Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

Biology

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Summary

Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt.

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Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

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Abstract

Nous présentons un protocole de criblage à haut débit rapide et peu coûteux pour identifier des régulateurs transcriptionnels de l'alpha-synucléine, un gène associé à la maladie de Parkinson. Des cellules 293T sont transfectées de manière transitoire avec des plasmides provenant d'une banque d'expression de l'ORF parée, en même temps que les plasmides rapporteurs de luciférase, dans un format de microplaque à un gène par puits. L'activité de la luciférase de luciole est analysée après 48 heures pour déterminer les effets de chaque gène de la bibliothèque sur l'alpha-synucléine transcription, normalisée à partir d'un produit d'assemblage d'expression de contrôle interne (un promoteur hCMV diriger la luciférase de Renilla). Ce protocole est facilitée par un robot de paillasse enfermé dans une enceinte de sécurité biologique, qui exécute une manipulation de liquide aseptique en format 96 puits. Notre protocole de transfection automatisé est facilement adaptable à la production de la bibliothèque de lentiviral à haut débit ou d'autres protocoles de dépistage fonctionnels nécessitant une triple-transfections de grands nombres de plasmides de la banque uniques dans conjunction avec un ensemble commun de plasmides auxiliaires. Nous présentons également une alternative peu coûteuse et validé à disponibles dans le commerce, deux réactifs luciférase qui emploie PTC124, EDTA, et le pyrophosphate de supprimer l'activité luciférase de luciole avant la mesure de Renilla. En utilisant ces méthodes, nous avons criblé 7670 gènes humains et identifié 68 organismes de réglementation de l'alpha-synucléine. Ce protocole est facilement modifiable pour cibler d'autres gènes d'intérêt.

Introduction

La capacité à identifier des éléments régulateurs génétiques clés et les facteurs qui agissent sur eux est fondamental pour l'exploration de nombreux processus biologiques. Toutefois, l'identification des facteurs qui régulent l'expression de gènes dans des types de cellules rares, telles que les populations neuronales spécifiques, peut être difficile. Ici, nous présentons un protocole pour identifier de nouveaux régulateurs de la transcription de l'alpha-synucléine (SNCA), un gène associé à la maladie de Parkinson et exprimé dans les neurones dopaminergiques dans la substantianigra la pars compacta de la région du cerveau moyen. Nous accomplissons cela en utilisant un écran à haut débit, double-luciférase, in vitro reporter à déconstruire expression alpha-synucléine dans les cellules 293T. Le promoteur d'alpha-synucléine est d'abord clone dans un plasmide rapporteur contenant le gène de la luciférase de luciole. Un plasmide disponible dans le commerce contenant de la luciférase de Renilla sous le contrôle d'un promoteur constitutivement actif sert de contrôle interne. The constructions rapporteurs sont co-transfectés dans des cellules 293T avec les plasmides dans des microplaques à partir d'une banque d'expression d'ADN, de telle sorte que chaque puits est transfectée avec un plasmide unique de la bibliothèque. Après 48 heures, l'activité de la luciférase pour chaque rapporteur est mesurée séquentiellement en utilisant un dosage double lueur. L'expression relative de l'alpha-synucléine en réponse à chaque gène bibliothèque est déduite par le rapport de la luciole: l'activité de la luciférase de Renilla dans chaque puits (F: rapport R) après normalisation sur la base de plaque.

Ce protocole permet de cribler un grand nombre de gènes (~ 2 500 par semaine) pour leur capacité à transactiver un gène rapporteur en utilisant un minimum de personnel (1-2 personnes) et un coût minime (environ 3 $ le coût d'un réactif par essai de microplaques). Régulateurs de la transcription de gènes neuronaux (par exemple, l'alpha-synucléine), qui sont difficiles à étudier dans des cultures de neurones réfractaires à la manipulation génétique, peuvent être comparés côte à côte dans cette analyse fonctionnelle directe. Nous incluons dans notreprotocole une méthode détaillée pour le clonage et la croissance des plasmides contenant le promoteur alpha-synucléine, car nous avons constaté que les plasmides contenant cette région sont instables lorsqu'elles sont cultivées avec les procédures classiques (voir Discussion). Nous incluons également une alternative peu coûteuse à des réactifs disponibles dans le commerce à double luciférase pour tests à haut débit. Ce protocole peut être facilement adaptée pour cibler d'autres éléments de régulation d'intérêt, ou à tout processus exigeant à haut débit transfections transitoires.

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Protocol

Pour une vue d'ensemble expérimental, voir Figure 1.

1. Préparer plasmides rapporteurs contenant l'alpha-synucléine Promoteur

Les éléments de régulation du gène de l'alpha-synucléine (Figure 2) couvrent environ 10 kb, du PNLS (non-Un composant bêta de peptide amyloïde) séquence de répétition dinucléotide amont 1,2 par l'intron 2 3. Nous incluons une partie de cette région notre construction de rapporteur. Nous avons constaté que les plasmides contenant l'intron 2 procédures spéciales requises pour la croissance, comme décrits ci-dessous. Les plasmides de luciférase, et pGL4.10 pGL4.75 (figure 3), sont disponibles dans le commerce auprès de Promega et peuvent être propagées en utilisant des protocoles classiques de biologie moléculaire.

  1. Amplifier les deux composantes du promoteur d'alpha-synucléine dans les RAP séparés en utilisant la recette dans le tableau 1 et les amorces dans le tableau 2.
  2. Verify produits de PCR sur un gel d'agarose et propre en utilisant le kit de purification PCR Qiaquick (Qiagen), en éluant dans 50 ul de TE (Tris-EDTA). Rangez le fragment élue 0,9 kb à -20 ° C pour une utilisation future.
  3. Digérer la totalité du volume du fragment de PCR de 3,4 kb, ainsi que 5 ug de pGL4.10, avec Sacl et Xhol. Traiter le vecteur de phosphatase alcaline d'intestin de veau (Roche) et gel purifier en utilisant le kit PureLink Gel Extraction rapide (Invitrogen).
  4. Ligaturer le fragment et le vecteur en utilisant la T4 ADN ligase (NEB). Nettoyez la réaction terminée en utilisant le kit Micro PCR PureLink (Invitrogen), en éluant à 10 tampon TE pi.
  5. Transformer 2 ul de la réaction de ligature a nettoyé dans 20 pl de cellules compétentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) et l'électroporation selon les instructions du fabricant. Agiter dans un incubateur à 30 ° à 225 tours par minute pendant 90 min. Etaler deux volumes sur des plaques LB contenant 100 mg / ml d'ampicilline et incuber à 30 ° C pendant 2 jours.
  6. L'utilisation d'un cure-dent, sélectionnez 4-6 petites colonies pour l'inoculation dans 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultiver ces cultures miniprep dans un shaker 30 ° C O / N.
  7. Purifier l'ADN plasmidique à partir de 1,5 ml de chaque culture de miniprep en utilisant le kit Plasmid Miniprep PureLink HiPure (Invitrogen).
  8. Digérer les minipreps avec BamHI et par électrophorèse sur gel d'agarose. Le clone correct devrait produire des fragments de 2,8 kb et 4,9 kb.
  9. Restreak la culture restante miniprep à partir du clone correct sur un milieu LB (Luria Broth) plaque fraîche et de croître à 30 ° C pendant 2 jours.
  10. Choisissez une petite colonie et ensemencer une culture de départ de 1,5 ml de la tuberculose. Secouez O / N à 30 ° C. Ne laissez pas la culture de départ pousser à saturation.
  11. Diluer le levain entier dans 150 ml de tuberculose préchauffé et agiter à 30 ° C pendant 2 jours. Avant de procéder à l'étape suivante, en utilisant 1,5 ml de cette culture pour une mini-préparation et la digestion supplémentaire pour confirmer que le clone n'a pas muté pendant replicati sur.
  12. Purifier l'ADN plasmidique de la culture restante en utilisant le kit Plasmid Maxiprep PureLink HiPure (Invitrogen). Les rendements attendus de ce plasmide intermédiaire sont 50-150 mg par 150 ml de culture.
  13. Décongeler le fragment de 0,9 kb figé dans l'étape 1.2. Répétez les étapes 1.3 à 1.12 pour cloner le fragment de 0,9 kb dans le plasmide intermédiaire, la digestion place avec Kpnl et Sacl. Ligate, transformer, sélectionner et développer pour Maxipreps comme ci-dessus. Digestion avec BamHI devrait donner des fragments de 5,8 kb et 2,8 kb. C'est le plasmide qui sera utilisé pour l'écran.

2. Préparer les cellules 293T, Reporter plasmides, et une bibliothèque d'ADN pour le dépistage

Des cellules 293T sont d'abord ensemencées dans des plaques à 96 puits et transfectées le lendemain. plasmides rapporteurs et des ADN de la bibliothèque sont dilués dans des plaques à 96 puits. Nous avons obtenu des plaques d'ADN de la bibliothèque transfection qualité de l'ADN de base à l'Hôpital général du Massachusetts (obtenir = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Ce protocole transfecte une plaque bibliothèque unique en 2 plaques identiques de cellules 293T (figure 1), donc 2 plaques de cellules doivent être ensemencées pour chaque plaque bibliothèque à être projeté.

Remarque: Cultiver les cellules dans les médias sans rouge de phénol ou des antibiotiques, car ils interfèrent avec les tests de la luciférase et augmentent la toxicité pendant la transfection, respectivement.

  1. Pour chaque plaque de bibliothèque à cribler, des cellules 293T trypsinisées de remettre en suspension à une concentration de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans du DMEM contenant 14% de FBS. Verser dans un réservoir stérile (Axygen).
  2. Placez le réservoir, 2 à fond transparent, des plaques à 96 puits (Corning), et une boîte de conseils filtre de pipette (Agilent) sur la plate-forme de robot. Déposer 100 pi de cellules dans chaque puits de deux plaques, pour une densité de 1,5 x 10 4 cellules par puits.
  3. Centrifuger les plaques de cellules à 50 g pendant 2 min, en utilisant de faibles vitesses de rampe pour assurer l'égalitédensité de cellules tout au long de chaque puits. Incuber à 37 ° C et 10% de CO 2 O / N.
  4. Diluer la luciole et de Renilla plasmides rapporteurs à 5 ng / ul dans un milieu sans sérum. Combiner les dilutions dans un rapport de 05:03 à luciole Renilla plasmide (en volume) dans un tube conique de 15 ml.
  5. Pipet les plasmides combinés dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, distribution de 17 pi par plaque bibliothèque, plus 2-10 ul excès, dans chaque puits.
  6. Obtenir des plaques de la bibliothèque de la transfection d'ADN de qualité comme ci-dessus et complétez à 13,3 ng / ul avec de l'eau exempte d'endotoxines. Le volume minimum par puits devrait être de 28 pi.

3. Effectuer Transfections

Le jour 2 de l'écran, plasmides rapporteurs et d'ADN de la bibliothèque sont transfectées dans des cellules 293T.

  1. Pour chaque plaque bibliothèque, mélangez 107,5 pi de RT Optifect (Invitrogen) avec 4,3 ml de milieu sans sérum (01h40 dilution) dans un tube de polystyrène. Incuber pendant 5 min à température ambiante, et l'n distribuer 44 pi (par plaque bibliothèque) dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, polystyrène fond en V (Greiner).
  2. Placer la plaque de dilution Optifect, plasmides rapporteurs (étape 2.5), les ADN de la bibliothèque (étape 2.6), et une boîte de pointes de pipette sur la plate-forme de robot.
  3. Aspirer 17 pi de plasmides rapporteurs, 43 pi de dilution Optifect, et 26 ul d'ADN bibliothèque, en insérant un espace d'air de 5 pi entre chaque aspiration. L'ADN de la banque doit être aspiré dernier pour empêcher la contamination croisée. Verser le contenu des conseils dans une nouvelle plaque de fond en V polystyrène, mélanger, couvrir et mettre de côté pendant 20 minutes pour permettre complexes lipides / ADN pour former. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, de remplacer les embouts de pipette et plaque de la bibliothèque, et répéter.
  4. Découvrez la plaque de mélange Optifect / ADN et le placer sur la plate-forme de robot avec 2 plaques de cellules 293T. En utilisant une seule boîte de pointes de pipette, aspirer 80 pi de la Optifect: mélange d'ADN et passer lentement 40 pi sur chaque plaque de cellules. Si transfecting plusieurs plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous Optifect: plaques d'ADN. Couvrir cellules.
  5. Centrifuger les plaques de cellules à 1200 g pendant 30 min. Couvrir et retourner à l'incubateur.
  6. Incuber les cellules pendant 4-6 heures. Pendant cette incubation, préparer du milieu frais par mélange de 12 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 10 ug / ml de ciprofloxacine (Cellgro) pour chaque plaque de bibliothèque transfectée. Verser milieu frais dans un réservoir stérile.
  7. Placez 2 boîtes de conseils de robot, une seule plaque de cellules, le réservoir contenant un milieu frais, et un réservoir de déchets sur la plate-forme de robot. Aspirer 100 pi de milieu à partir des cellules et distribuent dans le réservoir de déchets partiellement rempli d'éthanol à 70%. En utilisant des pointes frais, aspirer 100 pi de milieu frais et distribuer lentement sur les cellules. Répétez l'opération pour toutes les plaques de cellules.
  8. Plaques revenir à l'incubateur pendant 48 heures.

4. Effectuez double luciférase-dosages

Au jour 4 de l'écran, l'luciole et de Renilla essais luciférase sont effectuées.

Remarque: Le dosage à double luciférase nécessite l'addition séquentielle de deux tampons de dosage, 3X tampon luciole dosage et un tampon d'essai 3X Renilla, comme décrit dans le tableau 3 de luciole et de Renilla luciférases ne sont pas sécrétées, ainsi les cellules doivent être lysées avant de mesurer l'activité luciférase. . Tampon de dosage Firefly lyse des cellules et fournit substrat pour la luciférase de luciole, tampon de dosage Renilla éteint le signal luciole et fournit substrat pour la luciférase Renilla.

  1. Pour chaque plaque de bibliothèque, préparer 8 ml de tampon 3X luciole dosage à partir de solutions mères comme décrit dans le tableau 3, et se dispenser 82 pi dans chaque puits d'une plaque à fond en V à 96 puits.
  2. Pour chaque plaque de bibliothèque, également préparer 12 ml de tampon de dosage 3X Renilla et dispenser 122 pi dans chaque puits d'une plaque à fond en V à 96 puits. Mettez de côté à la fois leluciole et de Renilla tampons de dosage.
  3. Placez une boîte de pointes de pipette, un réservoir de déchets, et 2 plaques de cellules (transfectées dans la même assiette bibliothèque) sur la plate-forme de robot.
  4. Aspirer 60 pi de milieu de chaque assiette, et jetez les dans le réservoir de déchets partiellement rempli d'éthanol à 70%. Les plaques de recouvrement et mettre de côté. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous les jeux de plaques.
  5. Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon 3X luciole dosage, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot.
  6. Aspirer 40 pi de tampon 3X luciole dosage et l'ajouter à la première plaque de cellules, bien mélanger. Le passage à de nouveaux embouts de pipette, répétez l'opération pour la seconde plaque de cellule. Placer les cellules à la température ambiante pendant 10 min pour compléter la lyse. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, remplacer les boîtes de conseils et de plaques de cellules, et répéter.
  7. luminescence d'enregistrement de chaque puits de chaque plaque de cellule sur un luminomètre, enregistrement pendant 1 seconde par puits. Plaques Retour au robotpont.
  8. Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon de dosage 3X Renilla, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot.
  9. Aspirer 60 ul de tampon de dosage 3X Renilla, et l'ajouter à la première plaque de cellules, en mélangeant soigneusement. Le passage à une nouvelle boîte de pointes de pipette, répétez l'opération pour la seconde plaque de cellule. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous les jeux de plaques cellulaires.
  10. luminescence d'enregistrement de toutes les plaques sur un luminomètre, l'enregistrement de chaque bien pour 1 sec comme ci-dessus. Jeter plaques.

5. Analyse des données

  1. Calculer la luciole: rapport Renilla de luminescence ("F: rapport R") pour chaque puits en divisant les chiffres de signal de luciole par les comtes de signal de Renilla.
  2. Calculer la valeur de l'induction en divisant le rapport F: R de chaque puits par la moyenne F: rapport R de la plaque, à l'exclusion de la plus haute et la plus basse de 25% des puits.
  3. La moyenne des valeurs d'induction dans les répétitionspour une seule plaque de bibliothèque transfectées. Gènes induisant ou réprimant l'alpha-synucléine plus de trois plis sont considérés comme des "hits" sur cet écran et sont soumis à une validation supplémentaire et des écrans secondaires.

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Representative Results

Valeurs de luciférase typiques, F: ratios R et les valeurs d'induction pour une seule demi-plaque sont présentés dans la figure 4 Notez le succès dans bien H2, un inducteur 32 fois.. Les gènes produisant une toxicité excessive (par exemple, bien E3), ou les puits qui ont été mal transfectées, produisent de faibles valeurs pour luciole et luciferases Renilla, mais une valeur moyenne de l'induction. Les gènes provoquant l'induction non spécifique de l'activité de la luciférase, peut-être par l'intermédiaire d'une interaction avec le squelette pGL4, induiront luciférases de luciole et de Renilla également, résultant en une valeur moyenne de l'induction. De grandes différences dans les valeurs d'induction entre répétitions devraient éveiller les soupçons des erreurs d'exécution. Il est important de vérifier que l'écran est réalisé dans la plage linéaire des dosages de rapporteur de telle sorte que les clones qui provoquent une expression accrue sera mesuré comme une activité accrue de la luciférase. Nous avons transfecté augmentant la quantité de chaque gène rapporteur pour valider la linéaritéde l'essai rapporteur dans nos conditions expérimentales (Figure 5). Il est également important d'effectuer les dosages à bref délai après l'étape d'incubation pour éviter la non-linéarité due à l'épuisement substrat. Nous avons observé l'activité luciférase de luciole significative jusqu'à 1 h après l'addition de réactifs (Figure 6).

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble expérimental. Chaque plaque unique d'ADN bibliothèque est combiné avec deux constructions rapporteurs et utilisé pour la transfection de cellules plaques en double. Après 48 h, l'activité de chaque rapporteur de la luciférase est mesurée de manière séquentielle. L'induction du promoteur spécifique plasmide SNCA par chaque plasmide bibliothèque est calculé par le rapport de la luciole pour la luciférase de Renilla après normalizatio à base en forme de plaquen.

Figure 2
Figure 2. Schématique de la région 5 'de l'alpha-synucléine (SNCA), situé sur le chromosome 4, utilisé dans le plasmide rapporteur de luciole. Noms d'amorces correspondent aux séquences correspondantes dans le tableau 2. Marques de hachures indiquent un segment d'environ 8 kb a éliminé de la figure , sinon à l'échelle. Le codon d'initiation ATG pour SNCA est située dans l'exon 3.

Figure 3
Figure 3. Luciférase plasmides rapporteurs utilisés dans le présent protocole de dépistage. SNCA Les régions génomiques sont clones dans le site de clonage multiple de pGL4.10 immédiatement en amont de la luciférase de luciole. Un plasmide avec le hCMV IE1 (cytomégalovirus humain immédiat précoce 1), le promoteur dirigeant l'expression de la luciférase de Renilla a été utilisé comme contrôle interne. Les deux plasmides sont disponibles dans le commerce auprès de Promega.

Figure 4
Figure 4. Des résultats représentatifs pour la moitié d'une plaque de 96 puits unique. A. premières chiffres luciférase de luciole B. Raw Renilla des comtes de luciférase C. F:.. Ratios R, calculé en divisant la valeur de A par la valeur des valeurs B. D. induction pour chaque bien, calculé en divisant chaque F: rapport R par la moyenne de F:. rapport R de la plaque, à l'exception du haut et du bas 25% des puits E. représentation graphique des valeurs d'induction pour une seule plaque, avec bien H2, un résultat positif, a souligné. Hit H2 est un facteur de transcription neuronale pas déjà associée à l'expression SNCA. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5
Figure 5. Tests de linéarité. Cellules ont été transfectées avec des quantités croissantes de luciole et de Renilla plasmides de la luciférase sous le contrôle du promoteur fort hCMV-IE1 et dosés avec le protocole ci-dessus. (Quantité totale d'ADN transfecté a été maintenue constante par l'utilisation d'un dispositif d'équilibrage plasmide neutre). A. Firefly essai de linéarité. A noter que l'activité de luciole reste linéaire à travers une large gamme de valeurs. D'essai de linéarité B. Renilla. Notez l'aplatissement de la courbe au-dessus de 15 ng / puits.

ntent "fo: keep-together.within page =" always "> Figure 6
.. Figure 6 cours Durée du signal de décroissance pour le dosage de la luciférase de luciole réactifs luciférase ont été ajoutés à une seule plaque transfectées avec un CMV-luciférase construire au temps 0; mesures en série ont été faites sans l'ajout d'autres réactifs.

Composant Volume Concentration finale
BAC 2002-D6 à 5 ng / pl 4 pl -
5X Phusion GC tampon 20 pl 1X
DMSO 6 pi 6%
dNTP (10 mm) 2 pl 200 uM
Forward Primer (100 M) 1 pl 10 uM
RPrimer Everse (100 M) 1 pl 10 uM
ddH 2 O 65 pi -
Phusion ADN polymérase 1 pl -
Total: 100 pi

Tableau 1. PCR mis en place pour amplifier le promoteur alpha-synucléine.

Nom Séquence Restriction du site
SNCA7 5'-gtc GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' Kpnl
SNCA8 5'-tgc gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' Sacl
SNCA1 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' Sacl
SNCA2 5'-tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' XhoI

.. Tableau 2 amorces pour amplifier le promoteur alpha-synucléine La répétition amplicon PNLS devrait produire un fragment de 0,9 kb; l'autre longueur d'amplicon est de 3,4 kb. Pour les emplacements d'amorces, s'il vous plaît se référer à la Figure 2.

A: 3X Firefly tampon de dosage
Solutions mères (conserver à -80 ° C) Volume par 100 ml 3X Firefly tampon de dosage Concentration finale (3X)
500 mM DTT 3,0 ml 15 mM
10 mM de coenzyme A 6,0 ml 0,6 mM
100 mM d'ATP 0,45 ml 0,45 mM
80 mg / mlluciferin 0,525 ml </ Td> 4,2 mg / ml
Un tampon de lyse Triton 90,025 ml -
B. Triton tampon de lyse
Composants (magasin à la température ambiante) Volume 100 ml Triton Lysis Buffer Concentration finale
Poudre de Tris-HCl 1,705 g 0,1082 M
Poudre Tris base 0,508 g 0,0419 M
5 M de NaCl 1,50 ml 75 mM
1 M de MgCl2 0,30 ml 3 mM
Liquide pur Triton X-100 0,75 ml 0,25%
Eau 100 ml volume total -
C. 3X Renilla tampon de dosage
Volume par ~ 100 ml 3X Renilla tampon de dosage Concentration finale (3X)
MM PTC124 10 dans le DMSO 0,6 ml 0,06 mM
2 mM h-CTZ dans l'éthanol 0,5 ml 0,01 mM
Renilla Sels 100 ml -
D. Renilla Sels
Composants (magasin à la température ambiante) Volume par 100 ml de Renilla Sels Concentration finale
0,5 M de Na 2 EDTA 9,0 ml 45 mM
Na Pyrophosphate 1,34 g 30 mM
NaCl 8,33 g 1,425 M
Eau 100 ml volume total -

Tableau 3. Des solutions mères et des tampons d'analyse pour la luciole et de Renilla essais luciférase. A. 3X recette tampon luciole essai. TNT, dithiothréitol. Sauf indication contraire, tous les composants sont solubles dans l'eau. Recette de tampon C. 3X Renilla recette. Du tampon de dosage de lyse Triton B.. h-CTZ, h-coelentérazine. Faire 2 mM h-CTZ en ajoutant 10 mg h-CTZ à 12,2 ml de EtOH à 100% et de 120 pi de HCl concentré. PTC124 est soluble dans le DMSO. Sels D. Renilla recette. Tampon de lyse Triton et les sels de Renilla sont stables pendant plusieurs semaines à 4 ° C et la température ambiante, respectivement. 3X tampon de dosage luciole et un tampon de dosage 3X Renilla doivent être mélangés dans 3-4 h de réaliser le dosage de la luciférase.

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Discussion

L'alpha-synucléine a été impliquée dans la maladie de Parkinson (PD) en tant que composant de corps de Lewy, des inclusions intracellulaires 4 considérés pathognomonique de cette maladie. De nombreuses études d'association pangénomiques ont lié polymorphismes de nucléotides simples dans l'alpha-synucléine à un risque accru pour sporadique PD 5,6,7. Bien que moins fréquente que PD sporadique, maladie de Parkinson familiale peut aussi être causée par des mutations dans l'alpha-synucléine 8, ainsi que doubles et triples du locus alpha-synucléine 9,10,11, un phénomène également visible dans la MP sporadique 12. Pris ensemble, ces études renforcent le rôle central de l'alpha-synucléine dans la pathogenèse de la MP. Le but de cet écran était d'identifier des gènes qui régulent l'alpha-synucléine et peut donc jouer un rôle dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson. En utilisant ce protocole, nous avons criblé 7670 gènes humains et identifié 154 résultats préliminaires (au moins 3 fois inducteurs), représentant 140gènes uniques. Ces résultats ont été soumis à des analyses secondaires à l'aide de nouvelles préparations d'ADN pour déterminer la reproductibilité succès. Résultats dans la gamme de 3 fois reproduits dans 28% des essais de luciférase ultérieures. Reproductibilité a augmenté de 59%, 69%, et 78% en 4 -, 5 -, et les inducteurs de 5 fois, respectivement. Résultats avec des inductions plus de 7 fois reproduits à 100% du temps. Nous avons finalement identifié 68 nouveaux régulateurs de l'alpha-synucléine transcription.

Plusieurs éléments de preuve suggèrent que les 68 résultats que nous avons obtenus sont de véritables régulateurs de l'alpha-synucléine. Notre liste des résultats identifiés comprend GATA3, un membre de la famille GATA des facteurs de transcription, précédemment présentés à réglementer SNCA expression 3. Marquant l'un des rares régulateurs connus SNCA donne une grande confiance dans la fiabilité de notre écran. En outre, nous avons marqué de façon indépendante comme frappe plusieurs membres de la même famille de facteurs de transcription neuronales, ce qui suggère que l'écran est reproductible et non l'identification des gènesau hasard. Plus important encore, dans des essais de suivi supplémentaires, la capacité de notre top hits pour réguler l'expression SNCA endogène dans les cellules neuronales a été validée dans la surexpression et analyses knockdown. Nous surexprimé quelques-uns des grands succès en utilisant BacMamvectors 3 dans les cellules dopaminergiques SY5Y et nous avons pu augmenter les niveaux endogènes SNCA 2-8 fois, tandis que shRNA knockdown de ces résultats a donné lieu à des niveaux d'ARNm SNCA diminué. Ces études démontrent de façon concluante que nos meilleurs résultats sont des régulateurs de niveaux SNCA endogènes et ne sont pas simplement des objets du système de la luciférase déconstruit. D'autres études de suivi pour d'autres visites seront nécessaires pour déterminer les taux réels positifs et faux négatifs faux pour la liste complète des résultats de notre écran. Une description complète des résultats et leur relation à la maladie de Parkinson est en préparation 14.

Il est important de tenir compte des limites de notre méthodologie de dépistage. Il faut OBVrents que l'écran ne serait pas identifier tout régulateur pas présents dans la bibliothèque de dépistage. Bien que notre banque de criblage a été considérable, contenant environ un quart du génome humain, il n'a pas été complète. Compte tenu de la simplicité de notre essai, bibliothèques supplémentaires pourraient être projetés avec facilité. Nous avons augmenté le nombre de gènes filtrés de manière ciblée en incluant paralogues de résultats, lorsqu'ils sont disponibles, dans nos analyses secondaires. Nous aimerions également pas marquer un coup qui lié à des régions génomiques en dehors de ceux inclus dans notre construction de rapporteur. Pour maximiser les chances de la région, y compris bon, notre journaliste contenait les séquences d'accompagnement immédiates pour les multiples sites de début de transcription présents dans le promoteur SNCA. Il est probable que des facteurs supplémentaires se lient à des régions loin à l'extérieur de la région immédiate de promoteur pour réguler l'expression SNCA. Ceux-ci peuvent être détectées en effectuant des écrans avec des régions amont et aval supplémentaires, si on le souhaite, bien que seulement ~ 10 kb, à un moment pourraient être unessessed de cette manière en raison de limitations sur le clonage efficace dans des vecteurs plasmidiques et la stabilité du nombre élevé de copie vecteurs pGL4. Variante, la construction de la luciférase peut être équipé en ADN de BAC contenant le locus SNCA. Un inconvénient de cette dernière approche est que la transfection de TA, même dans des conditions idéales est> 100 fois moins efficace alors plasmides 15. Une autre approche serait de «knock-in» le rapporteur de la luciférase dans le locus endogène SNCA, une méthode qui est beaucoup plus laborieux alors notre approche. Nous aimerions également pas marquer un coup qui est déjà exprimée en saturant les niveaux, afin que la surexpression n'entraîne pas une activité accrue de la luciférase. Pour cette raison, nous avons choisi d'utiliser des cellules 293T non-neuronales, qui pourraient manquer de facteurs neuronaux régissant SNCA, et en effet nous n'avons marquer un certain nombre de facteurs de transcription neuronales. Un inconvénient potentiel des cellules 293T, cependant, est que nous ne pourrions pas marquer un gène comme un succès si elle exigeait unfacteurs neuronaux supplémen taires pour fonctionner correctement. Ainsi, comme tous les écrans, notre étude pourrait manquer un certain nombre de régulateurs potentiels SNCA. Cependant, dans la pratique, les résultats que nous avons obtenus 68 augmentation du nombre de régulateurs connus des SNCA par plus de 10 fois et il faudra des années de travail pour assurer le suivi, visites supplémentaires peuvent donc ne pas être nécessaire dans notre cas.

Il est également important de réaliser les artefacts potentiels qui peuvent se produire à l'aide de cette méthodologie. Dans les écrans chimiques, la luciférase est connue pour des composés artifactually notation par la stabilisation de la protéine de luciférase plutôt que par induction de la transcription. Pour écarter protéines artefacts de stabilisation, nous avons projeté nos résultats contre plusieurs autres constructions promoteur-luciférase et n'avons pas trouvé d'résultats qui semblaient agir post-transcriptionnelle en élevant expression de promoteurs constitutifs. Un autre artefact potentiel pourrait être un facteur de transactivation qui se lie au squelette du vecteur pGL4 plutôt quele promoteur SNCA. Nous avons utilisé le vecteur pGL4 qui a été largement mutagenèse pour éliminer les sites de liaison pour éviter ce problème facteur de transcription. Afin de déterminer si l'un de nos coups nécessaire le squelette du vecteur pour l'induction, nous avons utilisé la PCR pour amplifier la région de vecteur SNCA-luciférase dépourvu de toute colonne vertébrale et utilisé ce fragment linéaire en tant que journaliste pour des analyses secondaires. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans les valeurs d'induction entre notre journaliste de plasmide complète et la construction sans épine dorsale linéaire à une exception près. GATA2 montré ~ 15 fois l'induction avec le plasmide rapporteur, mais seulement environ 2,7 fois avec de l'reporter linéaire, ce qui suggère qu'une partie de l'induction de GATA2 peut être due à la liaison à des éléments de squelette.

Un certain nombre d'autres méthodes pour identifier les régulateurs de transcription ont été décrits. Il ya près de 30 ans, la cartographie des éléments de contrôle de la transcription agissant en cis dans de solides promoteurs viraux, par l'expression d'un gène rapporteur transfectées a été HNEablished 16. Cette méthode, parfois appelée «promoteur dénigrement," est tombé en disgrâce pour la cartographie des promoteurs spécifiques de type cellulaire, car il est difficile d'obtenir et transfecter des lignées de cellules primaires appropriés, et ces lignes peut ne pas représenter exactement leur tissu d'origine. Le système d'un hybride de levure 17 contourne ce problème en fournissant un système rapporteur déconstruit pour détecter les interactions entre une banque de gènes de fusion et un élément agissant en cis spécifique. Notre approche est similaire à la levure système un hybride dans sa conception déconstruit, mais dans notre système nous employons clones d'expression normales plutôt que des fusions de gènes, nous employons des cellules de mammifères plutôt que la levure, et nous employons robotique qui permet quantitative côté-à-côte lectures fonctionnelles pour chaque gène de test. Une méthode prometteuse appelée protéomique des segments isolés de la chromatine (Pich) qui permet l'identification de protéines liées à des régions spécifiques du génome a été décrite 18, mais n'a pas encoreété appliquée avec succès à des gènes humains à copie unique. L'échelle du génome immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq et ChIP-chip) études ont été utilisées pour identifier les régions agissant en cis sur une grande échelle 19. Cette méthode est potentiellement puissant, mais, comme Pich, peut être moins utile pour les types cellulaires tels que les populations neuronales spécifiques qui ne sont pas faciles à obtenir en culture homogène. De plus, lorsque nous avons vérifié les bases de données de ChIP pour nos résultats validés, ils n'ont pas montré de liaison de ces résultats pour le promoteur SNCA. La raison pour cela n'est pas clair, puisque nous avons été en mesure de démontrer la liaison de ces facteurs à la SNCA promoteur par puce classique 14; mais elle peut être due à l'absence de la région promotrice entière SNCA être employé dans des études de puce en utilisant les lectures de puces à ADN (ChIP-chip). Pich, ChIP-seq, et d'autres approches protéomiques peuvent donc être plus utile lorsqu'il est couplé à des lectures fonctionnelles directes que notre méthode permet de générer.

Dual-luciferaseles tests employant luciole et luciferases Renilla offrir une méthode sensible pour l'étude de nombreux processus intracellulaires en format à haut débit 20. La fusion d'un promoteur cible pour la luciférase de luciole a été utilisée pour étudier la structure de réglementation et de promoteur transcriptionnel de nombreuses cibles in vitro, y compris l'alpha-synucléine 1,2. Nous avons développé une alternative peu coûteuse à des réactifs disponibles dans le commerce à double luciférase qui ont fourni signal fort et était linéaire dans la gamme de notre essai (figure 6). Notre méthode est une adaptation d'un protocole généreusement offert par Ron Johnson au NIH et un essai à double luciférase non commercial décrit précédemment 21. Le tampon de dosage luciole lyse les cellules et fournit de l'ATP et de la luciférine, les substrats de la luciférase de luciole. Cet essai donne une réaction luminescente avec une demi-vie d'environ 1 heure (Figure 7). Le tampon de dosage Renilla étanche la fireflsignal Y et fournit un substrat approprié (coelentérazine). Notez que le tampon de dosage Renilla lui-même ne lyser les cellules et doit être utilisé en combinaison avec soit un tampon de lyse Triton ou tampon luciole essai. Nous avons constaté que décrits précédemment tampons de dosage Renilla précipités facilement à la température ambiante, on élimine ainsi du sulfate de sodium et une diminution de la quantité de pyrophosphate de sodium de 60%. Notre analyse comprend également PTC124, un inhibiteur puissant de 22 la luciférase de luciole qui contribue trempe supplémentaire dans le dosage. Activité de trempe est également fourni par l'EDTA, du NaCl, et de pyrophosphate dans la mémoire tampon de Renilla. Avec ces nouvelles formulations, environ 99,5% de l'activité de luciole est trempé par la mémoire tampon de Renilla. L'intensité et la reproductibilité des signaux à la fois de la luciférase de luciole et de Renilla ont été légèrement améliorées par le mélange après l'addition de tampons (étapes 4.6 et 4.10).

Dans notre expérience, l'un complètepromoteur lpha-synucléine dans pGL4.10 est particulièrement difficile pour amplifier et clone, peut-être parce que des régions riches en GC et la structure secondaire complexe dans l'intron 2. Nous étions plus de succès avec des cellules compétentes STBL4, qui sont optimisés pour le clonage d'inserts instables. Même après ces précautions, nous avons récupéré souvent un mutant dans lequel E. coli l'ADN génomique a été inséré dans l'extrémité 3 'du produit de construction. Ce mutant crée des bandes d'environ 5,8 kb et 4 ko lors de la digestion avec BamHI (contre 5,8 kb et 2,8 kb dans le clone correct) et apparaît comme de plus grandes colonies sur des plaques sélectives. Attention, la croissance de cellules compétentes à 30 ° C et la prévention des cultures d'atteindre la saturation diminue, mais n'élimine pas, la probabilité de récupération du mutant. Nous vous recommandons de vérifier la pureté de toutes les préparations d'ADN par digestion de restriction et électrophorèse sur gel avant la transfection.

Ce protocole de dépistage est facilement adaptable à d'autres promoteurs, uned doit être optimisé en conséquence, en utilisant les contrôles gènes positifs et négatifs déjà connus pour réguler le promoteur cible. Plusieurs considérations valent pour le clonage et la transfection des plasmides rapporteurs. Lors du clonage du promoteur de la cible dans le plasmide rapporteur luciférase de luciole, le site d'initiation de la luciférase doit se rapprocher le site d'initiation de traduction dans le gène cible. Écrans à double luciférase placent généralement le plasmide Renilla sous le contrôle d'un promoteur minimal, tel que le promoteur HSV-tk, pour minimiser les effets du squelette du plasmide. Cependant, nous avons constaté que l'un de nos contrôles positifs induits de ce promoteur, donc nous avons opté pour le promoteur de CMV. La quantité relative de chaque plasmide rapporteur doit être déterminée empiriquement et est influencée par l'activité constitutive de chaque promoteur. Base idéal (transfectées, mais non induit) chiffres de la luciférase devraient être au moins de cinq à dix fois plus de fond à partir de cellules non transfectées, pour permettre la détection de bibliothécairegènes y qui répriment ou que la cause la toxicité, qui se traduira par un signal plus bas. Avant le dépistage, vérifier que les chiffres de la luciférase attendus tombent dans le domaine linéaire de chaque essai, qui peut varier entre luminomètres. (Notez que notre Renilla compte tomber généralement à l'extrémité supérieure de la gamme linéaire dans notre test.) Nous avons constaté que l'augmentation du taux d'ADN bibliothèque de luciole plasmide rapporteur a donné lieu à des inductions plus élevées, donc nous avons utilisé le minimum de ce journaliste.

Le protocole de transfection doit être optimisée aussi bien. Nous avons choisi des cellules 293T pour leur relative facilité de transfection, dont l'efficacité a augmenté de 50 fois avec l'ajout d'une étape de centrifugation (étape 3.5). Le SY5Y ligne dopaminergique est plus de 100 fois moins transfectable dans nos mains, et, comme indiqué ci-dessus, peut ne pas être optimale pour effectuer le dépistage de la surexpression. Notre temps de dosage optimal a été déterminé empiriquement à 48 h, ainsi nos cellules ont été étalées à faible densité initiale, Ce qui nécessite l'utilisation de Optifect, qui est conçu pour transfecter des cellules à 10-70% de confluence. D'autres lignées cellulaires peuvent nécessiter des densités différentes de départs et des réactifs de transfection. Nous avons choisi de changer le support de cellule après transfection d'ajouter des antibiotiques (qui pourrait provoquer des effets toxiques si elle est présente pendant la transfection). Bien que cela diminue le risque de contamination bactérienne, il augmente le coût des matériaux (en particulier les Conseils robot pipette), d'où la nécessité de cette étape doit être évaluée lors de l'adaptation de ce protocole à d'autres systèmes. Les dosages de la luciférase peuvent être utilisés avec l'optimisation minime, mais avant de procéder à ce dosage à haut débit dans un type cellulaire différent, de vérifier que les cellules sont lysées de manière appropriée par le tampon de lyse Triton. Notez que le Triton X-100 provoque la coelentérazine autofluorescence. Le signal Renilla dans notre test était assez forte pour banaliser cet effet, mais lors de l'optimisation de ce dosage pour d'autres types de cellules, limiter Triton X-100 volumes à la minimal quantité requise pour la lyse cellulaire.

Nous avons présenté une méthode de criblage rapide et relativement peu coûteux pour identifier de nouveaux régulateurs de la transcription de l'alpha-synucléine en utilisant des cellules transfectées de manière transitoire avec un système rapporteur double luciférase. Ce protocole est facilement modifiable pour cibler d'autres gènes d'intérêt et peut également être adapté pour toute application nécessitant transfections à haut débit, tels que la production de lentivirus 23.

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Disclosures

Ce travail a été soutenu par les redevances obtenues par BacMamreagents de licence (brevet US 5,731,182).

Acknowledgements

Nous remercions John Darga du MGH ADN de base pour la préparation de la bibliothèque de dépistage de l'ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer a fourni un soutien inestimable pour notre Wallac 1420 luminomètre. Steven Ciacco et Martin Thomae de Agilent fourni un appui pour le robot Bravo. Nous remercions Ron Johnson et Steve Titus au NIH pour offrir généreusement leur protocole de dosage de la luciférase double lueur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

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References

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