الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسهولة لاستهداف أي الجينات في المصالح.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نقدم بروتوكول الفرز الفائق الإنتاجية السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي ألفا synuclein، جين يرتبط مرض باركنسون. و transfected الخلايا 293T عابر مع البلازميدات من مكتبة التعبير ORF المحتشدة، جنبا إلى جنب مع البلازميدات مراسل luciferase، في شكل صفيحة ميكروسكوبية-جين واحد لكل جيدا. ويعاير يراعة luciferase النشاط بعد 48 ساعة لتحديد الآثار المترتبة على كل الجينات مكتبة على النسخ ألفا synuclein، تطبيع في التعبير من بناء الرقابة الداخلية (مروج HCMV توجيه Renilla luciferase المراسل). ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل الروبوت مقعد بين كبار المغلقة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، الذي يؤدي التعامل مع السائل العقيم في شكل 96 جيدا. لدينا بروتوكول ترنسفكأيشن الآلي هو قابلية للتكيف مع الإنتاجية العالية الإنتاج المكتبة lentiviral أو غيرها من بروتوكولات الفحص وظيفية تتطلب transfections من ثلاث أعداد كبيرة من البلازميدات مكتبة فريدة من نوعها في conjunction مع مجموعة مشتركة من البلازميدات المساعد. كما نقدم بديل رخيص الثمن وإجازة المتاحة تجاريا، مزدوج الكواشف luciferase المراسل الذي يعمل PTC124، EDTA، وبيروفسفات لقمع النشاط يراعة luciferase قبل قياس Renilla luciferase المراسل. باستخدام هذه الأساليب، ونحن فحص 7،670 الجينات البشرية، وحددت 68 من المنظمين ألفا synuclein. هذا البروتوكول هو قابل للتعديل بسهولة لاستهداف الجينات الأخرى ذات الاهتمام.

Introduction

القدرة على تحديد العناصر التنظيمية الوراثية الرئيسية والعوامل التي تعمل عليها أمر أساسي لاستكشاف العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك، وتحديد العوامل التي تنظم التعبير عن الجينات في أنواع الخلايا نادرة، مثل السكان العصبية محددة، يمكن أن يكون تحديا. هنا، نقدم بروتوكول لتحديد المنظمين النسخي رواية ألفا synuclein (SNCA)، جين يرتبط مرض باركنسون وأعرب في الخلايا العصبية الدوبامين في substantianigra بارس المنطقة المكتنزة من الدماغ المتوسط. علينا أن ننجز هذا باستخدام عالية الإنتاجية، ثنائي luciferase المراسل، في المختبر شاشة مراسل لتفكيك ألفا synuclein التعبير في الخلايا 293T. يتم استنساخ المروج ألفا synuclein لأول مرة في البلازميد مراسل تحتوي على الجين يراعة luciferase. A البلازميد المتاحة تجاريا تحتوي على luciferase المراسل Renilla تحت سيطرة المروج النشط جوهري بمثابة الرقابة الداخلية. تساويبني مراسل ه شارك transfected-293T إلى خلايا في microplates مع البلازميدات من مكتبة الحمض النووي التعبير، مثل أن كل بئر يتم transfected مع البلازميد مكتبة واحدة. بعد 48 ساعة يتم قياس، luciferase النشاط لكل مراسل بالتتابع باستخدام الفحص المزدوج توهج. يستدل التعبير النسبية ألفا synuclein ردا على كل الجينات المكتبة عن طريق نسبة من يراعة: Renilla luciferase النشاط في كل بئر (F: نسبة R) بعد التطبيع القائم على طبق من ذهب.

يوفر هذا البروتوكول القدرة على فحص عدد كبير من الجينات (~ 2،500 في الأسبوع) لقدرتها على transactivate الجين مراسل باستخدام الحد الأدنى من القوة العاملة (1-2 أشخاص) والحد الأدنى من التكلفة (حوالي 3 دولار تكلفة كاشف لكل صفيحة ميكروسكوبية مقايسة). المنظمين النسخي الجينات العصبية (على سبيل المثال، ألفا synuclein)، والتي هي صعبة للدراسة في الخلايا العصبية مثقف الحرارية للتلاعب الجيني، يمكن مقارنة جنبا إلى جنب في هذا الاختبار وظيفية مباشرة. ندرج في منطقتنابروتوكول طريقة مفصلة لالاستنساخ ونمو البلازميدات تحتوي على مروج ألفا synuclein، منذ وجدنا أن البلازميدات تحتوي على هذه المنطقة غير مستقرة عندما نمت مع الإجراءات التقليدية (انظر المناقشة). نحن تشمل أيضا بديل غير مكلفة لمتاحة تجاريا الكواشف المزدوجة luciferase المراسل لفحوصات عالية الإنتاجية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف العناصر التنظيمية الأخرى ذات الاهتمام، أو إلى أي عملية تتطلب الإنتاجية العالية transfections عابرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لمحة عامة التجريبية، انظر الشكل 1.

1. إعداد البلازميدات مراسل احتواء ألفا Synuclein المروج

العناصر التنظيمية للجين ألفا synuclein (الشكل 2) تمتد ما يقرب من 10 كيلو بايت، من المنبع NACP (غير مكون بيتا اميلويد الببتيد) ثنائي النوكليوتيد تكرار تسلسل 1،2 خلال إنترون 2 3. نحن تشمل جزء من هذه المنطقة في لدينا بناء المراسل. وجدنا أن البلازميدات تحتوي على إنترون 2 الإجراءات الخاصة المطلوبة للنمو، كما هو مبين أدناه. البلازميدات luciferase المراسل، pGL4.10 وpGL4.75 (الشكل 3)، تتوفر تجاريا من PROMEGA ويمكن نشر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية.

  1. تضخيم المكونات 2 من المروج ألفا synuclein في تقارير إتمام المشروعات منفصلة باستخدام وصفة في الجدول 1 والاشعال في الجدول 2.
  2. VERIمنتجات السنة المالية PCR على agarose هلام ونظيفة باستخدام طقم تنقية Qiaquick PCR (في Qiagen)، يبلغ حجمه في 50 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات (تريس، EDTA). تخزين مزال 0.9 كيلو بايت شظية في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  3. هضم وحدة التخزين بالكامل من 3.4 كيلو بايت PCR جزء، فضلا عن 5 ميكروغرام من pGL4.10، مع SACI وXhoI. علاج ناقلات مع العجل الأمعاء الفوسفاتيز القلوية (روش) وهلام تنقية باستخدام عدة خيارات PureLink جل استخراج (إينفيتروجن).
  4. Ligate جزء وناقلات باستخدام T4 يغاز الحمض النووي (نب). تنظيف تفاعل الانتهاء باستخدام عدة PureLink PCR مايكرو (إينفيتروجن)، يبلغ حجمه في 10 ميكرولتر TE العازلة.
  5. تحويل 2 ميكرولتر من تنظيفها، رد فعل ربط في 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة ElectroMAX Stbl4 (إينفيتروجن) وelectroporate وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. هزة في 30 درجة مئوية حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. 2 نشر وحدات التخزين على لوحات LB تحتوي على 100 ملغ / مل الأمبيسلين واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
  6. استخدام المسواك، حدد 4-6 مستعمرات صغيرة للتلقيح في 2 مل من السل (رائع مرق). تنمو هذه الثقافات miniprep في 30 ° C شاكر O / N.
  7. تنقية DNA البلازميد من 1.5 مل من كل ثقافة miniprep استخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Miniprep (إينفيتروجن).
  8. هضم minipreps مع BamHI وelectrophorese على agarose هلام. استنساخ الصحيح ينبغي أن تنتج شظايا من 2.8 كيلو بايت و 4.9 كيلو بايت.
  9. Restreak ثقافة miniprep المتبقية من استنساخ الصحيحة على LB (لوريا مرق) لوحة جديدة وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
  10. حدد مستعمرة صغيرة وتطعيم ثقافة كاتب السل 1.5 مل. يهز O / N عند 30 درجة مئوية. لا تدع الثقافة بداية تنمو إلى التشبع.
  11. تمييع الثقافة بداية بأكمله إلى 150 مل من prewarmed السل ويهز عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، استخدم 1.5 مل من هذه الثقافة لminiprep إضافية والهضم للتأكد من أن استنساخ لم يتحور خلال replicati على.
  12. تنقية DNA البلازميد من ثقافة المتبقية باستخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Maxiprep (إينفيتروجن). العوائد المتوقعة من هذا البلازميد وسيطة هي 50-150 ميكروغرام لكل 150 مل من الثقافة.
  13. ذوبان الجليد جزء 0.9 كيلوبايت المجمدة في الخطوة 1.2. كرر الخطوات 1،3-1،12 لاستنساخ جزء 0.9 كيلو بايت في البلازميد وسيطة، وهضم بدلا من ذلك مع KpnI وSACI. Ligate، تحويل، حدد، وتنمو لmaxipreps على النحو الوارد أعلاه. الهضم مع BamHI ينبغي أن تسفر شظايا من 5.8 كيلو بايت و 2.8 كيلو بايت. هذا هو البلازميد التي سيتم استخدامها للشاشة.

2. إعداد خلايا 293T، مراسل البلازميدات، ومكتبة الحمض النووي لفحص

هي المصنفة الخلايا 293T لأول مرة في لوحات 96 جيدا وtransfected في اليوم التالي. مخففة البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة في لوحات 96 مكتبة جيدا. حصلنا على لوحات من الحمض النووي مكتبة ترنسفكأيشن الصف من كور الحمض النووي في مستشفى ماساتشوستس العام (الحصول = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). هذا البروتوكول transfects لوحة مكتبة واحدة في لوحات 2 متطابقة من الخلايا 293T (الشكل 1)، وينبغي بالتالي المصنف 2 لوحات خلايا لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه.

ملاحظة: تنمو الخلايا في وسائل الإعلام دون الحمراء الفينول أو المضادات الحيوية، وهذه تتداخل مع المقايسات luciferase المراسل وزيادة سمية خلال ترنسفكأيشن، على التوالي.

  1. لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه، الخلايا resuspend 293T trypsinized إلى تركيز 1.5 × 10 5 خلية / مل في DMEM تحتوي على 14٪ FBS. تصب في خزان معقم (Axygen).
  2. وضع الخزان، 2 القاع واضحة، لوحات 96 جيدا (كورنينج)، وعلبة من نصائح مرشح الماصة (اجيلنت) على سطح الروبوت. الاستغناء 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من كل من لوحات، لكثافة 1.5 × 10 4 خلايا لكل بئر.
  3. أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلايا في 50 x ج لمدة 2 دقيقة، وذلك باستخدام سرعات منخفضة منحدر لضمان المساواةكثافة الخلية طوال كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 O / N.
  4. تمييع اليراع وRenilla البلازميدات مراسل ل5 نانوغرام / ميكرولتر في وسائل الإعلام خالية من المصل. الجمع بين التخفيفات في نسبة 05:03 اليراع لRenilla البلازميد (من حيث الحجم) في أنبوب 15 مل المخروطية.
  5. الماصة البلازميدات جنبا إلى جنب في كل بئر من لوحة 96 جيدا، والاستغناء 17 ميكرولتر لكل لوحة المكتبة، بالإضافة إلى 2-10 ميكرولتر الزائدة، في كل بئر.
  6. الحصول ترنسفكأيشن الصف الحمض النووي لوحات المكتبة على النحو الوارد أعلاه وتضعف إلى 13.3 نانوغرام / ميكرولتر مع المياه خالية من الذيفان الداخلي. وينبغي أن يكون الحد الأدنى لحجم 28 ميكرولتر لكل بئر.

3. تنفيذ Transfections

في يوم 2 من الشاشة، و transfected البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة مكتبة في الخلايا 293T.

  1. لكل لوحة المكتبة، مزيج 107.5 ميكرولتر من RT Optifect (إينفيتروجن) مع 4.3 مل سائل الإعلام الحرة المصل (1:40 تمييع) في أنبوب البوليسترين. احتضان لمدة 5 دقائق على RT، ون تستغني 44 ميكرولتر (لكل لوحة المكتبة) في كل بئر من لوحة 96 جيدا، القاع V-البوليسترين (غرينر).
  2. وضع لوحة من المخفف Optifect، البلازميدات مراسل (الخطوة 2.5)، السلطات الوطنية المعينة مكتبة (الخطوة 2.6)، وعلبة من نصائح الماصة على سطح الروبوت.
  3. نضح 17 ميكرولتر من البلازميدات مراسل، 43 ميكرولتر من المخفف Optifect، و 26 ميكرولتر من الحمض النووي مكتبة، وإدراج فجوة الهواء 5 ميكرولتر بين كل الطموح. يجب أن يستنشق الحمض النووي مكتبة الماضي لمنع انتقال التلوث. الاستغناء محتويات نصائح في لوحة جديدة-V القاع البوليسترين، وخلط، والغطاء، ويترك جانبا لمدة 20 دقيقة للسماح للمجمعات الدهون / الحمض النووي لتشكيل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال نصائح الماصة ولوحة المكتبة، وتكرار.
  4. كشف وحة خليط Optifect / الحمض النووي ووضعه على سطح السفينة الروبوت مع 2 لوحات من الخلايا 293T. باستخدام مربع واحد من نصائح الماصة، نضح 80 ميكرولتر من Optifect: خليط الحمض النووي والاستغناء ببطء 40 ميكرولتر على كل لوحة من الخلايا. إذا العابرةfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع Optifect: لوحات الحمض النووي. تغطية الخلايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلية في 1،200 x ج لمدة 30 دقيقة. تغطية والعودة إلى الحاضنة.
  6. احتضان الخلايا لمدة 4-6 ساعة. خلال هذه الحضانة، وإعداد وسائل الإعلام الجديدة عن طريق خلط 12 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين (CellGro) لكل لوحة مكتبة transfected. صب سائل الإعلام الجديدة في خزان العقيمة.
  7. 2 وضع صناديق من نصائح الروبوت، لوحة واحدة من الخلايا، الخزان تحتوي على وسائل الإعلام الجديدة، وخزان النفايات على سطح السفينة الروبوت. نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام من الخلايا والاستغناء في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. نصائح باستخدام الطازجة، نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة والاستغناء ببطء على الخلايا. أكرر للجميع لوحات من الخلايا.
  8. العودة إلى لوحات الحاضنة لمدة 48 ساعة.

4. تنفيذ ثنائي luciferase المراسل فحوصات

في يوم 4 من الشاشة، ويتم تنفيذ اليراع وRenilla المقايسات luciferase المراسل.

ملاحظة: الفحص المزدوج luciferase المراسل يتطلب إضافة متتابعة من 2 مخازن الفحص، 3X العازلة مقايسة اليراع و3X Renilla العازلة الفحص، كما هو موضح في الجدول رقم 3 لا تفرز اليراع وRenilla luciferases، وبالتالي يجب أن تكون هي lysed الخلايا قبل قياس luciferase النشاط. . يراعة العازلة مقايسة lyses الخلايا ويوفر الركيزة ليراعة luciferase؛ Renilla العازلة مقايسة يروي إشارة اليراع ويوفر الركيزة لluciferase المراسل Renilla.

  1. لكل لوحة المكتبة، وإعداد 8 مل من العازلة 3X فحص يراعة من الحلول الأوراق المالية كما هو موضح في الجدول رقم 3، والاستغناء عن 82 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا.
  2. لكل لوحة المكتبة، وأيضا إعداد 12 مل من العازلة 3X Renilla الفحص والاستغناء 122 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا. جانبا كل منيراعة وRenilla مخازن الفحص.
  3. وضع مربع من نصائح الماصة، وخزان النفايات، و 2 لوحات من الخلايا (transfected من نفس لوحة المكتبة) على سطح الروبوت.
  4. نضح 60 ميكرولتر من وسائل الإعلام من كل لوحة وتجاهل في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. بطانات وتوضع جانبا. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات.
  5. 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X العازلة مقايسة اليراع، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت.
  6. نضح 40 ميكرولتر من العازلة 3X فحص اليراع وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التحول إلى نصائح الماصة جديدة، كرر لوحة الخلية الثانية. وضع الخلايا في RT لمدة 10 دقيقة لاستكمال تحلل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال صناديق من النصائح وألواح الخلايا، وتكرار.
  7. سجل التلألؤ من كل بئر من كل لوحة الخلية على luminometer، وتسجيل ل1 ثانية لكل بئر. العودة وحات للروبوتسطح السفينة.
  8. 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X Renilla العازلة الفحص، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت.
  9. نضح 60 ميكرولتر من العازلة 3X Renilla الفحص، وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التبديل إلى مربع جديد من نصائح الماصة، كرر لوحة الخلية الثانية. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات الخلية.
  10. سجل التألق من جميع لوحات على luminometer، وتسجيل كل بئر لمدة 1 ثانية على النحو الوارد أعلاه. تجاهل لوحات.

5. تحليل البيانات

  1. حساب يراعة: نسبة Renilla التلألؤ ("F: نسبة R") لكل بئر بقسمة تهم إشارة يراعة من تهم إشارة Renilla.
  2. حساب قيمة تحريض بقسمة F: نسبة R من كل بئر على المتوسط ​​F: نسبة R من لوحة، باستثناء أعلى وأدنى 25٪ من الآبار.
  3. متوسط ​​القيم تحريض عبر مكرراتلوحة واحدة مكتبة transfected. تعتبر الجينات المحفزة أو قمع ألفا synuclein أكثر من ثلاثة أضعاف "يضرب" في هذه الشاشة وتخضع لمزيد من التحقق من صحة وشاشات الثانوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

القيم النموذجية luciferase المراسل، F: وتظهر نسب القيم والحث R لفترة واحدة نصف لوحة في الشكل (4) لاحظ جيدا في ضرب H2، وهو محفز 32 أضعاف. سوف الجينات المسببة للسمية المفرطة (على سبيل المثال، وأيضا E3)، أو الآبار التي و transfected سيئة، وإنتاج القيم المنخفضة لكلا اليراع وluciferases Renilla، ولكن متوسط ​​قيمة الاستقراء. الجينات المسببة للتحريض غير محددة من luciferase النشاط، وربما عن طريق التفاعل مع العمود الفقري pGL4، من شأنها أن تحفز اليراع وluciferases Renilla على حد سواء، مما أسفر عن متوسط ​​قيمة الاستقراء. يجب أن التفاوت الكبير في القيم تحريض بين مكررات تثير الشك لأخطاء التنفيذ. فمن المهم للتحقق من أن الشاشة يتم تنفيذ ضمن مجموعة خطية من المقايسات مراسل بحيث سيتم قياسها الحيوانات المستنسخة التي تسبب زيادة التعبير عن زيادة luciferase النشاط. نحن transfected كمية متزايدة من كل جين مراسل للتحقق من صحة الخطيللمقايسة مراسل تحت ظروف تجريبية لدينا (الشكل 5). من المهم أيضا لأداء فحوصات على الفور بعد الخطوة الحضانة لتجنب غير الخطي بسبب استنزاف الركيزة. لاحظنا كبيرة النشاط يراعة luciferase تصل إلى 1 ساعة بعد إضافة الكواشف (الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة التجريبية. يتم الجمع بين كل لوحة واحدة من الحمض النووي مكتبة مع 2 بنيات مراسل وتستخدم لوحات بالنقل مكررة من الخلايا. بعد 48 ساعة، ويتم قياس نشاط كل مراسل luciferase بالتتابع. يتم احتساب تحريض محددة من المروج البلازميد SNCA كل البلازميد المكتبة عن طريق نسبة اليراع لRenilla luciferase المراسل بعد normalizatio القائم على لوحةن.

الرقم 2
الشكل 2. تخطيطي من المنطقة 5 'ألفا synuclein (SNCA)، وتقع على الصبغي 4، وتستخدم في البلازميد مراسل يراعة. أسماء التمهيدي تتوافق مع تسلسل في الجدول 2. تشير علامات هاتش شريحة كيلوبايت تقريبا 8 التخلص من هذا الرقم ، وإلا على نطاق كبير. يقع بداية رامزة ATG لSNCA في اكسون 3.

الرقم 3
الرقم 3. luciferase المراسل البلازميدات مراسل المستخدمة في هذا البروتوكول الفرز. يتم استنساخ المناطق الجيني SNCA في موقع الاستنساخ متعددة من PGL4.10 المنبع مباشرة من يراعة luciferase. تم استخدام البلازميد مع HCMV-IE1 (الفيروس المضخم للخلايا البشرية الفوري في وقت مبكر 1) مروج توجيه التعبير عن Renilla luciferase المراسل باعتبارها الرقابة الداخلية. تتوفر تجاريا من PROMEGA كلا البلازميدات.

الرقم 4
الشكل 4. نتائج الممثل لنصف واحد لوحة 96 جيدا. A. الخام التهم يراعة luciferase B. Renilla الخام التهم luciferase المراسل C. F:. نسب R، وتحسب بقسمة القيمة في A من القيمة في القيم B. D. التعريفي لكل بئر، وتحسب بقسمة كل جمعة: نسبة R على المتوسط ​​F: نسبة R من لوحة، باستثناء الجزء العلوي والسفلي 25٪ من الآبار E. الرسومية تمثيل القيم تعريفية لل سلط الضوء على لوحة واحدة، مع H2 جيدا، ضربة إيجابية. ضرب H2 هو عامل النسخ الخلايا العصبية التي لا ترتبط سابقا مع SNCA التعبير. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الرقم 5. المقايسات الخطية. و transfected الخلايا مع كميات متزايدة من اليراع وRenilla البلازميدات luciferase المراسل تحت سيطرة المروج HCMV-IE1 قوية ويعاير مع بروتوكول أعلاه. (كان يحتفظ بمبلغ إجمالي من الحمض النووي transfected ثابت عن طريق استخدام موازن البلازميد محايدة). A. اليراع الخطي الفحص. لاحظ أن النشاط يراعة يبقى خطي من خلال مجموعة واسعة من القيم. B. Renilla الخطي الفحص. لاحظ تسطيح منحنى فوق 15 نانوغرام / جيدا.

ntent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 6
. الرقم 6 أضيفت التوقيت بالطبع إشارة للتسوس يراعة luciferase الفحص الكواشف luciferase المراسل إلى لوحة واحدة transfected مع لCMV-luciferase المراسل بناء على الوقت 0؛ أجريت قياسات المسلسل دون إضافة مزيد من الكواشف.

عنصر حجم تركيز النهائي
BAC 2002-D6 في 5 نانوغرام / ميكرولتر 4 ميكرولتر -
5X Phusion GC العازلة 20 ميكرولتر 1X
DMSO 6 ميكرولتر
dNTPs (10 ملم) 2 ميكرولتر 200 ميكرومتر
إلى الأمام التمهيدي (100 ميكرومتر) 1 ميكرولتر 10 ميكرومتر
Reverse التمهيدي (100 ميكرومتر) 1 ميكرولتر 10 ميكرومتر
[ده 2 O 65 ميكرولتر -
Phusion البلمرة DNA 1 ميكرولتر -
المجموع: 100 ميكرولتر

انشاء الجدول 1. PCR لتضخيم المروج ألفا synuclein.

اسم تسلسل تقييد الموقع
SNCA7 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' KpnI
SNCA8 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' SACI
SNCA1 5'-تكت gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' SACI
SNCA2 5'علامة ctcgag ggctaatgaattcctttaca-3 ' XhoI

. الجدول 2 الاشعال لتضخيم المروج ألفا synuclein يجب أن ينتج وكرر AMPLICON NACP جزء 0.9 كيلو بايت؛ غيرها من طول AMPLICON هو 3.4 كيلو بايت. للمواقع التمهيدي، يرجى الرجوع إلى الشكل 2.

ج: 3X اليراع الفحص العازلة
حلول الأسهم (مخزن في -80 درجة مئوية) حجم لكل 100 مل 3X اليراع الفحص العازلة تركيز النهائي (3X)
500 ملي DTT 3.0 مل 15 ملي
10 ملي أنزيم A 6.0 مل 0.6 ملي
100 ملي ATP 0.45 مل 0.45 ملي
80 ملغ / mlluciferin 0.525 مل </ الدفتيريا> 4.2 ملغ / مل
تريتون تحلل العازلة 90.025 مل -
B. تريتون الاحتياطي تحلل
المكون (مخزن في RT) حجم لكل 100 مل تريتون الاحتياطي تحلل تركيز النهائي
مسحوق تريس، حمض الهيدروكلوريك 1.705 غرام 0.1082 M
مسحوق تريس قاعدة 0.508 غرام 0.0419 M
5 M كلوريد الصوديوم 1.50 مل 75 ملي
1 M MgCl 2 0.30 مل 3 ملي
تريتون X-100 السائل النقي 0.75 مل 0.25٪
ماء إلى 100 مل الحجم الكلي -
C. 3X Renilla الفحص العازلة
حجم 100 مل لكل ~ 3X Renilla الفحص العازلة تركيز النهائي (3X)
10 ملي PTC124 في DMSO 0.6 مل 0.06 ملي
2 مم ح CTZ في الإيثانول 0.5 مل 0.01 ملي
Renilla أملاح 100 مل -
D. Renilla أملاح
المكون (مخزن في RT) حجم لكل 100 مل Renilla أملاح تركيز النهائي
0.5 M نا 2 EDTA 9.0 مل 45 ملي
غ بيروفوسفيت 1.34 ز 30 ملي
كلوريد الصوديوم 8.33 ز 1.425 M
ماء إلى 100 مل الحجم الكلي -

الجدول 3. الحلول المالية ومخازن فحص لليراعة وRenilla المقايسات luciferase المراسل. A. 3X فحص اليراع صفة العازلة. التلفزيون الرقمي الأرضي، dithiothreitol. ما لم يذكر، وجميع مكونات قابلة للذوبان في الماء. B. تريتون العازلة تحلل وصفة. C. 3X Renilla العازلة مقايسة صفة. ح-CTZ، ح coelenterazine. جعل 2 ملم ح CTZ بإضافة 10 ملغ ح CTZ إلى 12.2 مل من 100٪ ETOH و 120 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز. PTC124 قابل للذوبان في DMSO. D. Renilla الأملاح وصفة. تريتون تحلل العازلة وأملاح Renilla مستقرة لعدة أسابيع في 4 درجات مئوية وRT، على التوالي. ينبغي أن تكون مختلطة 3X اليراع العازلة مقايسة و3X Renilla العازلة الفحص في غضون 3-4 ساعة من إجراء فحص luciferase المراسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تورط ألفا synuclein في مرض باركنسون (PD) كمكون من الهيئات ليوي الادراج داخل الخلايا تعتبر اصم لهذا المرض. وربطت العديد من الدراسات رابطة الجينوم على نطاق تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد في ألفا synuclein مع خطر متزايد لالمتفرقة PD 5،6،7. على الرغم من أن أقل شيوعا من PD متفرقة، قد يكون سبب PD العائلية أيضا طفرات في ألفا synuclein فضلا عن الازدواجية وtriplication من موضع ألفا synuclein 9،10،11، وينظر أيضا في ظاهرة PD متفرقة 12. أخذت معا، فإن هذه الدراسات تعزز مركزية ألفا synuclein إلى التسبب في PD. كان الهدف من هذه الشاشة لتحديد الجينات التي تنظم ألفا synuclein وبالتالي قد تلعب دورا في التسبب في مرض باركنسون. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن فحص 7،670 الجينات البشرية، وحددت 154 مشاهدات أولية (على الأقل 3 أضعاف محرضات)، وهو ما يمثل 140جينات فريدة من نوعها. وكانت هذه الزيارات تخضع لفحوصات الحمض النووي الثانوية استخدام مستحضرات جديدة لتحديد ضرب التكاثر. الفعالية في نطاق 3 أضعاف مستنسخة في 28٪ من المقايسات luciferase المراسل اللاحقة. زيادة التكاثر إلى 59٪، 69٪، و 78٪ في 4 -، 5 -، ومحرضات 5 أضعاف على التوالي. الفعالية مع الحث أكثر من 7 أضعاف مستنسخة 100٪ من الوقت. حددنا نهاية المطاف 68 المنظمين رواية ألفا synuclein النسخ.

عدة أسطر من الأدلة تشير إلى أن الفعالية التي حصلنا عليها هي 68 المنظمين الحقيقي ألفا synuclein. لدينا قائمة من الزيارات التي تم تحديدها GATA3، وهو عضو في الأسرة من عوامل النسخ غاتا أظهرت في وقت سابق لتنظيم SNCA التعبير 3. وسجل واحد من عدد قليل من المنظمين SNCA المعروفة يعطي ثقة كبيرة في مصداقية الشاشة لدينا. بالإضافة إلى ذلك، سجلنا بشكل مستقل ويضرب عدة أعضاء من عائلة واحدة من عوامل النسخ العصبية، مما يدل على أن الشاشة هي استنساخه وليس تحديد الجيناتعشوائيا. الأهم من ذلك، في فحوصات متابعة إضافية، وقدرة لدينا أعلى يضرب لتنظيم الذاتية التعبير في الخلايا العصبية SNCA تم التحقق من overexpression في والمقايسات ضربة قاضية. نحن بإفراط (overexpressed) عدد قليل من كبار يضرب باستخدام BacMamvectors 3 في خلايا الدوبامين SY5Y وكانوا قادرين على زيادة مستويات SNCA الذاتية 2-8 أضعاف، في حين أدى shRNA ضربة قاضية لهذه الفعالية في انخفاض مستويات SNCA مرنا. وتبين هذه الدراسات بشكل قاطع أن لدينا أعلى مشاهدات والمنظمين من مستويات SNCA الذاتية ليست مجرد والتحف من النظام luciferase المراسل فككت. وسوف تكون هناك حاجة إلى دراسات إضافية المتابعة لتوجيه ضربات أخرى لتحديد كاذبة معدلات الإيجابية الكاذبة والسلبية الحقيقية للحصول على قائمة كاملة من إصابات في الشاشة لدينا. وصف كامل للإصابات وعلاقتها مرض باركنسون هو في إعداد 14.

فمن المهم النظر في القيود المفروضة على منهجية الفحص لدينا. وينبغي OBV ذلك[إيووس] أن الشاشة لن ​​تحدد أي منظم لا يقدم في المكتبة الفرز. في حين كان لدينا مكتبة كبيرة الفرز، تحتوي على حوالي ربع الجينوم البشري، لم يكن شاملة. نظرا لبساطة مقايسة لدينا، يمكن فحص مكتبات إضافية مع سهولة. زدنا عدد الجينات فحص بطريقة مستهدفة من قبل بما في ذلك paralogs من الزيارات، عندما تكون متاحة، في المقايسات الثانوي لدينا. ونحن أيضا لن يسجل أي ضرب الذي منضما إلى المناطق الجيني خارج تلك المدرجة في موقعنا بناء المراسل. لتحقيق أقصى قدر من فرص بما في ذلك منطقة السليم، الواردة مراسلنا تسلسل المرافقة الفورية للمواقع متعددة بدء النسخ وجدت في المروج SNCA. فمن المرجح أن عوامل إضافية لربط مناطق بعيدة خارج منطقة المروج فورية لتنظيم SNCA التعبير. يمكن أن يتم الكشف عن هذه الشاشات من خلال القيام مع المناطق المنبع والمصب إضافية، إذا رغبت في ذلك، على الرغم فقط ~ 10 كيلو بايت في وقت يمكن أن يكونssessed بهذه الطريقة بسبب القيود المفروضة على كفاءة الاستنساخ في ناقلات البلازميد والاستقرار في عدد نسخ عالية ناقلات pGL4. بدلا من ذلك، يمكن تحديثه وتعديله لبناء luciferase المراسل إلى السلطات الوطنية المعينة BAC تحتوي على موضع SNCA. عيب واحد لهذا النهج الأخير هو أن ترنسفكأيشن من تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي حتى في ظل الظروف المثالية هو> 100 أضعاف أقل كفاءة ثم البلازميدات 15. سيكون نهج آخر يتمثل في "الضربة القاضية في" لمراسل luciferase في SNCA موضع الذاتية، وهو الأسلوب الذي هو أكثر بكثير شاقة ثم نهجنا. ونحن أيضا لن يسجل أي ضرب وهو ما يعبر عنه بالفعل في مستويات تشبع من overexpression بحيث لا يؤدي إلى زيادة luciferase النشاط. لهذا السبب اخترنا لتوظيف الخلايا 293T غير العصبية، والتي قد تفتقر إلى العوامل العصبية التي تنظم SNCA، والواقع أننا لم يسجل عددا من العوامل النسخي العصبية. عيب واحد المحتملة للخلايا 293T، ومع ذلك، هو أننا قد لا يسجل أي الجينات كما ضرب إذا كان مطلوبالعوامل العصبية ضافية لتعمل بشكل صحيح. وبالتالي، شأنها شأن جميع الشاشات، يمكن أن دراستنا يغيب عدد من المنظمين SNCA المحتملة. ومع ذلك، من الناحية العملية، وحصلنا على 68 مشاهدات زيادة عدد المنظمين المعروفة من SNCA بأكثر من 10 أضعاف، وسوف تتطلب سنوات من العمل لمتابعة، قد لا تكون الفعالية الإضافية اللازمة لذلك في حالتنا.

من المهم أيضا أن ندرك القطع الأثرية المحتملة التي قد تحدث باستخدام هذه المنهجية. في شاشات الكيميائية، luciferase المراسل تشتهر المركبات التهديف artifactually التي كتبها استقرار البروتين luciferase المراسل بدلا من تحريض النسخ. استبعاد القطع الأثرية استقرار البروتين، ونحن فحص لدينا الفعالية ضد عدة بنيات المروج-luciferase المراسل الأخرى ولم تجد أي إصابات التي يبدو أنها تتصرف آخر ما بعد transcriptionally برفع التعبير من المروجين التأسيسية. قطعة أثرية أخرى محتملة يمكن أن يكون عاملا transactivating الذي يربط متجه العمود الفقري بدلا من pGL4المروج SNCA. نحن استخدمت ناقلات pGL4 التي تم mutagenized على نطاق واسع لإزالة عامل النسخ مواقع الربط لتجنب هذه المشكلة. لتقييم ما إذا كان أي من الفعالية المطلوبة العمود الفقري ناقلات لتحريض، استخدمنا PCR لتضخيم المنطقة ناقلات SNCA-luciferase المراسل خالية من أي العمود الفقري وتستخدم هذه القطعة الخطية كمراسلة لفحوصات الثانوية. لم نجد أي اختلاف كبير في القيم بين الاستقراء لدينا مراسل البلازميد كاملة وخالية من الخطية العمود الفقري بناء مع استثناء واحد. أظهرت GATA2 الحث ~ 15 أضعاف مع مراسل البلازميد، ولكن فقط ~ 2.7 أضعاف مع مراسل الخطية، مما يوحي بأن بعض تحريض GATA2 قد يكون راجعا إلى ملزمة لمكونات العمود الفقري.

وقد وصف عدد من وسائل أخرى لتحديد المنظمين النسخي. منذ ما يقرب من 30 عاما، وقد بتوقيت شرق الولايات المتحدة تعيين عناصر التحكم النسخي المفعول في رابطة الدول المستقلة المروجين الفيروسية قوية عبر مراسل transfected التعبير الجينيablished 16. هذا الأسلوب، تسمى أحيانا "المروج تقريع،" قد انخفض من صالح لرسم الخرائط من المروجين محددة الخلايا من نوع لأنه من الصعب الحصول على وبالنقل خطوط الخلايا الأولية مناسبة، وهذه الخطوط قد لا تمثل بدقة الأنسجة الأصلية. الخميرة نظام هجين واحد 17 تلتف هذه المشكلة عن طريق توفير نظام للكشف مراسل فككت التفاعلات بين مكتبة الجينات الانصهار ومحددة عنصرا رابطة الدول المستقلة المفعول. نهجنا هو مماثل لخميرة النظام الهجين واحد في تصميمه فككت، ولكن في نظامنا ونحن توظيف استنساخ التعبير العادي بدلا من اندماج الجينات، ونحن توظيف خلايا الثدييات بدلا من الخميرة، ونحن توظيف الروبوتات التي تسمح جنبا إلى جنب الكمي قراءات وظيفية لكل اختبار الجينات. ووصف طريقة واعدة البروتينات من شرائح معزولة لونين (بيش) والذي يسمح وقد وصفت تحديد البروتينات ملزمة لمناطق محددة الجينوم 18، ولكن لم يتم بعدتم تطبيقها بنجاح إلى نسخة واحدة الجينات البشرية. وقد استخدمت على نطاق الجينوم لونين مناعي (رقاقة وما يليها والشذرة رقاقة) دراسات لتحديد المناطق التي تعمل رابطة الدول المستقلة على نطاق واسع 19. هذا الأسلوب هو يحتمل أن تكون قوية، ولكن، مثل بيش، قد تكون أقل فائدة لأنواع الخلايا مثل الخلايا العصبية السكان محددة والتي لا يمكن الحصول عليها بسهولة في الثقافة متجانسة. علاوة على ذلك، عندما يكون لدينا فحص قواعد البيانات الشذرة لدينا الفعالية التحقق من صحتها، وأنها لم تظهر ملزمة من هذه الفعالية إلى المروج SNCA. السبب في ذلك ليس واضحا، منذ كنا قادرين على إثبات ملزمة من هذه العوامل إلى المروج SNCA بواسطة رقاقة التقليدية 14؛ ولكن قد يكون بسبب عدم وجود كامل منطقة المروج SNCA التي يجري استخدامها في الدراسات الشذرة باستخدام قراءات ميكروأري (رقاقة رقاقة). ولذلك قد بيش، الشذرة وما يليها، والنهج البروتين أخرى تكون أكثر فائدة عندما يقترن إلى قراءات الوظيفية المباشرة التي تولد لدينا وسيلة.

ثنائي luciferase المراسلالمقايسات توظيف اليراع وluciferases Renilla تقدم طريقة حساسة لدراسة العديد من العمليات داخل الخلايا في شكل عالية الإنتاجية 20. تم استخدام مزيج من المروج الهدف ليراعة luciferase لدراسة تنظيم وهيكل المروج النسخي أهداف عديدة في المختبر، بما في ذلك ألفا synuclein 1،2. قمنا بتطوير بديل غير مكلفة لمتاحة تجاريا الكواشف المزدوجة luciferase المراسل أن تقدم إشارة قوية وكان خطية في نطاق مقايسة لدينا (الشكل 6). ويتم تكييف طريقة لدينا من بروتوكول قدمت بسخاء من قبل رون جونسون في المعاهد الوطنية للصحة وغير تجارية ثنائية luciferase الفحص هو موضح سابقا 21. المخزن المؤقت فحص اليراع lyses الخلايا ويوفر ATP ووسيفيرين، ركائز من يراعة luciferase. هذا الاختبار يعطي رد فعل توهج مع حياة نصف من حوالي 1 ساعة (الشكل 7). المخزن المؤقت فحص Renilla يروي fireflذ إشارة ويوفر الركيزة المناسبة (coelenterazine). علما بأن مقايسة العازلة Renilla نفسها لن ليز الخلايا ويجب أن تستخدم في تركيبة مع أي من تريتون العازلة تحلل العازلة أو مقايسة اليراع. وجدنا أن سبق وصفها مخازن Renilla فحص عجلت بسهولة في RT، وبالتالي فإننا القضاء كبريتات الصوديوم وانخفضت كمية الصوديوم بيروفوسفات بنسبة 60٪. يتضمن الفحص أيضا لدينا PTC124، المانع من امكانات يراعة luciferase 22 التي تساهم تبريد إضافية في الفحص. يتم توفير النشاط التبريد أيضا EDTA، كلوريد الصوديوم، وبيروفسفات في المخزن المؤقت Renilla. مع هذه التركيبات الجديدة، تطفأ ما يقرب من 99.5٪ من النشاط يراعة من قبل المخزن المؤقت Renilla. كثافة واستنساخ كل من اليراع وإشارات luciferase المراسل Renilla تحسنت قليلا عن طريق خلط بعد إضافة المخازن المؤقتة (الخطوات 4.6 و 4.10).

في تجربتنا، وكاملةالمروج lpha-synuclein في pGL4.10 صعب فريد لتضخيم واستنساخ، وربما بسبب المناطق GC الغنية والمعقدة في بنية الثانوية إنترون 2. كنا أنجح مع الخلايا المختصة STBL4، والتي هي الأمثل لاستنساخ إدراج غير مستقرة. حتى بعد هذه الاحتياطات، ونحن في كثير من الأحيان تعافى المسخ الذي E. تم إدراج الحمض النووي الجيني القولونية في 3 'نهاية بناء. هذا المسخ يخلق عصابات من حوالي 5.8 كيلو بايت و 4 كيلوبايت عندما يتفاعل مع BamHI (مقابل 5.8 و 2.8 كيلو بايت كيلو بايت في استنساخ الصحيح) ويبدو كما المستعمرات أكبر على لوحات انتقائية. النمو الحذر من الخلايا المختصة عند 30 درجة مئوية ومنع الثقافات من الوصول إلى انخفاضات التشبع، ولكن لا يلغي، احتمال استرداد متحولة. نوصي التحقق من نقاء كافة الاستعدادات الحمض النووي عن طريق تقييد هضم وهلام الكهربائي قبل ترنسفكأيشن.

ويتم تكييف هذا البروتوكول الفرز بسهولة إلى المروجين الأخرى، ود يجب أن يكون الأمثل وفقا لذلك، وذلك باستخدام الإيجابية والسلبية الضوابط الجينات المعروفة بالفعل لتنظيم المروج الهدف. تطبيق عدة اعتبارات إلى الاستنساخ وترنسفكأيشن من البلازميدات مراسل. عندما استنساخ المروج الهدف في يراعة مراسل luciferase البلازميد، ينبغي للموقع بداية luciferase المراسل تقريب موقع بداية متعدية في الجين المستهدف. شاشات مزدوجة luciferase المراسل عادة وضع البلازميد Renilla تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج، مثل المروج HSV-TK، للحد من الآثار المترتبة على العمود الفقري البلازميد. ومع ذلك، وجدنا أن واحدا من الضوابط الإيجابية لدينا يسببها هذا المروج، وبالتالي اخترنا المروج CMV. وينبغي أن تحدد كمية النسبية لكل البلازميد مراسل تجريبيا ويتأثر النشاط التأسيسية من كل المروج. خط الأساس المثالي (transfected، ولكن uninduced) ينبغي أن تكون التهم luciferase المراسل ما لا يقل عن خمسة إلى عشرة أضعاف خلال الخلفية من الخلايا untransfected، للسماح للكشف عن المكتبهذ الجينات التي تقمع أو التي تسبب سمية، الأمر الذي سيؤدي إلى انخفاض إشارة. قبل الفحص، تحقق من أن التهم luciferase المراسل المتوقع تقع ضمن نطاق خطية من كل فحص، والتي قد تختلف بين luminometers. (لاحظ أن لدينا Renilla تعول تقع عادة في نهاية العلوي من مجموعة خطية في مقايسة لدينا.) وجدنا أن زيادة نسبة الحمض النووي مكتبة ليراعة مراسل البلازميد أدى إلى الحث أعلى، وبالتالي فإننا استخدام كمية ضئيلة من هذا المراسل.

يجب أن يكون الأمثل بروتوكول ترنسفكأيشن كذلك. اخترنا 293T الخلايا لسهولة النسبية ترنسفكأيشن، وكفاءة والتي زادت 50 ضعفا مع إضافة خطوة الطرد المركزي (الخطوة 3.5). وSY5Y خط الدوبامين أكثر من 100 أضعاف أقل transfectable في أيدينا، وكما نوقش أعلاه، قد لا تكون الأمثل لأداء الفحص من overexpression. كان لدينا الوقت الأمثل مقايسة تحدد تجريبيا لتكون 48 ساعة، وبالتالي كانت مطلية خلايانا في مناطق ذات كثافة منخفضة الأولية، مما يستلزم استخدام Optifect، الذي تم تصميمه لبالنقل الخلايا في 10-70٪ confluency. قد تتطلب خطوط الخلايا الأخرى كثافات انطلاق مختلفة والكواشف ترنسفكأيشن مختلفة. اخترنا لتغيير وسائل الاعلام الخلية بعد ترنسفكأيشن لإضافة المضادات الحيوية (والتي يمكن أن تسبب التسمم إذا كان موجودا خلال ترنسفكأيشن). على الرغم من أن هذا يقلل من احتمال التلوث الجرثومي، لأنه يزيد تكلفة في المواد (خاصة نصائح الماصة الروبوت)، وبالتالي يجب أن يتم تقييم ضرورة هذه الخطوة عندما التكيف مع هذا البروتوكول إلى أنظمة أخرى. ويمكن استخدام المقايسات luciferase المراسل مع الحد الأدنى الأمثل، ولكن قبل تنفيذ هذا الاختبار في الإنتاجية العالية مع نوع من الخلايا المختلفة، والتحقق من أن الخلايا هي lysed بشكل مناسب من قبل العازلة تحلل تريتون. نلاحظ أن تريتون X-100 يسبب coelenterazine تألق ذاتي. كانت إشارة Renilla في مقايسة لدينا قوية بما يكفي ليهون هذا التأثير، ولكن عند تحسين هذا الاختبار لأنواع الخلايا الأخرى، والحد من تريتون X-100 مجلدا إلى ميلكمية نيمال اللازمة لتحلل الخلية.

قدمنا ​​طريقة الفحص السريع وغير مكلفة نسبيا لتحديد المنظمين النسخي رواية ألفا synuclein باستخدام خلايا عابر مع نظام ثنائي مراسل luciferase المراسل. هذا البروتوكول هو قابل للتعديل بسهولة لاستهداف جينات أخرى من الفائدة ويمكن أيضا أن تتكيف لتطبيق أي تتطلب transfections الإنتاجية العالية، مثل إنتاج الفيروسة البطيئة 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأيد هذا العمل من قبل الإتاوات التي حصل عليها BacMamreagents الترخيص (براءة اختراع أمريكية 5731182).

Acknowledgements

نشكر جون دارغا من MGH الحمض النووي الأساسية لإعداد مكتبة فحص الحمض النووي. قدم كريستوفر Chigas من بيركن إلمر دعما لا يقدر بثمن لدينا Wallac 1420 luminometer. قدم ستيفن Ciacco ومارتن Thomae من اجيلنت الدعم للروبوت برافو. نشكر رون جونسون وستيف تيتوس في المعاهد الوطنية للصحة لتوفير بسخاء المزدوج توهج بروتوكول luciferase الفحص الخاصة بهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10, (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113, (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388, (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71, (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70, (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2, (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356, (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics