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Immunology and Infection

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Summary

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

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Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

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Abstract

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um ein robustes Modell von Infektionskrankheiten und Colitis zu produzieren, sowie die Methoden zur Citrobacter rodentium Infektion in Mäusen zu charakterisieren. C. rodentium ist ein gram-negative, murine bestimmte bakterielle Erreger, die eng mit der klinisch wichtige menschliche Krankheitserreger enteropathogenen E. verwandt ist coli und enterohämorrhagischen E. coli. Nach Infektion mit C. rodentium, immunkompetenten Mäusen leiden bescheiden und vorübergehende Gewichtsverlust und Durchfall. Histologisch sind Darm-crypt Dehnung, Immun-Zell-Infiltration und Becherzellen Zell-Depletion beobachtet. Clearance der Infektion wird nach 3 bis 4 Wochen erreicht. Messung der intestinalen Epithelbarriere Integrität, bakterielle Belastung und histologische Schäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, erlauben die Charakterisierung von Mausstämmen anfällig für Infektionen.

Die Virulenz Mechanismuss mit dem bakteriellen Erreger besiedeln den Darm ihrer Wirte sowie bestimmten Host Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen sind weitgehend unverstanden. Deshalb ist die C. rodentium Modell enterischen bakterielle Infektion dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Es wurde vermutet, dass die maladaptive chronischen Entzündungsreaktionen bei CED-Patienten gesehen, bei genetisch anfälligen Personen nach abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Darmbakterien zu entwickeln. Daher bietet die Studie von Modellen von infektiöse Kolitis erhebliches Potential zur Definition potentiell pathogenen Host Reaktionen auf Enterobakterien. C. rodentium induzierte Colitis ist eine solche seltenen Modell, das für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien ermöglicht,, das Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese;essentiell für die Entwicklung von neuartigen präventiven und therapeutischen Behandlungen.

Introduction

Infektion durch enterale bakterielle Erreger löst gastrointestinale (GI) Entzündungen sowie Darm-Pathologie und Pathophysiologie, einschließlich Durchfall und Darm-epitheliale Barriere Dysfunktion. Die Virulenz Mechanismen, durch die bakteriellen Erreger besiedeln den GI-Trakt der Gastgeber, sowie spezielle Host-Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen schlecht verstanden werden, haben jedoch Fortschritte in der Modellierung von enterischen bakterielle Infektionen begonnen, unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Die IBDs Morbus Crohn (CD) und UC sind komplexe Erkrankungen unbekannter Ätiologie, die durch chronische Darm-Entzündung und Gewebeschädigung gekennzeichnet. Viele Mausmodellen Darmentzündung existieren, durch spontane Entzündung in genetisch modifizierten Stämme wie IL10 - / - Mäuse, um chemische Herausforderungen mit Verbindungen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) und dinitrobenzene sulfonsäure (DNBS) 1. Es wurde vermutet, dass die Fehlanpassung chronischen Entzündungsreaktionen in IBD-Patienten bei genetisch vorbelasteten Individuen entwickeln bei einem abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Enterobakterien 2, also in der Studie von Modellen von infektiöse Kolitis auch signifikante Möglichkeit der Festlegung von potentiell pathogenen Host . Reaktionen auf Enterobakterien Citrobacter rodentium induzierte Colitis ist eines der seltenen Modelle infektiöse Kolitis, aber gut 1,3 dadurch, so dass für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien und weiteres Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese; ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung neuartiger präventiven und therapeutischen Behandlungen.

C. rodentium ist ein Anbringen und gramnegative Effacing (A / E), Murines spezifischen bakterielles Pathogen, das eng mit dem wichtigen menschlichen zusammenhängtPathogene enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) 3-8. Die Familie von A / E Pathogene innig an die apikale Wirtszellmembran der Blinddarm und Kolonepithel befestigen, Bilden einer nicht-invasiven sockelartigen Struktur auf der Wirtszelle. Oral Herausforderung mit C. rodentium von 10 8 -10 9 Organismen produziert eine robuste Ausführung der infektiöse Kolitis durch die mikrobielle Hyperplasie oder Dehnung der Krypten, einkernigen Immunzelle Infiltration und Becherzellen Zelldepletion 3,4 charakterisiert. Der Ort der ersten Besiedlung, ein paar Stunden nach Herausforderung, an der Blinddarm Patch, gefolgt von Progression zu distalen Kolon 2 bis 3 Tage nach der Infektion 3. Bei immunkompetenten Maus-Stämmen ist Clearance des Erregers 3 bis 4 Wochen nach der Infektion 1,3,4 erreicht. Allerdings sind viele genetisch veränderte Stämme, zB Gen defizient oder Knockout-(- / -)-Mäusen wurden, gefunden worden, um anzuzeigen Increased Infektionsanfälligkeit was zu Schäden übertrieben und / oder chronischen Infektion und Entzündung 9-14. Mit der Benutzung dieser infektiöse Kolitis Modell in dieser Knockout-Stämme, viele fehlen angeborenen Signalproteine, wurde bei der Aufdeckung mehrerer Wirtsproteinen integraler Bestandteil Auflösung von Darm-Infektion und Entzündung unverzichtbar.

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Protocol

Ein. Vorbereitung der Citrobacter rodentium Inokulum und orale Gabe von Mäusen

  1. Vorbereiten und autoklavieren Luria Bertani Broth (LB).
  2. Erhalten lebensfähigen C. rodentium aus einem gefrorenen Glycerin Lager und streifenfrei auf LB-Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Pipettenspitze. Bei 37 ° C über Nacht. Beimpfen 3 ml steriler LB Brühe in einen Falken Kultur Rohr mit Kolonien von der LB-Platte mit einer Impföse oder Pipettenspitze. Vorbereitung des Inokulums sollte mit aseptischen Techniken.
  3. Inkubieren C. rodentium Kultur aerob bei 37 ° C über Nacht in einer Benchtop Inkubationsschüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. Die beimpften LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur bewölkt.
  4. Verwenden Sie eine Glühlampe gekippt Magen Magensonde Nadel an einer 1 ml Spritze, jede Maus mit 100 ul der Nacht C. Magensonde rodentium Kultur. Gently scruff der Maus an, indem Sie die lose Haut über seinen Nacken und Rückenmit Daumen und Fingern. Ziehen Sie den Kopf des Tieres mit dem Zeigefinger auf den Kopf fixieren und glätten die Speiseröhre zum Einsetzen der Sonde Nadel.
  5. Aufrechterhaltung der Maus in einer aufrechten Position und die Glühbirne leiten Spitze der Nadel Magensonde entlang der Seite seiner Öffnung und über seine Zunge. Vorsichtig passieren die Nadel auf dem Dach des Mundes und fördern es durch die Speiseröhre. Wenn es irgendeinen Widerstand zu spüren während dieses Vorgangs, entfernen Sie die Sonde Nadel und legen Sie sie erneut.
  6. Langsam spritzen 100 ul des bakteriellen Inokulums und entfernen Sie vorsichtig die Magensonde Nadel. Überwachen Sie die Atemfrequenz und das Verhalten der Maus nach Rückgabe an seinem Käfig.

Notes:

  • In den Schritten 2 und 3, ferner einen falcon Kulturröhrchen unter aseptischen Bedingungen mit 3 ml sterile LB Brühe über Nacht kultiviert werden, um sicherzustellen, dass es keine bakterielle Verunreinigung der Brühe selber. Die LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur deutlich.
  • Übernacht-Kultur zu verwerfen, wenn sie für mehr als 24 Stunden geimpft werden.
  • Alle C. rodentium Infektionen und Gehäuse von infizierten Tieren sollte in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden.

2. Mess Kolonepithelzellen Barrier Durchlässigkeit in C. rodentium-infizierte Mäuse

  1. Messen Barriere Integrität bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion.
  2. Am Tag des Assays, bereiten genug 4 kDa Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 80 mg ml -1 jede Maus mit 150 ul Magensonde und die Standard-Kurve zu erstellen.
  3. Scruff die Maus und die Magensonde mit 150 ul FITC-Dextran. Zurückzuziehen Lebensmittel aus dem Käfig zu diesem Zeitpunkt.
  4. Anesthetize Mäusen 4 h nachgavaging und sammeln Sie so viel Blut wie möglich (~ 450 ul) durch Herzpunktion. Fügen Sie das Blut bis zu einer Endkonzentration von 3% Säure-Citrat-Dextrose in einem Mikrozentrifugenröhrchen zur Gerinnung zu verhindern. Euthanize die Mäuse und sammeln Kolon Geweben in PBS für Keimzahlen (Schritte 3.1 - 3.5) und in 10% Formalin für Gewebefixierung und letztlich Immunfluoreszenzfärbung (Schritte 4,1 bis 4,8).
  5. Drehen Sie die Blutproben bei 1.000 xg für 12 min in einer Zentrifuge bei 4 ° C. Das Serum und mit Wasser auf 1/10 und 1/100 in PBS. Je 100 ul jeder Probe an diesen beiden Verdünnungen in eine 96-Well-Platte in repliziert.
  6. Um den Standard-Kurve zu erstellen, verdünnen das Original 80 mg ml -1 FITC-Dextran verwendet, um die Mäuse in PBS zu den folgenden Konzentrationen Magensonde: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 und 0 ug / ml . Fügen Sie 100 ul von jeder Konzentration auf eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung.
  7. Quantifizierung der Fluoreszenz von jeder Probe unter Verwendung eines Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge wavelength von 485 nm und 535 nm Emissionswellenlänge.
  8. Analysieren Sie die Rohdaten durch Auftragen der Standardkurve. Eingangs der Rohdaten für jede Probe in die Gleichung der Geraden durch die Standardkurve erzeugt werden, um die Konzentration von FITC-Dextran in jeder Probe zu bestimmen.

Notes:

  • Vom Schritt 4 weiter, halten Blutproben auf Eis und Minimierung der Exposition gegenüber Licht.
  • Beim Messen Epithelbarriere Integrität ein Zeitpunkt, bei, oder vor, beträgt 7 Tage nach der Infektion optimal, da schwere Gewebeschädigung beginnt, sobald dieser Stelle. Mess-Barriere Integrität vor schweren Schäden können Sie maximal Unterschiede in Durchlässigkeit während C. bestimmen rodentium Infektion zwischen Mausstämmen.
  • Stellen Sie sicher, dass infizierte Kontrollmäuse sind auch für epitheliale Barriere Integrität getestet.

3. Messung der bakteriellen Belastung in Geweben von C. rodentium-infizierte Mäuse

  1. 1 ml steriler PBS einnd ein autoklaviert Metallsicke zu einem runden Talsohle 2 ml Zentrifugenröhrchen unter aseptischen Bedingungen. Einzelnen Geweben von jedem Tier gesammelt werden, in separaten PBS Röhren platziert werden. Wiegen die Röhren vor der Zugabe des Gewebes.
  2. Entfernen Sie den Blinddarm und Dickdarm von der Maus. Trennen Sie den Blinddarm aus dem Darm und verdrängen die luminalen Inhalte mit einer Pinzette. Fügen Sie den Inhalt in einen PBS Röhre. Nach der Trennung 0,5 cm große Stücke aus der distalen Dickdarm und Blinddarm für 10% Formalin-Fixierung, schnitt den restlichen Dickdarm und Blinddarm längs und waschen mit sterilem PBS, bevor Gewebe in Röhren.
  3. Wiegen die PBS Röhrchen mit dem Gewebe und anschließend homogenisieren der Proben unter Verwendung einer Kugelmühle für 6 min bei 30 Hz liegt.
  4. Unter aseptischen Bedingungen, fügen Sie 180 ul sterilem PBS pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 20 ul jeder homogenisierte Probe in die erste Vertiefung in jeder Zeile. Gut mischen und seriell verdünnen, Zugabe von 20 ul von jeder vorherigen gut Verdünnungen von 10 -1 erhalten (wir zuerstll) bis 10 -6. Plate 10 ul jeder Verdünnung von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung auf einem quadratischen unteren LB-Platte mit einem Gitter. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
  5. Graf Kolonie bildenden Einheiten (KBE), dann der Mittelwert der 3 zählt, und notieren Sie die Verdünnung, bei der jede Probe wurde gezählt. Multiplizieren durchschnittliche CFU von 50, wie 20 ul der ursprünglichen 1 ml Probe verwendet wurde, und durch den Verdünnungsfaktor, bei der die Probe gezählt resultierende in KBE / ml wurde. Schließlich teilen sich durch das Gewebe Gewicht KBE / g zu bestimmen.

4. Histologische Beurteilung und Immunfluoreszenzfärbung von Infected Colon Tissues

  1. Collect Geweben, wie in Schritt 3.2. Shop Geweben in Formalin über Nacht, dann mit 70% Ethanol waschen. Einbetten Gewebe in Paraffin und schneiden 5 &mgr; m-Schnitte für die Färbung. Stain mit Hämatoxylin & Eosin für die histologische Beurteilung und fahren Sie mit den folgenden Schritten für Immunfluoreszenzfärbung.
  2. Um Gewebe vor der Färbung Entparaffinieren, gleitet ineine Coplin Färbeküvette und legte in 65 ° C Wasserbad für 10 min. Weiter, Objektträger in Xylol für vier Wäschen jeweils 2 Min. 95% Ethanol, 75% Ethanol und dH 2 0: Objektträger dann mit zwei 5-minütigen Waschungen in 100% Ethanol, um einen 5 min Waschschritt in jedem der folgenden gefolgt rehydratisiert werden. Diese Wäschen sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um die Exposition gegenüber schädlichen Dämpfen zu vermeiden.
  3. Objektträger in die Coplin mit vorgewärmter Natriumcitratpuffer und anschließend in einen Dampfer für 30 min, dann lassen Sie sich für 30 min. Dieser Prozess bricht die Protein-Vernetzungen durch Formalinfixierung Wiedergewinnen potentielle antigene Stellen gebildet.
  4. Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Dry Dias und mark Umgebung Gewebe mit einem PAP Stift eine hydrophobe Barriere zu schaffen, halten die Färbereagenzien auf das Gewebe lokalisiert.
  5. Block Gewebe für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Blocking-Puffer (z. B. α-Ziegenserum) in einer feuchten Kammer Immunfärbung.
  6. Verdünnen primary Antikörper gewünschten Konzentration mit Antikörperverdünnungspuffer. Abgießen Blocking-Puffer und fügen 50-100 ul des primären Antikörpers an Geweben. Inkubieren bei 4 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
  7. Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Hinzufügen von 50 bis 100 ul sekundären Antikörper in Verdünnungspuffer Antikörpers an das Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln verdünnt. Waschen mit dH 2 O für 5 Min., dreimal.
  8. Entwässern Folien, fügen DAPI verlängern Gold-Eindeckmedium und Deckglas. Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Notes:

  • PBS-Azid kann mit frisch zubereiteten PBS als Alternative zu bakteriellen Wachstums in dem Waschmedium aus Schritt 4 weiter substituiert sein vermeiden.

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Representative Results

Während einer Standard-Infektion Experiment werden Mäuse mit ca. 2,5 x 10 8 CFU durch eine Magensonde von 100 ul Nacht C. infiziert rodentium Kultur. Infektion von C57BL / 6 Mäusen mit C. rodentium Ergebnisse in bescheidenen und vorübergehenden Gewichtsverlust und Durchfall. Obwohl ein seltenes Ereignis mit C57BL / 6 Mäusen, können die Tiere krank werden und erfordern Euthanasie. Daher sollten Mäusen Grad der Gewichtsverlust und Symptome von Stress, wie piloerect Fell und gekrümmte Haltung überwacht werden, um das Ausmaß, in dem verschiedene Stämme von der Infektion betroffen sind zu bestimmen.

Ergebnisse in den 1 bis 4 dargestellt sind repräsentativ für eine Infektion erfolgt mit einer Übernachtkultur aus einem gefrorenen Vorrat Glycerin hergestellt. Bei 7 Tage nach der Infektion wurden die Mäuse betäubt und Blut wurde durch Herzpunktion gesammelt. 1 zeigt FITC-Dextran im Serum gemessenvon C57BL / 6 Mäusen, als auch von Toll-like-Rezeptor 2 (TLR2) Knockout-Mäusen, die zuvor festgestellt worden ist, beeinträchtigt Epithelbarriere Integrität während der Infektion 9 aufweisen. In Gegenwart eines intakten Epithelbarriere intestinalen ist 4 kDa FITC-Dextran schlecht durchlässige durch diese Schicht. Daher schlagen erhöhte Spiegel von FITC-Dextran in Serum eine Beeinträchtigung der intestinalen Epithelbarriere Integrität während der Infektion ermöglicht dieses Molekül, über auslaufen. Als Kontrolle werden Serumspiegel bei nicht infizierten Mäuse mit FITC-Dextran zwangsernährt ebenfalls vorgestellt.

Um eine Woche nach der Infektion wurden bakterielle Belastungen im Dickdarm gefunden etwa 10 9 KBE / g 3,4 Höhepunkt erreichen. Bakteriellen Belastungen können bei gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion gemessen werden, um Infektion zu bestätigen, sowie zu beurteilen, ob verschiedene Knockout-Mäusen aus erhöht oder verringert bakteriellen Belastungen leiden. Als C. rodentium ist eine luminale Erreger kann eng adhere zu Darmepithelzellen, bakteriellen Belastungen in den luminalen Inhalte, Blinddarm, Dickdarm und Gewebe können gemessen werden. Abbildung 2 zeigt typische bakteriellen Belastungen an Tag 7 gemessen nach der Infektion Blinddarm und Kolon Gewebe sowie aus dem Darmlumen von C57BL / 6 Mäusen.

Die meisten der Pathologie beobachtet während C. rodentium Infektion in C57BL / 6 Mäusen tritt in den distalen 2 cm der colon11. Makroskopisch an Tag 7 nach der Infektion, wird eine Verdickung der Darmschleimhaut sowie eine Verkürzung in der Länge des Dickdarms beobachtet, mit wenig offene Schäden in C57BL / 6 Mäusen beobachtet. Normalerweise während der Infektion leiden C57BL / 6 Mäusen nur moderate Entzündung und Pathologie histologisch durch Immunzelle Infiltration, Dehnung von Kolonkrypten und Becherzellen Zelldepletion (Abbildung 3) aufweist.

Wie in den Abschnitten H & E in 3 zu sehen, werden mehrere Wirtsreaktionen dur montiertten Infektion mit C. rodentium. Zur weiteren Charakterisierung dieser Veränderungen können Immunfluoreszenzfärbung genutzt werden, um Veränderungen in Proteinen von Interesse, wie Marker der Proliferation, Zelltod oder angeborenen und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Immunfluoreszenzfärbung ist auch bei der Prüfung der Aspekte der bakteriellen Reaktion, wie seine Lokalisation innerhalb der infizierten Gewebe wertvoll. Ein Beispiel dieser Färbetechnik, die Prüfung eines Wirtsprotein ki67 (rot), ein Marker für die Zellproliferation und der C. rodentium Protein tir, grün, um bakterielle Lokalisation an Tag 12 zu untersuchen post-Infektion ist in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Messung des Serum-FITC-Dextran Epithelbarriere Integrität zu beurteilen. Mäuse wurdenzwangsernährt mit 4 kDa FITC-Dextran unter Bedingungen und nichtinfizierten bei 7 Tage nach der Infektion, woraufhin Serum FITC-Dextran Ebenen bestimmt wurden. C57BL / 6 (WT) Mäusen zeigen eine vernachlässigbare Erhöhung der FITC-Dextran Serumspiegel bei 7 Tage nach der Infektion, verglichen mit nichtinfizierten Bedingungen. Im Gegensatz dazu TLR2 - / - haben Mäusen signifikant Ebenen FTIC-Dextran im Serum im Vergleich zum Ausgangswert hindeutet stark beeinträchtigt Barriere Integrität in diesem Stamm stieg im C. rodentium Infektion hat, wie zuvor gezeigt worden.

Abbildung 2
Abbildung 2. C. rodentium Last aus Lumen, Caecum und Colon von infizierten C57BL / 6 Mäusen 7 Tage nach der Infektion. Lumen, Blinddarm, Dickdarm und Gewebe wurden gesammelt, homogenisiert und plattiertem in serieller Verdünnung auf LB-Agar. Jedes circle eine einzige Probe von einzelnen Tieren gesammelt. Durchgezogenen Linien zeigen den geometrischen Mittelwert, während vertikale Balken SEM anzuzeigen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die histologische Analyse von Schäden durch C. verursacht rodentium Infektion. Am Tag 7 nach der Infektion moderate Immunzellen Infiltration, sowie die Dehnung der Krypten, Becherzellen Zell-Depletion und leichte Ödeme beobachtet im Vergleich zu nicht infizierten Gewebes zu steuern. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 4
Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung auf infizierten und Tag 12 post-Infektiontion Geweben von C57BL / 6 Mäusen. Distale Colongewebe ist für den Host-Protein Ki67 (rot) und dem C angefärbt rodentium Protein tir (grün).

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Discussion

Citrobacter rodentium Infektion stellt ein geeignetes Modell für die Untersuchung von sowohl infektiösen Krankheit und Colitis bei Mäusen. Diese einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung von Host Reaktionen sowie der pathogenen Eigenschaften der Bakterien. Die beschriebenen Schritte in diesem Protokoll detailliert die erfolgreiche Anwendung dieses Modells.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll im Auge zu behalten, wenn induzieren ulcerosa und Analyse Antworten. Zunächst wird die Herstellung einer frischen Übernachtkultur C. rodentium Inokulum in LB-Brühe ist für eine erfolgreiche Infektion von Mäusen erforderlich. Als eine Dosis von 10 8 -10 9 Organismen benötigt, um die meisten Stämme von Mäusen zu infizieren, wenn das Inokulum im Shaker oder auf dem Bankoberteil bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum gelassen wird, gibt es nicht genug lebensfähige Organismen noch in der Kultur Colitis bei der Infektion zu induzieren. Es ist auch wichtig, um die bakterielle Inokulum vor agitierenEinlegen der Spritze für eine Infektion, um sicherzustellen, dass jede Maus eine gleiche Dosis von Bakterien empfängt. Beim Sammeln von Geweben nach Terminus der Infektion, dem vollständigen Eintauchen der Colon-Geweben in einer reichlichen Menge von 10% Formalin für eine ordnungsgemäße Gewebefixierung erforderlich auftreten. Es wird vorgeschlagen, dass Gewebe zu Formalin in einem 5 ml-Schüttelfläschchen wurden anstatt in Mikrozentrifugenröhrchen als 10:1-Verhältnis von Fixiermittel an Gewebe empfohlen zugesetzt werden. Proper Fixierung ist wichtig für die spätere histologische Analyse sowie Immunfluoreszenzfärbung von diesen Geweben. Es ist auch wichtig zu beachten, dass verschiedene Knockout-Stämme haben unterschiedliche Reaktionen auf die Induktion von C. rodentium ulcerosa. Wenn Infizieren einer neuen Stamm zum ersten Mal, sollte Mäusen genau überwacht werden, um eine humane Endpunkt für das Experiment zu ermitteln, wenn nötig. Zeitpunkten für die Analyse von Epithelbarriere Integrität, bakteriellen Belastungen, und Histologie kann basierend auf der Antwort des Maus definiert werdenStamm von Interesse für die Infektion.

Als Beschichtung von Gewebehomogenaten auf LB-Platten, um bakterielle Belastung zu bestimmen ist kein völlig selektive Methode, Durchführung einer PCR für einen C. rodentium spezifischen Gens auf Bakterien-Kolonien kann getan werden, um C. differenzieren rodentium aus anderen bacterialcolonies auf der Platte. Eine andere Möglichkeit besteht darin Platte Gewebehomogenaten auf MacConkey-Agar, wie dieses Medium selektiver für C. rodentium als LB-Agar. Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine Streptomycin-resistenten Wildtyp-C verwenden rodentium Stamm instead.Substitution mit einer Streptomycin resistenten Stamm in der Induktion von Kolitis demselben Modell in diesem Protokoll beschrieben führen. Der Vorteil der Verwendung des Streptomycin-resistenten Stammes ist zur einfacheren Analyse der bakteriellen Belastungen, wie Gewebehomogenaten aus diesen Infektionen auf LB-Agar mit Streptomycin anstatt LB Agar ausplattiert allein kann. Dies vermeidet potenzielle Wachstum commensal Mikroben auf der Platte, so dass die CFU Zählen einfacher und genauer. Eine weitere Alternative beim Messen bakteriellen Belastungen, ist es, Platten nach dem Ausplattieren Verdünnungen von Gewebehomogenaten auf LB-Agar bei entweder 37 ° C inkubieren über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2-3 Tage, was eine langsamere Bakterienwachstum, vor dem Zählen.

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um eine robuste Modell infektiöse Kolitis zu produzieren, sowie die Methoden zur C charakterisieren rodentium Infektion bei Mäusen. Neben der Nutzung dieses Modell auf Pathogen-Wirt-Interaktionen und Immunreaktionen untersuchen, kann es auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie eine bakterielle Infektion kann das Risiko von Darmkrebs erhöhen. Dies kann durch Aussetzen C durchgeführt werden rodentium infizierten Mäusen gegenüber dem Karzinogen Azoxymethan oder durch Infektion untersucht, wie Wirkungen auf Epithelzellvermehrung, oder auf Gene, die in epitheliale Zelldifferenzierung oder Tumorentwicklung 15 beteiligt. UnsIng. der infektiöse Kolitis Modell in diesem Protokoll umrissen, können Keimzahlen auch extraintestinale Stellen, wie die mesenterischen Lymphknoten, Milz und Leber zu beurteilen. Höhere Zahlen in diesen Organen kann angeben, dass die Maus-Stamm getestet sehr anfällig für die Infektion ist. Mit der Immunfluoreszenzfärbung beschriebene Technik kann eine schier unendliche Anzahl von Mechanismen in Reaktion auf eine Infektion untersucht werden. Sobald mit den Techniken ausführlich hier kann das Protokoll modifiziert, um Gewebe zu sammeln, um andere Endpunkte wie die für die RNA-Extraktion und Beurteilung von Genexpressionsniveaus, zu messen, um genauer zu charakterisieren Reaktionen auf C werden rodentium Infektion.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse für BAV von der Morbus Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) und der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) unterstützt. GB wurde von einem Diplom-Stipendium aus CIHR finanziert. BAV ist die Kinder mit Darm-und Leber-Erkrankungen (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Forschung und Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

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References

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