnyttes til at undersøge ændringer i proteiner af interesse, såsom markører for spredning, celledød, eller medfødte og adaptive immunrespons. Immunfluorescensfarvning er også værdifuld i behandlingen aspekter af bakteriel reaktion, såsom dens lokaliseret i inficerede væv. Et eksempel på denne farvningsteknik, undersøger en vært protein Ki67 (rød), en markør for celleproliferation og C. rodentium protein tir, grøn, til at undersøge bakterielle lokalisering på dag 12 efter infektion er vist i figur 4.

Figur 1
Figur 1. Måling af serum FITC-dextran at vurdere epitelbarrieren integritet. Musene blevsondeernæret med 4 kDa FITC-dextran under ikke-inficerede betingelser og på dag 7 efter infektion, hvorefter serum FITC-dextran-niveauer blev bestemt. C57BL / 6 (WT) mus udviser en ubetydelig forøgelse af FITC-dextran serumniveauer efter 7 dage efter infektion sammenlignet med ikke-inficerede betingelser. I modsætning hertil TLR2 - / - har musene væsentligt forhøjede niveauer af FTIC-dextran i serum sammenlignet med baseline tyder alvorligt svækket barriere integritet i denne stamme under C. rodentium infektion, som det tidligere er blevet vist.

Figur 2
Figur 2. C. rodentium belastning i lumen, cecum og colon af inficerede C57BL / 6 mus ved 7 dage efter infektion. Lumen, cecal og colon væv blev opsamlet, homogeniseret og udpladet i serie-fortynding på LB-agar. Hver circle repræsenterer en enkelt prøve indsamlet fra individuelle dyr. Faste linier indikerer det geometriske gennemsnit, mens lodrette fejllinjer indikerer SEM.

Figur 3
Figur 3. Histologisk analyse af skader forårsaget af C. rodentium infektion. På dag 7 efter infektion moderat immune celleinfiltration, samt forlængelse af krypter, bæger celledepletering og mildt ødem observeres sammenlignet med kontrol-inficerede væv. se større tal .

Figur 4
Figur 4. Immunfluorescensfarvning på uinficerede og dag 12 efter infektiontion væv af C57BL / 6 mus. Distal colonvæv farves for værten protein Ki67 (rød) og C. rodentium protein tir (grøn).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Citrobacter rodentium infektion er en værdifuld model til undersøgelse af både smitsom sygdom og colitis hos mus. Denne unikke model giver mulighed for karakterisering af både vært reaktioner såvel som de patogene egenskaber bakterier. De skridt, der er skitseret i denne protokol detalje den vellykkede brug af denne model.

Der er flere kritiske skridt i denne protokol at huske på, når der induceres colitis og analysere svarene. For det første fremstillingen af en frisk overnatskultur C. rodentium inokulum i LB-bouillon er nødvendig for en vellykket infektion af mus. Som en dosis på 10 8 -10 9 organismer kræves til at inficere de fleste musestammer, hvis inoculum efterlades i rystebord eller på bænktoppen ved stuetemperatur i længere perioder, vil der ikke være nok levedygtige organismer er tilbage i kulturen at inducere colitis efter infektion. Det er også vigtigt at omrøre bakterielt podestof førlastning sprøjten for infektion, for at sikre, at hver mus modtager et lige dosis af bakterier. Ved indsamlingen af ​​væv ved terminalen af ​​infektionen, fuldstændig nedsænkning af colon væv i en rigelig mængde af 10% formalin kræves for korrekt vævsfiksering at forekomme. Foreslås det, at væv, hvormed formalin i et 5 ml hætteglas, og ikke i mikrocentrifugerør som et 10:1-forhold af fiksativ til væv anbefales. Korrekt fiksering er afgørende for senere histologisk analyse, og immunfluorescensfarvning af disse væv. Det er også vigtigt at huske på, at de forskellige knockout stammer vil have varierende reaktioner efter induktion af C. rodentium colitis. Når inficerer en ny stamme for første gang, skal mus overvåges nøje for at bestemme en human slutpunkt for dette forsøg, om nødvendigt. Tidspunkter til analyse af epitelbarrieren integritet, bakterielle belastninger, og histologi kan defineres baseret på reaktionen af ​​musenstamme af interesse for infektion.

Som udpladning af vævshomogenater på LB-plader for at bestemme bakterielle belastninger ikke er en fuldstændig selektiv fremgangsmåde, at udføre PCR til C. rodentium specifikt gen for bakteriekolonier kan gøres for at differentiere C. rodentium fra andre bacterialcolonies på pladen. En anden mulighed er at plade vævshomogenater på MacConkey-agar, som dette medium er mere selektiv for C. rodentium end LB agar. En alternativ fremgangsmåde er at anvende en streptomycin resistent vildtype C. rodentium stamme instead.Substitution med en streptomycin resistent stamme vil resultere i induktion af den samme colitis model beskrives i denne protokol. Fordelen ved hjælp af streptomycin resistent stamme er nemmere analyse af bakterielle belastninger, som vævshomogenater fra disse infektioner kan udpladet på LB agar suppleret med streptomycin stedet LB agar alene. Derved undgår potentiel vækst på commensal mikrober på pladen, hvilket gør CFU tælling lettere og mere nøjagtig. Et andet alternativ ved måling af bakterielle belastninger, er at inkubere pladerne efter udpladning fortyndinger af vævshomogenater på LB-agar ved enten 37 ° C natten over eller ved stuetemperatur i 2-3 dage, hvilket resulterer i langsommere bakterievækst, før tælling.

Denne protokol beskriver de trin, der kræves for at producere en robust model af infektiøs colitis, samt de metoder, der anvendes til at karakterisere C. rodentium infektion i mus. Bortset fra anvendelse af denne model til at undersøge patogen-vært-interaktioner og immunresponser, kan den også anvendes til at undersøge, hvordan en bakteriel infektion kan øge risikoen for kræft i tyktarmen. Dette kan gøres ved at udsætte C. rodentium inficerede mus til det kræftfremkaldende stof azoxymethane, eller ved at studere hvordan infektion indvirkninger på epitelcelleproliferation, eller på gener involveret i epitelcelle differentiering eller tumor udvikling 15. OsING den smitsomme colitis model er skitseret i denne protokol, kan antallet af bakterier også bliver vurderet på ekstra-tarm-sites, såsom mesenteriske lymfeknuder, milt og lever. Højere tal i disse organer kan indikere, at muse-stamme, der testes, er meget modtagelige for infektion. Ved hjælp af immunfluorescensfarvning beskrevne teknik, kan en næsten endeløs række mekanismer som reaktion på infektion undersøges. Når kendskab til de teknikker beskrevet her, kan protokollen modificeres til at indsamle væv til måling af andre slutpunkter, såsom til RNA-ekstraktion og vurdering af genekspressionsniveauer, at mere grundigt karakterisere reaktioner på C. rodentium infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af driftstilskud til BAV fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) og den canadiske Institutes for Health Research (CIHR). DK blev finansieret af en afgangselev studentship fra CIHR. BAV er de Børn med tarm-og leversygdomme (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Research og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
  2. Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16, (9), 1583-1597 (2010).
  3. Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. 1027-38 (2006).
  4. Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
  5. Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3, (4), 333-340 (2001).
  6. Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
  7. MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
  8. Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
  9. Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
  10. Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76, (11), 4978-4988 (2008).
  11. Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, (3), 618-631 (2008).
  12. Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179, (1), 566-577 (2007).
  13. Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172, (1), 433-441 (2004).
  14. Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71, (9), 5077-5086 (2003).
  15. Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80, (9), 3107-3121 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics