הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מציגים פרוטוקול תפוקה גבוהה הקרנה מהירה וזול לזיהוי רגולטורים תעתיק של synuclein אלפא, גן הקשור למחלה פרקינסון. תאי 293T הם transfected transiently עם פלסמידים מספריית ביטוי ORF ערוך, יחד עם פלסמידים כתב בלוציפראז, בפורמט microplate אחד של גן לכל כן. פעילות גחלילית בלוציפראז היא assayed לאחר 48 שעה כדי לקבוע את ההשפעות של כל גן ספרייה על שעתוק synuclein אלפא, מנורמל לביטוי ממבנה בקרה פנימי (אמרגן HCMV בימוי לוציפראז Renilla). פרוטוקול זה הוא הקל על ידי רובוט ספסל העליון הסגור בארון בטיחות ביולוגי, אשר מבצע טיפול נוזל מזוהם בפורמט 96 היטב. פרוטוקול transfection האוטומטי שלנו הוא בקלות להתאמה לייצור ספריית lentiviral תפוקה גבוהה או פרוטוקולי הקרנה פונקציונליים אחרים הדורשים משולש transfections של מספר הגדול של פלסמידים ספרייה ייחודיים בconjunction עם סט משותף של פלסמידים עוזר. אנו מציגים גם חלופה זולה ומאומתים לחומרים כימיים, זמינים מסחרי, כפולים לוציפראז המעסיק PTC124, EDTA, וpyrophosphate לדכא פעילות גחלילית לוציפראז לפני המדידה של לוציפראז Renilla. שימוש בשיטות אלה, אנו הוקרנו 7670 הגנים אנושיים וזיהינו 68 רגולטורים של אלפא סינוקלאין. פרוטוקול זה הוא שינוי בקלות למקד גנים אחרים של עניין.

Introduction

היכולת לזהות מרכיבים עיקריים גנטיים רגולציה וגורמים הפועלים עליהם היא יסוד לחקר של תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, זיהוי גורמים המווסתים את הביטוי של גנים בסוגי תאים נדירים, כגון אוכלוסיות עצביות ספציפיות, יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי רגולטורים תעתיק רומן של synuclein אלפא (אס.אנ.סי. איי), גן הקשור למחלת פרקינסון, והביע בנוירונים דופאמין בsubstantianigra PARS אזור compacta של המוח התיכון. אנו משיגים זאת באמצעות מסך כתב תפוקה גבוהה, כפול לוציפראז, במבחנה כדי לפרק ביטוי אלפא סינוקלאין בתאי 293T. אמרגן אלפא סינוקלאין הוא משובט ראשון לתוך פלסמיד כתב המכיל את גן גחלילית בלוציפראז. פלסמיד זמין מסחרי המכיל את לוציפראז Renilla תחת השליטה של אמרגן פעיל constitutively משמש כבקרה פנימית. Thesכתב בונה דואר היא שיתוף transfected לתוך תאי 293T בmicroplates עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-DNA, כך שכל אחד גם הוא transfected עם פלסמיד ספרייה אחת. לאחר 48 שעה, פעילות לוציפראז עבור כל כתב נמדדה ברצף באמצעות assay כפול זוהר. הביטוי היחסי של אלפא סינוקלאין בתגובה לכל גן ספרייה הוא להסיק לפי היחס של גחלילית: פעילות Renilla לוציפראז בכל טוב (F: יחס R) לאחר נורמליזציה מבוססת צלחת.

פרוטוקול זה מספק את יכולת מסך מספר רב של גנים (~ 2,500 בשבוע) ביכולתם transactivate גן כתב באמצעות כוח אדם מינימאלי (1-2 אנשים) ובעלות מינימאלית (כ -3 דולרי עלות מגיב לכל assay microplate). רגולטורים תעתיק של גנים עצביים (למשל, synuclein אלפא), שקשה ללמוד בנוירונים בתרבית עקשן למניפולציה גנטית, ניתן להשוות Side-by-צד בassay הפונקציונלי ישיר זה. אנו כוללים בנופרוטוקול מפורט שיטה לשכפול ולצמיחה של פלסמידים המכילים את אמרגן synuclein אלפא, שכן מצאנו כי פלסמידים המכילים אזור זה הם לא יציבים כאשר גדלו עם נהלים מקובלים (ראה דיון). אנו גם חלופה זולה לחומרים כימיים הכפול לוציפראז זמינים מסחרי עבור מבחני תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות למקד אלמנטים רגולטוריים נוספים של ריבית, או לכל תהליך הדורש transfections החולף תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לסקירה ניסיונית, ראה איור 1.

1. הכן פלסמידים כתב המכילים יזם synuclein אלפא

גורמי רגולטוריים של גן synuclein אלפא (איור 2) משתרעים על פני כ 10 בייט, מהרצף במעלה הזרם NACP (לא מרכיב הביתא של פפטיד עמילואיד) חוזר dinucleotide 1,2 באמצעות אינטרון 2 3. אנו כוללים חלק מאזור זה ב הכתב לבנות שלנו. מצאנו כי פלסמידים המכילים אינטרון 2 נהלים מיוחדים הנדרשים לצמיחה, כפי שמתוארים להלן. פלסמידים לוציפראז, pGL4.10 וpGL4.75 (איור 3), זמינים באופן מסחרי מPromega ויכולים להיות מופץ באמצעות פרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים.

  1. להגביר את 2 רכיבים של אמרגן אלפא סינוקלאין בPCRs הנפרד באמצעות המתכון בטבלה 1 ופריימרים בטבלה 2.
  2. Veriמוצרי פ.י. PCR על ג'ל agarose ונקי באמצעות ערכת Qiaquick PCR הטיהור (Qiagen), משחררי ב50 μl של TE (טריס-EDTA). אחסן את בר kb eluted 0.9 ב -20 ° C לשימוש עתידי.
  3. לעכל את כל הנפח של בר PCR 3.4 בייט, כמו גם 5 מיקרוגרם של pGL4.10, עם SACI וXhoI. פנק את הווקטור עם עגל המעי אלקליין phosphatase (Roche) וג'ל לטהר באמצעות ערכת PureLink המהיר חילוץ ג'ל (Invitrogen).
  4. ולקשור את הבר ווקטור באמצעות האנזים T4 DNA (חוד). נקה את התגובה הושלמה באמצעות ערכת PureLink PCR מיקרו (Invitrogen), משחררי ב10 TE חיץ μl.
  5. להפוך 2 μl של ניקתה התגובה, קשירה ל20 μl של תאי ElectroMAX Stbl4 המוסמכים (Invitrogen) וelectroporate פי הוראות היצרן. לנער בC חממת 30 מעלות ב225 סל"ד 90 דקות. מורחים 2 כרכים על צלחות LB המכילות אמפיצילין 100 מ"ג / מיליליטר ו דגירה ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
  6. באמצעות קיסם, בחר 4-6 מושבות קטנות עבור חיסון ל2 מיליליטר של שחפת (נהדר מרק). לגדול תרבויות miniprep אלה בO / נ C שייקר 30 °
  7. לטהר DNA פלסמיד מ1.5 מיליליטר של כל תרבות miniprep באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Miniprep (Invitrogen).
  8. לעכל את minipreps עם BamHI וElectrophorese על ג'ל agarose. השיבוט הנכון צריך לייצר שברי 2.8 kb ו4.9 kb.
  9. Restreak תרבות miniprep שנותרה מהשיבוט הנכון על צלחת טרי LB (מרק לוריא) ולגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
  10. בחר מושבה קטנה ולחסן תרבות המתנע TB 1.5 מיליליטר. Shake O / N ב30 ° C. אל תתנו לתרבות המתנע לגדול לרוויה.
  11. לדלל את התרבות כולה מתנע ל150 מיליליטר של שחפת prewarmed ולנער ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. לפני שתמשיך לשלב הבא, השתמש 1.5 מיליליטר של תרבות זו לminiprep ועיכול נוספים כדי לאשר שהשיבוט לא להשתנות במהלך replicati הלאה.
  12. לטהר DNA פלסמיד מהתרבות שנותרה באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Maxiprep (Invitrogen). תשואות צפויות של פלסמיד הביניים זה הן 50-150 מיקרוגרם למיליליטר 150 של התרבות.
  13. להפשיר את בר 0.9 kb קפוא בשלב 1.2. חזור על צעדים 1.3-1.12 לשבט בר 0.9 kb לתוך פלסמיד ביניים, לעכל במקום עם KpnI וSACI. ולקשור, לשנות, לבחור ולגדול לmaxipreps כאמור לעיל. עיכול עם BamHI אמור להניב ברי 5.8 kb ו2.8 kb. זהו פלסמיד אשר ישמש למסך.

2. הכן את תאי 293T, פלסמידים כתב, וספריית ה-DNA להקרנה

תאי 293T הם זורעים ראשון לתוך צלחות 96 היטב וtransfected ביום המחרת. פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם בדילול לתוך צלחות 96 היטב. אנחנו השגנו צלחות של ה-DNA ספריית כיתה transfection מליבת ה-DNA בבית החולים כלליים מסצ'וסטס (מקבל = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). פרוטוקול זה transfects צלחת ספרייה אחת ל2 צלחות זהות של תאי 293T (איור 1), ובכך 2 צלחות של תאי זרע צריכה להיות לכל צלחת ספרייה שיוקרנו.

הערה: לגדל תאים בתקשורת ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה, כמו אלה להפריע למבחני לוציפראז ולהגדיל את הרעילות במהלך transfection, בהתאמה.

  1. לכל צלחת ספרייה שיוקרנו, תאי 293T trypsinized resuspend לריכוז של 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר בDMEM המכיל FBS 14%. יוצקים לתוך מאגר סטרילי (Axygen).
  2. הנח את המאגר, 2, צלחות ברורות עם תחתית 96 היטב (קורנינג), ותיבה של טיפים pipet המסנן (Agilent) על סיפון הרובוט. לוותר תאי 100 μl לבאר כל שני הצלחות, לצפיפות של 1.5 x 10 4 תאים לכל טוב.
  3. צנטריפוגה צלחות תא ב50 XG במשך 2 דקות, שימוש במהירויות רמפה נמוכות כדי להבטיח שוויוןצפיפות תאים לאורך כל טוב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו10% 2 O / נ CO
  4. לדלל את הגחלילית ופלסמידים כתב Renilla ל5 ng / μl בסרום ללא מדיה. מערבבים את דילולים על יחס של 5:03 גחלילית לפלסמיד Renilla (לפי נפח) בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  5. Pipet פלסמידים בשילוב לבאר כל צלחת 96 היטב, מחלק 17 μl לכל צלחת ספרייה, בתוספת עודפת 2-10 μl, לכל אחד.
  6. השג צלחות ספריית ה-DNA בדרגת transfection כאמור לעיל ולדלל את 13.3 ng / μl עם מים ללא רעלן פנימי. ההיקף המינימאלי לכל גם צריך להיות 28 μl.

3. בצע transfections

ביום 2 של המסך, פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם transfected לתוך תאי 293T.

  1. לכל צלחת ספרייה, לערבב 107.5 μl של RT Optifect (Invitrogen) עם 4.3 מיליליטר סרום ללא מדיה (1:40 דילול) בצינור קלקר. דגירה במשך 5 דקות ב RT, וn לוותר 44 μl (לכל צלחת ספרייה) לבאר כל צלחת 96 היטב, תחתית-V קלקר (גריינר).
  2. מניחים את הצלחת של Optifect בדילול מלא, פלסמידים כתב (שלב 2.5), DNAs ספרייה (שלב 2.6), ותיבה של טיפים pipet על סיפון הרובוט.
  3. לשאוב 17 μl של פלסמידים כתב, 43 μl של Optifect בדילול מלא, ו26 μl של ה-DNA ספרייה, החדרת אוויר פער 5 μl בין כל שאיפה. ה-DNA הספרייה צריכה להישאף אחרון כדי למנוע זיהום צולב. לוותר התוכן של הטיפים לתוך צלחת עם תחתית V קלקר חדשה, לערבב, לכסות ולהניח בצד ל20 דקות, כדי לאפשר מתחמי שומנים / DNA כדי ליצור. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף הטיפים pipet וצלחת ספרייה, וחזור.
  4. לחשוף את צלחת תערובת Optifect / DNA ולמקם אותו על סיפון הרובוט עם 2 צלחות של תאי 293T. שימוש בקופסה אחת של טיפים pipet, לשאוב 80 μl של Optifect: תערובת ה-DNA ולוותר לאט 40 μl על כל צלחת של תאים. אם טרנסfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל Optifect: צלחות ה-DNA. כסה תאים.
  5. צנטריפוגה צלחות התא ב1,200 XG במשך 30 דקות. כסה ולחזור לחממה.
  6. דגירה התאים למשך 4-6 שעות. במהלך דגירה זה, להכין תקשורת טרי על ידי ערבוב DMEM 12 מיליליטר מכיל 10% FBS ו10 מיקרוגרם / מיליליטר ציפרופלוקסאצין (Cellgro) לכל צלחת ספריית transfected. יוצקים תקשורת טרי לתוך מאגר סטרילי.
  7. מניחים 2 קופסות של טיפים רובוט, צלחת אחת של תאים, המאגר המכיל תקשורת טריות, ומאגר פסולת על סיפון הרובוט. של תקשורת לשאוב 100 μl מהתאים ולוותר למאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. בעזרת טיפים טריים, של תקשורת הטרי לשאוב 100 μl ולוותר לאט על גבי התאים. חזור על פעולה עבור כל הצלחות של תאים.
  8. חזור צלחות החממה ל48 שעות.

4. בצע כפול לוציפראז-מבחני

ביום 4 של המסך,מבחני גחלילית בלוציפראז וRenilla מבוצעים.

הערה: assay הכפול לוציפראז דורש תוספת רציפה של 2 מאגרים assay, חיץ גחלילית assay 3X וחיץ assay 3X Renilla, כפי שמתואר בטבלה 3 luciferases Firefly וRenilla אינם מופרש, ולכן תאים חייבים להיות lysed לפני מדידת פעילות לוציפראז. . חיץ assay Firefly lyses תאים ומספק מצע לגחלילית בלוציפראז; חיץ assay Renilla מרווה את אות הגחלילית ומספק מצע ללוציפראז Renilla.

  1. לכל צלחת ספרייה, להכין 8 מיליליטר של חיץ גחלילית assay 3X מפתרונות מניות כפי שמתואר בטבלה 3, ולוותר 82 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב.
  2. לכל צלחת ספרייה, גם להכין 12 מיליליטר של חיץ assay 3X Renilla ולוותר 122 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב. מניח בצד שנימאגרי assay גחלילית וRenilla.
  3. הנח קופסא הטיפים pipet, מאגר פסולת, ו2 צלחות של תאים (transfected מאותה צלחת ספרייה) על סיפון הרובוט.
  4. לשאוב 60 μl של תקשורת מכל צלחת וזורקים במאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. צלחות וכיסוי מניח בצד. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות.
  5. מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ גחלילית assay 3X, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט.
  6. לשאוב 40 μl של חיץ גחלילית assay 3X ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לטיפי pipet חדשים, לחזור לצלחת התא השנייה. מקום תאים ב RT עבור 10 דקות כדי להשלים תמוגה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף את התיבות של טיפים וצלחות תא, וחוזר.
  7. שיא הארה מכל טוב של כל צלחת תא בluminometer, הקלטה ל1 שניות לכל טוב. חזור צלחות לרובוטסיפון.
  8. מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ assay 3X Renilla, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט.
  9. לשאוב 60 μl של חיץ assay 3X Renilla, ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לתיבה חדשה של טיפים pipet, חזור לצלחת התא השנייה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות תא.
  10. שיא הארה מכל הצלחות על luminometer, הקלטה היטב כל אחד לשנייה 1 כאמור לעיל. בטל צלחות.

5. ניתוח נתונים

  1. לחשב את הגחלילית: יחס הארה Renilla ("F: יחס R") לכל אחד גם על ידי חלוקת הסעיפים של אות גחלילית ידי הסעיפים של אות Renilla.
  2. לחשב את ערך האינדוקציה על ידי חלוקת F: יחס R של כל אחד גם על ידי F הממוצע: יחס R של הצלחת, למעט 25% הגבוהים ביותר והנמוכים ביותר של בארות.
  3. ממוצע ערכי האינדוקציה ברחבי משכפללצלחת ספריית transfected אחת. גנים גרימת או מדחיקים אלפא סינוקלאין יותר משלושה קיפולים נחשבים "להיטים" במסך הזה והם כפופים להוכחה נוספת ומסכים המשני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ערכי לוציפראז טיפוסיים, F: יחס R וערכי אינדוקציה עבור חצי צלחת אחת מוצגים באיור 4 שימו לב ללהיט בגם H2, משדל פי 32.. גנים הגורמים לרעילות מוגזמת (לדוגמא, גם E3), או בארות שהיו transfected גרוע, יפיקו ערכים נמוכים לגחלילית והן luciferases Renilla, אבל ערך אינדוקציה ממוצע. גנים הגורמים אינדוקציה הלא ספציפית של פעילות לוציפראז, אולי באמצעות אינטראקציה עם עמוד השדרה pGL4, יניעו גחלילית וluciferases Renilla באותה מידה, וכתוצאה מכך ערך אינדוקציה ממוצע. פערים גדולים בערכי אינדוקציה בין משכפל צריכים להעלות חשד לביצוע טעויות. זה חשוב לוודא כי המסך מתבצע בטווח ליניארי של מבחני הכתב כדי ששיבוטים שגורמים לביטוי מוגבר יימדדו כפעילות לוציפראז מוגברת. אנו transfected כמות הולכת וגדלה של כל גן כתב כדי לאמת את הליניאריותשל assay הכתב בתנאי הניסוי שלנו (איור 5). כמו כן, חשוב לבצע את מבחני מייד לאחר שלב הדגירה, כדי למנוע אי - ליניאריות בשל דלדול מצע. אנו הבחנו פעילות גחלילית לוציפראז משמעותית עד שעה 1 לאחר תוספת של חומרים כימיים (איור 6).

איור 1
איור 1. סקירה ניסויית. כל צלחת אחת של ה-DNA הספרייה בשילוב עם 2 מבני כתב ומשמש לtransfect צלחות כפולות של תאים. לאחר 48 שעה, את הפעילות של כל כתב בלוציפראז נמדדת ברצף. האינדוקציה הספציפית של פלסמיד אמרגן אס.אנ.סי. איי על ידי כל פלסמיד ספרייה מחושבת על ידי היחס בין הגחלילית ללוציפראז Renilla לאחר normalizatio מבוסס הצלחתn.

איור 2
איור 2. סכמטי של האזור '5 של synuclein אלפא (אס.אנ.סי. איי), הממוקם על כרומוזום 4, המשמש בפלסמיד כתב הגחלילית. שמות פריימר מתאימות לרצפים בטבלה 2. סימני האץ' מצביעים על כ -8 קטע kb הודח מהדמות , אחרת קנה מידה. קודון התחלת ATG לאס.אנ.סי. איי ממוקם באקסון 3.

איור 3
פלסמידים כתב איור 3. בלוציפראז בשימוש בפרוטוקול הקרנה זו. האזורים גנומית אס.אנ.סי. איי הם משובטים לתוך אתר השיבוט מרובה של PGL4.10 מייד במעלה הזרם של גחלילית בלוציפראז. פלסמיד עם HCMV-IE1 (1 ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם) ביטוי אמרגן בימוי של לוציפראז Renilla שימש כבקרה פנימית. שני פלסמידים זמינים מסחרי מPromega.

איור 4
איור 4. נציג תוצאות למחצית מצלחת 96 היטב אחת. ספירת גחלילית לוציפראז א גלם ספירות לוציפראז ב הגלם Renilla ג F:.. יחסי R, המחושבים על ידי חלוקת השווי לפי הערך בערכים ב אינדוקציה לכל היטב, מחושב על ידי חלוקת כל F: יחס R על ידי F הממוצע:. יחס R של הצלחת, למעט 25% העליונים ותחתונים של בארות E. גרפי ייצוג של ערכי אינדוקציה עבור צלחת אחת, עם גם H2, להיט חיובי, הדגישה. הכה H2 הוא גורם שעתוק עצבי אינו קשור בעבר עם ביטוי אס.אנ.סי. איי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 5
איור 5. מבחני ליניאריות. תאים היו transfected עם כמויות גדלות והולכות של גחלילית ופלסמידים לוציפראז Renilla תחת השליטה של אמרגן HCMV-IE1 החזק וassayed עם הפרוטוקול לעיל. (הסכום כולל של ה-DNA transfected נשמר קבוע על ידי שימוש בפלסמיד איזון ניטראלי). Assay ליניאריות א Firefly. שים לב שפעילות גחלילית נשארה ליניארי באמצעות מגוון רחב של ערכים. Assay ליניאריות ב Renilla. שים לב להשתטחות העקומה מעל 15 ng / כן.

"עבור: לשמור-together.within-page =" ntent תמיד "> איור 6
.. איור 6 כמובן זמן של אות ריקבון עבור assay גחלילית בלוציפראז ריאגנטים בלוציפראז נוספו לצלחת אחת transfected עם CMV-לוציפראז לבנות בזמן 0; מדידות סידוריים נעשו ללא התוספת של חומרים כימיים נוספים.

רכיב נפח ריכוז סופי
BAC 2002 D6 ב5 ng / μl 4 μl -
5X Phusion GC הצפת 20 μl 1X
DMSO 6 μl 6%
dNTPs (10 מ"מ) 2 μl 200 מיקרומטר
קדימה פריימר (100 מיקרומטר) 1 μl 10 מיקרומטר
Reverse פריימר (100 מיקרומטר) 1 μl 10 מיקרומטר
DDH 2 O 65 μl -
Phusion DNA פולימראז 1 μl -
סה"כ: 100 μl

טבלת 1. PCR ההגדרה להגברת אמרגן synuclein אלפא.

שם רצף אתר הגבלה
SNCA7 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 " KpnI
SNCA8 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 " SACI
SNCA1 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 " SACI
SNCA2 5'-תג ctcgag ggctaatgaattcctttaca-3 " XhoI

.. טבלה 2 צבעי יסוד להגברת אמרגן אלפא סינוקלאין amplicon חזור NACP צריך לייצר שבר 0.9 kb; אורך amplicon האחר הוא 3.4 kb. למקומות פריימר, עיין באיור 2.

: 3X Firefly Assay Buffer
פתרונות מניות (חנות ב -80 מעלות צלזיוס) נפח לכל 100 מיליליטר 3X Firefly Assay Buffer ריכוז סופי (3X)
500 מ"מ DTT 3.0 מיליליטר 15 מ"מ
10 מ"מ קואנזים 6.0 מיליליטר 0.6 מ"מ
100 מ"מ ה-ATP 0.45 מיליליטר 0.45 מ"מ
80 מ"ג / mlluciferin 0.525 מיליליטר </ Td> 4.2 מ"ג / מיליליטר
מאגר תמוגה טריטון 90.025 מיליליטר -
ב 'טריטון תמוגה הצפת
רכיב (חנות ב RT) נפח לכל 100 מיליליטר טריטון תמוגה הצפת ריכוז סופי
אבקת טריס-HCl 1.705 גרם .1082 M
אבקת טריס בסיס 0.508 גרם .0419 M
5 M NaCl 1.50 מיליליטר 75 מ"מ
1 M MgCl 2 0.30 מיליליטר 3 מ"מ
נוזל טהור טריטון X-100 0.75 מיליליטר 0.25%
מים ל100 נפח כולל מיליליטר -
ג 3X Renilla Assay Buffer
נפח ל~ 100 מיליליטר 3X Renilla Assay Buffer ריכוז סופי (3X)
10 מ"מ PTC124 בDMSO 0.6 מיליליטר 0.06 מ"מ
2 מ"מ h-CTZ באתנול 0.5 מיליליטר 0.01 מ"מ
Renilla מלחים 100 מיליליטר -
ד Renilla מלחים
רכיב (חנות ב RT) נפח לכל 100 מיליליטר Renilla מלחים ריכוז סופי
0.5 M Na 2 EDTA 9.0 מיליליטר 45 מ"מ
Na Pyrophosphate 1.34 גרם 30 מ"מ
NaCl 8.33 גרם 1.425 M
מים ל100 נפח כולל מיליליטר -

לוח 3. פתרונות מניות ומאגרי assay לגחלילית ומבחני לוציפראז Renilla. מתכון חיץ גחלילית assay א 3X. DTT, dithiothreitol. אלא אם צוינו, כל הרכיבים מסיסים במים. ב 'טריטון תמוגה מתכון חיץ. מתכון חיץ assay ג 3X Renilla. h-CTZ, h-coelenterazine. הפוך 2 מ"מ h-CTZ ידי הוספת 10 מ"ג h-CTZ ל12.2 מיליליטר של EtOH 100% ו120 μl של HCl המרוכז. PTC124 הוא מסיס בDMSO. מתכון מלחי ד Renilla. טריטון תמוגה חיץ ומלחי Renilla יציבים במשך כמה שבועות על 4 מעלות צלזיוס וRT, בהתאמה. חיץ 3X גחלילית assay וחיץ assay 3X Renilla צריך להיות מעורב בתוך 3-4 שעות של ביצוע assay לוציפראז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אלפא סינוקלאין היה מעורב במחלת פרקינסון (PD) כמרכיב של גופי לוי 4, תכלילים תאיים נחשבים pathognomonic למחלה. מחקרי עמותה הגנום רבים מצאו קשר בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד בsynuclein אלפא עם סיכון מוגבר לספורדיים פ"ד 5,6,7. אמנם פחות נפוצה מאשר פ"ד סדיר, פ"ד המשפחתי עשוי להיות גם נגרמים על ידי מוטציות בsynuclein אלפא 8, כמו גם כפילויות וtriplication של לוקוס אלפא סינוקלאין 9,10,11, תופעה ראתה גם בפ"ד סדיר 12. יחדיו, מחקרים אלה מחזקים את מרכזיותה של אלפא סינוקלאין בפתוגנזה של מחלת פרקינסון. המטרה של מסך זה הייתה לזהות גנים המווסתים synuclein אלפא, ולכן עשוי לשחק תפקיד בפתוגנזה של מחלת פרקינסון. באמצעות פרוטוקול זה, אנו הוקרנו 7670 הגנים אנושיים וזיהינו 154 להיטים ראשוניים (לפחות פי 3 מעוררים), המייצגים 140גנים ייחודיים. להיטים אלה היו כפופים למבחנים משניים באמצעות הכנות DNA חדשות כדי לקבוע שחזור להיט. להיטים בטווח של פי 3 לשכפל ב28% ממבחני לוציפראז שלאחר מכן. שחזור מוגבר ל59%, 69%, ו78% ב 4 -, 5 -, ומעוררים פי 5, בהתאמה. להיטים עם זירוזים על פי 7 לשכפל של 100% מהזמן. אנו סופו של דבר זיהינו 68 רגולטורים רומן של שעתוק synuclein אלפא.

כמה שורות של ראיות מצביעות על כך ש68 הלהיטים שהשגנו הם רגולטורים אמיתיים של אלפא סינוקלאין. הרשימה של נפילות שלנו כוללת GATA3, חבר של משפחת Gata של גורמי שעתוק הראו בעבר להסדיר אס.אנ.סי. איי ביטוי 3. הבקיע אחד מכמה הרגולטורים אס.אנ.סי. איי הידועים נותן אמון רב באמינות של המסך שלנו. בנוסף, אנו באופן עצמאי הבקיע כלהיטים כמה מחברי אותה המשפחה של גורמי שעתוק עצביים, טוענים כי המסך הוא שחזור ולא זיהוי גניםבאופן אקראי. והכי חשוב, במבחני מעקב נוספים, ביכולתו של העליון שלנו פוגעת לווסת ביטוי אס.אנ.סי. איי אנדוגני בתאים עצביים קבל תוקף בביטוי יתר ומבחני מציאה. אנו ביטוי יתר של כמה הלהיטים הגדולים באמצעות BacMamvectors 3 בתאי דופאמין SY5Y והצלחנו להגדיל את רמות אס.אנ.סי. איי אנדוגני 2-8 קיפול, תוך מציאה shRNA של להיטים אלה הביאה לרמות אס.אנ.סי. איי mRNA ירד. מחקרים אלה מראים כי באופן חד משמעי הלהיטים העליונים שלנו הם רגולטורים של רמות אס.אנ.סי. איי אנדוגני ולא פשוט חפצים של מערכת לוציפראז דקונסטרוקציה. מחקרים נוספים מעקב ללהיטים אחרים יידרשו כדי לקבוע את השיעורים האמיתיים השווא חיובי והשליליים כוזבים לרשימה המלאה של להיטים במסך שלנו. תיאור של הלהיטים ומערכת היחסים שלהם למחלת פרקינסון מלא הוא בהכנה 14.

חשוב לקחת בחשבון את המגבלות של המתודולוגיה ההקרנה שלנו. יש OBV זהious שהמסך לא מזהה שום רגולטור לא להציג בספריית ההקרנה. בעוד ספריית ההקרנה שלנו הייתה משמעותית, המכילה כרבע של הגנום האנושי, זה לא היה מקיף. בהתחשב בפשטות של assay שלנו, ספריות נוספות יכולה להיות מוקרנת בקלות. אנחנו הגדלנו את מספר הגנים שהוקרנו באופן ממוקד על ידי כולל paralogs של להיטים, כאשר זמין, במבחנים המשניים שלנו. אנחנו גם לא להבקיע כל להיט שחייב אזורים גנטיים מחוץ לאלו שנכללו בכתב לבנות שלנו. כדי למקסם את הסיכוי לכולל האזור הראוי, הכתב שלנו הכיל את רצפי איגוף מיידיים לתחילת שעתוק האתרים המרובים נמצאו באמרגן אס.אנ.סי. איי. סביר להניח כי גורמים נוספים נקשרים לאזורים רחוקים מחוץ לאזור האמרגן המיידי להסדיר ביטוי אס.אנ.סי. איי. אלה יכולים להיות מזוהים על ידי ביצוע מסכי עם אזורי מעלה או במורד נוסף, אם תרצה בכך, אם כי רק ~ 10 kb בכל פעם יכול להיותssessed באופן זה בשל מגבלות על שיבוט יעיל לוקטורי פלסמיד ואת היציבות של וקטורי pGL4 הגבוה עותק מספר. לחלופין, מבנה לוציפראז יכול להיות retrofitted לDNAs BAC המכיל את לוקוס אס.אנ.סי. איי. חסרון אחד לגישה השנייה הוא שtransfection של BACS גם בתנאים אידיאליים הוא> פי 100 פחות יעיל אז פלסמידים 15. גישה נוספת תהיה "עקום ב" הכתב בלוציפראז למוקד אס.אנ.סי. איי אנדוגני, שיטה שהיא הרבה יותר מייגע אז הגישה שלנו. היינו גם לא להבקיע כל להיט שכבר בא לידי ביטוי ברמות להרוות כך שביטוי יתר אינו התוצאה של פעילות לוציפראז מוגברת. מסיבה זו בחרנו להעסיק תאי 293T שאינם עצביים, שאולי חוסר גורמים עצביים ויסות אס.אנ.סי. איי, ואכן אנחנו לא להבקיע מספר גורמי תעתיק עצביים. חסרון פוטנציאלי אחד של תאי 293T, לעומת זאת, הוא שאנחנו לא יכולים לקלוע כל גן כלהיט אם הוא נדרשגורמים עצביים dditional כדי לתפקד כראוי. לכן, כמו כל המסכים, המחקר שלנו יכול לפספס מספר הרגולטורים אס.אנ.סי. איי הפוטנציאליים. עם זאת, במונחים מעשיים, 68 להיטים השגנו גידול מספר הרגולטורים ידועים של אס.אנ.סי. איי על ידי יותר מ פי 10 וידרשו שנים של עבודה למעקב, להיטים כך נוספים לא יכולים להיות הכרחיים במקרה שלנו.

כמו כן, חשוב להבין את החפצים הפוטנציאליים שעלולות להתרחש שימוש במתודולוגיה זו. במסכים כימיים, לוציפראז ידוע לשמצה תרכובות ניקוד artifactually ידי ייצוב של חלבון לוציפראז ולא על ידי אינדוקציה של שעתוק. כדי לשלול ממצאי ייצוב חלבון, אנחנו הוקרנו הלהיטים שלנו נגד כמה מבני האמרגן-לוציפראז אחרים ולא מצאנו כל להיטים שהופיעו לפעול לאחר תעתיק על ידי הרמת ביטוי מיזמים מכוננים. עוד חפץ פוטנציאל יכול להיות גורם transactivating אשר נקשר לשדרת וקטור pGL4 ולאאמרגן אס.אנ.סי. איי. אנחנו עובדים וקטור pGL4 אשר כבר mutagenized נרחב כדי להסיר את גורם שעתוק אתרי קישור כדי למנוע בעיה זו. כדי להעריך אם כל הלהיטים שלנו נדרשות עמוד השדרה הווקטור לזירוז, השתמשנו PCR כדי להגביר את אזור וקטור אס.אנ.סי. איי-לוציפראז נטול כל עמוד השדרה ומשמש בר ליניארי זה ככתב עבור מבחני משניים. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בערכי אינדוקציה בין כתבנו השלם פלסמיד והמבנה נטול עמוד שדרה ליניארי עם חריג אחד. GATA2 הראה אינדוקציה ~ 15 מתקפלת עם כתב פלסמיד, אבל ~ לקפל רק 2.7 עם הכתב ליניארי, טוען כי חלק מאינדוקצית GATA2 יכול להיות בגלל קשירה לרכיבי עמוד השדרה.

מספר שיטות אחרות כדי לזהות רגולטורים תעתיק תוארו. לפני כמעט 30 שנים, המיפוי של רכיבי בקרת תעתיק הפועל במדינות חבר העמים יזמים ויראלי חזקים באמצעות ביטוי גני כתב transfected היה ESTablished 16. בשיטה זו, לעתים מכונה "אמרגן להכפיש," נפלה מתוך לטובת למיפוי של יזמים תאים מסוג מסוימים שכן הוא קשה להשגה וtransfect שורות תאים ראשוניות מתאימות, וקווים כאלה עשויים שלא לייצג במדויק רקמת המוצא שלהם. מערכת אחת היברידי השמרים 17 עוקפת את הבעיה על ידי מתן מערכת כתב מפורק לזהות אינטראקציות בין ספרייה של גנים היתוך ואלמנט cis-מתנהג ספציפי. הגישה שלנו היא דומה למערכת אחת היברידי שמרים בעיצוב המפורק שלה, אבל במערכת שלנו אנו מעסיקים שיבוטים ביטוי נורמלים ולא התכה גן, אנו מעסיקים בתאי יונקים ולא שמרים, ואנו מעסיקים רובוטיקה המאפשרת כמותית Side-by-צד קריאות פונקציונליות לכל גן בדיקה. שיטה מבטיחה שמכונה פרוטאומיקה של מגזרי הכרומטין מבודדים (Pich) המאפשר זיהוי של חלבונים קשורים לאזורי הגנום הספציפיים שתואר 18, אך עדיין לאיושם בהצלחה לגנים אנושיים עותק יחיד. מחקרי immunoprecipitation הכרומטין הגנום (שבב-seq ושבב שבב) כבר משמשים לזיהוי אזורים הפועל cis בקנה מידה גדול 19. שיטה זו היא בעלת פוטנציאל אדיר, אבל, כמו Pich, עשוי להיות פחות שימושי עבור סוגי תאים כגון אוכלוסיות עצביות ספציפיות שאינם מתקבלות בקלות בתרבות הומוגנית. יתר על כן, כאשר יש לנו בדקנו את מאגרי מידע שבב ללהיטי תוקף שלנו, הם לא הראו מחייב של הלהיטים האלה לאמרגן אס.אנ.סי. איי. הסיבה לכך לא ברורה, שכן יש לנו כבר הצליח להדגים מחייב של גורמים אלה לאמרגן אס.אנ.סי. איי ידי שבב קונבנציונלי 14; אבל זה יכול להיות בגלל חוסר האזור המקדם כל אס.אנ.סי. איי להיות מועסקים במחקרי שבב באמצעות קריאות microarray (שבב שבב). Pich, שבב ואילך, וגישות proteomic אחרות ולכן עשויים להיות שימושיים ביותר כאשר מצמידים את הקריאות פונקציונליות הישירות שהשיטה שלנו יוצרת.

Dual-לוציפראזמבחני העסקת גחלילית וluciferases Renilla מציע שיטה רגישה לחקר תהליכים תאיים רבים בפורמט תפוקה גבוהה 20. ההיתוך של אמרגן יעד לגחלילית בלוציפראז נעשה שימוש כדי לחקור את מבנה תעתיק רגולציה ואמרגן של מטרות רבות במבחנה, כוללים אלפא סינוקלאין 1,2. פיתחנו חלופה זולה לחומרים כימיים הכפול לוציפראז הזמינים מסחרי שספקו איתות חזקה והיה ליניארית בטווח של assay שלנו (איור 6). השיטה שלנו היא עיבוד פרוטוקול סיפק בנדיבות על ידי רון ג'ונסון ב-NIH וassay הכפול לוציפראז לא מסחרי שתואר קודם לכן 21. חיץ assay גחלילית lyses תאים ומספק ATP ווציפרין, מצעים של גחלילית בלוציפראז. assay זה מניב תגובת זוהר עם זמן מחצית חיים של כ 1 שעות (איור 7). חיץ assay Renilla מרווה firefly לאותת ומספק מצע מתאים (coelenterazine). שים לב שחיץ assay Renilla עצמו לא lyse תאים ויש להשתמש בשילוב עם או מאגר תמוגה טריטון או חיץ גחלילית assay. מצאנו כי מאגרי assay Renilla תוארו קודם לכן זירז בקלות ב RT, ובכך אנו בוטלו נתרן גופרתי וירידה בסך של pyrophosphate נתרן ב -60%. assay שלנו כולל גם PTC124, מעכב חזק של גחלילית בלוציפראז 22 שתורם מרווה נוספת בassay. פעילות מרווה גם מסופקת על ידי EDTA, NaCl, וpyrophosphate במאגר Renilla. עם ניסוחים החדשים אלה, כ 99.5% מפעילות של גחלילית הוא הרווה ידי חיץ Renilla. העצמה והשחזור של גחלילית והן אותות לוציפראז Renilla השתפרו במקצת על ידי ערבוב לאחר התוספת של החוצצים (שלבי 4.6 ו4.10).

מניסיוננו, השלםאמרגן lpha-סינוקלאין בpGL4.10 קשה באופן ייחודי כדי להגביר ושיבוט, אולי בגלל אזורי GC-עשיר ומבנה משני מורכב באינטרון 2. היינו מוצלחים ביותר עם תאים המוסמכים STBL4, אשר מותאמים לשיבוט של מוסיף לא יציב. גם הנחיות הבטיחות הבאה, לעתים קרובות אנו התאוששתי מוטציה בי E. הדנ"א הגנומי coli היה מוכנס לתוך סוף '3 ​​של המבנה. מוטציה זו יוצרת להקות של כ 5.8 kb ו4 kb כאשר מתעכלים עם BamHI (לעומת 5.8 kb ו2.8 kb בשיבוט הנכון) ומופיעה כמושבות גדולות על צלחות סלקטיבית. צמיחה זהירה של תאים המוסמכים ב30 מעלות צלזיוס ומניעת תרבויות מלהגיע ירידות רוויה, אך אינו מבטל, את הסבירות להתאוששות שעברה מוטציה. אנו ממליצים לאמת את הטוהר של כל ההכנות-DNA על ידי הגבלה לעכל וג'ל אלקטרופורזה לפני transfection.

פרוטוקול הקרנה זה מותאם בקלות ליזמים אחרים,ד חייב להיות מותאם בהתאם, תוך שימוש בגנים כפקדים חיוביים ושליליים כבר ידועים להסדיר אמרגן היעד. מספר שיקולים חלים על השיבוט וtransfection של פלסמידים הכתב. כאשר שיבוט אמרגן היעד לפלסמיד כתב גחלילית בלוציפראז, אתר תחילת לוציפראז צריך להתקרב לאתר תחילת translational בגן המטרה. מסכים הכפול לוציפראז בדרך כלל למקם את פלסמיד Renilla תחת השליטה של אמרגן מינימאלי, כמו מקדם HSV-tk, כדי למזער את ההשפעות של עמוד השדרה פלסמיד. עם זאת, מצאנו כי אחד מהפקדים החיוביים שלנו מושרה האמרגן הזה, ובכך שהלכנו לאמרגן CMV. הכמות היחסית של כל כתב פלסמיד צריכה להיקבע באופן אמפירי ומושפעת מהפעילות המכוננת של כל אמרגן. בסיס אידיאלי (transfected, אבל uninduced) ספירות לוציפראז צריכה להיות לפחות חמישה עד עשרה לקפל מעל רקע מתאי untransfected, כדי לאפשר זיהוי של librarגנים y שמדחיקים או שרעילות הסיבה, שיגרום לאות נמוכה יותר. לפני ההקרנה, ודא שספירות לוציפראז צפויים ליפול בטווח ליניארי של כל assay, אשר עשוי להשתנות בין luminometers. (שימו לב שRenilla סופר בדרך כלל נופלים בקצה העליון של הטווח ליניארי בassay שלנו.) מצאנו כי הגדלת היחס של ה-DNA ספרייה לפלסמיד כתב הגחלילית הביאה זירוזים גבוהים יותר, ובכך השתמשנו בכמות המינימלית של הכתב הזה.

פרוטוקול transfection חייב להיות מותאם גם כן. בחרנו 293T תאים על מנת להקל עליהם היחסי של transfection, את היעילות של שהגדילה פי 50 עם התוספת של צעד צנטריפוגה (שלב 3.5). SY5Y שורת דופאמין הוא על פי 100 פחות transfectable בידיים שלנו, וכן, כפי שפורט לעיל, לא יכול להיות אופטימלי לביצוע הקרנת ביטוי יתר. זמן assay האופטימלי שלנו נקבע באופן אמפירי להיות 48 שעות, ובכך התאים שלנו היו מצופים בצפיפות ראשונית נמוכה, דבר המחייב את השימוש בOptifect, אשר נועד transfect תאים בconfluency 10-70%. שורות תאים אחרות עשויות לדרוש צפיפויות התחלה שונות וריאגנטים transfection שונים. בחרנו לשנות את התקשורת הסלולרי לאחר transfection להוסיף אנטיביוטיקה (שעלול לגרום לרעילות אם נוכח במהלך transfection). למרות שזה מקטין את הסיכוי לזיהום בקטריאלי, הוא מגביר את עלות חומרים (במיוחד טיפים pipet הרובוט), ובכך שיש הצורך בשלב זה יש להעריך כאשר התאמת פרוטוקול זה למערכות אחרות. מבחני בלוציפראז ניתן להשתמש באופטימיזציה מינימאלית, אבל לפני ביצוע assay זה בתפוקה גבוהה עם סוג תא אחר, לוודא שתאי lysed כראוי על ידי חיץ תמוגה טריטון. שים לב שטריטון X-100 גורם autofluorescence coelenterazine. אות Renilla בassay שלנו הייתה מספיק חזקה כדי להמעיט את האפקט הזה, אבל כאשר אופטימיזציה assay זה לסוגי תאים אחרים, להגביל את X-100 כרכי טריטון למיילסכום nimal נדרש לתמוגה תא.

יש לנו הצגתי שיטת סינון מהירה וזולה יחסית לזיהוי רגולטורים תעתיק רומן של אלפא סינוקלאין באמצעות תאים transiently transfected עם מערכת כתב כפול לוציפראז. פרוטוקול זה הוא שינוי בקלות למקד גנים אחרים של עניין ויכול גם להיות מותאם לכל יישום הדורש transfections תפוקה גבוהה, כגון ייצור lentivirus 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

עבודה זו נתמכה על ידי תמלוגים המתקבלים על ידי BacMamreagents רישוי (פטנט בארה"ב 5,731,182).

Acknowledgements

אנו מודים לג'ון דרגה של MGH-DNA Core להכנת ספריית הקרנת ה-DNA. כריסטופר Chigas של פרקין אלמר סיפק תמיכה לא יסולא בפז עבור luminometer Wallac 1420 שלנו. סטיבן Ciacco ומרטין תומא של Agilent סיפקו תמיכה לרובוט בראבו. אנו מודים רון ג'ונסון וסטיב טיטוס בNIH לנדיבות מתן פרוטוקול assay בלוציפראז כפול זוהר שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10, (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113, (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388, (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71, (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70, (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2, (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356, (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics