High-throughput Funktionel Screening ved hjælp af en hjemmelavet Dual-glød Luciferase Assay

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi præsenterer en hurtig og billig screeningsmetode til at identificere transskriptionsregulatorer ved hjælp af high-throughput robot transfektioner og en hjemmelavet dual-glød luciferaseassayet. Denne protokol hurtigt genererer direkte side-by-side funktionelle data for tusinder af gener og er let modificerbare at målrette ethvert gen af ​​interesse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi præsenterer en hurtig og billig high-throughput screening protokol til at identificere transskriptionsregulatorer af alfa-synuclein, et gen associeret med Parkinsons sygdom. 293T-celler transient transficeret med plasmider fra en opstillet ORF ekspressionsbibliotek sammen med luciferase reporter plasmider, i en en-gen-per-brønds mikroplade-format. Ildflueluciferaseaktivitet, analyseres efter 48 timer for at bestemme virkningerne af hvert bibliotek gen upon alfa-synuclein transskription, normaliseret til udtryk fra en intern kontrol konstruktion (en hCMV promotor dirigere Renilla luciferase). Denne protokol lettes af en bench-top robot indesluttet i et biosikkerhed kabinet, som udfører aseptisk væskehåndtering i 96-brønds format. Vores automatiske transfektionsprotokol kan let tilpasses til high-throughput lentiviral bibliotek produktion eller andre funktionelle screening protokoller kræver triple-transfektioner af et stort antal af unikke bibliotek plasmider i konjugeredenction med et fælles sæt af hjælper plasmider. Vi præsenterer også en billig og valideret alternativ til kommercielt tilgængelige, dual luciferase reagenser, som beskæftiger PTC124, EDTA og pyrofosfat at undertrykke ildflueluciferaseaktivitet, før måling af Renilla luciferase. Ved hjælp af disse metoder, vi screenet 7.670 humane gener og identificeret 68 regulatorer af alfa-synuclein. Denne protokol er nemt modificeres til at målrette andre gener af interesse.

Introduction

Evnen til at identificere de vigtigste genetiske regulatoriske elementer og de faktorer, der virker på dem, er fundamental for udforskning af mange biologiske processer. Men at identificere faktorer, der regulerer ekspression af gener i sjældne celletyper, såsom specifikke neuronale populationer, kan være udfordrende. Her præsenterer vi en protokol til identifikation af nye transskriptionsregulatorer af alfa-synuclein (SNCA), et gen associeret med Parkinsons sygdom og udtrykkes i dopaminerge neuroner i substantianigra pars compacta region i midthjernen. Vi opnår dette ved hjælp af en high-throughput, dual-luciferase, in vitro-reporter skærmen for at dekonstruere alfa-synuclein udtryk i 293T-celler. Alfa-synuclein-promotoren først klonet ind i et reporterplasmid, der indeholder ildflue-luciferasegenet. Et kommercielt tilgængeligt plasmid indeholdende Renilla luciferase under kontrol af en konstitutivt aktiv promotor tjener som en intern kontrol. These reporterkonstruktioner er co-transficeret ind i 293T-celler i mikroplader med plasmider fra et DNA-ekspressionsbibliotek, således at hver brønd transficeret med et enkelt bibliotek plasmid. Efter 48 timer, luciferaseaktiviteten for hver reporter måles sekventielt ved hjælp af en dual-glød assay. Den relative ekspression af alfa-synuclein som reaktion på hvert bibliotek gen er udledt af forholdet ildflue: Renilla-luciferase-aktivitet i hver brønd (F: forholdet R) efter plade-baseret normalisering.

Denne protokol giver mulighed for at screene et stort antal gener (~ 2.500 per uge) for deres evne til transaktivere en reporter gen ved hjælp af minimal arbejdskraft (1-2 personer) og minimale omkostninger (omkring $ 3 reagens pris pr mikroplade assay). Transkriptionelle regulatorer af neuronale gener (fx alfa-synuclein), som er vanskelige at undersøge i dyrkede neuroner refraktære over for genetisk manipulation, kan sammenlignes side-by-side i denne direkte funktionelt assay. Vi har i voresprotokol en detaljeret metode til kloning og vækst af plasmider indeholdende a-synuclein-promotoren, da vi fandt, at plasmider indeholdende denne region er ustabile, når de dyrkes med konventionelle procedurer (se Diskussion). Vi inkluderer også et billigt alternativ til kommercielt tilgængelige dual-luciferase-reagenser til high-throughput assays. Denne protokol kan let tilpasses til at målrette andre regulatoriske elementer af interesse eller til enhver proces, der kræver høj kapacitet forbigående transfektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For en eksperimentel overblik, se figur 1.

1.. Forbered Reporter plasmider indeholdende Alpha-Synuclein Promoter

Regulatoriske elementer af alfa-synuclein-genet (figur 2) strækker sig over omkring 10 kb, fra den opstrøms NACP (ikke-A-beta komponent amyloidpeptid) dinukleotid gentagelsessekvens 1,2 gennem intron 2 3. Vi inkluderer en del af denne region i vores reporter konstrukt. Vi fandt, at plasmider indeholdende intron 2 kræves særlige procedurer for vækst, som skitseret nedenfor. Luciferaseaktiviteterne plasmider pGL4.10 og pGL4.75 (figur 3), er kommercielt tilgængelige fra Promega og kan opformeres ved anvendelse af traditionelle molekylærbiologiske protokoller.

  1. Forstærk de 2 dele af alfa-synuclein-promotoren i separate PCR'er ved anvendelse af opskriften i tabel 1, og primerne i tabel 2.
  2. Verify PCR-produkterne på en agarosegel og ren anvendelse af Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) under eluering i 50 pi TE (Tris-EDTA). Opbevar eluerede 0,9 kb fragment ved -20 ° C til fremtidig brug.
  3. Fordøje hele mængden af ​​3,4 kb-PCR-fragmentet, såvel som 5 ug pGL4.10 med Sacl og Xhol. Behandl vektor med alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Roche) og gel rense ved hjælp af PureLink Quick Gel Extraction kit (Invitrogen).
  4. Ligere fragmentet og vektor under anvendelse af T4 DNA ligase (NEB). Rengør afsluttet reaktion ved hjælp af PureLink PCR Micro (Invitrogen) under eluering i 10 pi TE-buffer.
  5. Transform 2 pi af renset, ligeringsreaktionen i 20 pi Electromax Stbl4 kompetente celler (Invitrogen) og elektroporere i henhold til producentens anvisninger. Ryst i en 30 ° C inkubator ved 225 rpm i 90 min. Spred 2 volumener på LB-plader indeholdende 100 mg / ml ampicillin og inkuberes ved 30 ° C i 2 dage.
  6. Ved hjælp af en tandstikker, skal du vælge 4-6 små kolonier til inokulering i 2 ml TB (Terrific Broth). Dyrke disse miniprep kulturer i et 30 ° C shaker O / N.
  7. Renses plasmid-DNA fra 1,5 ml af hver miniprep kultur ved hjælp af PureLink HiPure Plasmid Miniprep-kit (Invitrogen).
  8. Fordøje minipreps med BamHI og elektroforese på en agarosegel. Den korrekte klon skulle producere fragmenter på 2,8 kb og 4,9 kb.
  9. Restreak resterende miniprep kultur fra den korrekte klon på en frisk LB (Luria Broth) plade og vokse ved 30 ° C i 2 dage.
  10. Vælg en lille koloni og pode et 1,5 ml TB syrevækker. Ryst O / N ved 30 ° C. Lad ikke startmotoren kultur vokse til mætning.
  11. Fortynd hele syrevækkerkultur i 150 ml forvarmet TB og rystes ved 30 ° C i 2 dage. Inden vi går videre til næste trin, skal du bruge 1,5 ml af denne kultur til en ekstra miniprep og fordøjelse for at bekræfte, at klonen ikke mutere under replicati på.
  12. Renses plasmid-DNA fra den tilbageværende kultur ved hjælp af PureLink HiPure Plasmid Maxiprep kit (Invitrogen). Forventede udbytter af dette intermediære plasmid er 50-150 ug pr 150 ml kultur.
  13. Optø 0,9 kb fragmentet frosset i trin 1.2. Gentag trin 1,3-1,12 at klone 0,9 kb fragment i den mellemliggende plasmid fordøje i stedet med KpnI og Sad. Liger, transformere, vælge og vokse for maxipreps som ovenfor. Fordøjelse med BamHI bør give fragmenter på 5,8 kb og 2,8 kb. Dette er plasmid, der vil blive anvendt til skærmen.

2.. Forbered 293T Cells, reporterplasmider, og Bibliotek DNA til Screening

293T-celler først podet i plader med 96 brønde og transficeret den følgende dag. Reporterplasmider og Bibliotek DNA'er fortyndes i 96-brønds plader. Vi opnåede plader af transfektion kvalitet bibliotek DNA fra DNA Core på Massachusetts General Hospital (få = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Denne protokol transfects et enkelt bibliotek plade i to identiske plader af 293T-celler (figur 1), bør således to plader af celler podes for hvert bibliotek plade, der skal screenes.

Bemærk: Grow celler i medier uden phenolrødt eller antibiotika, da disse funktioner strider luciferaseassays og øge toksicitet under transfektion, hhv.

  1. For hvert bibliotek plade, der skal screenes, resuspender trypsiniseret 293T-celler til en koncentration på 1,5 x 10 5 celler / ml i DMEM indeholdende 14% FBS. Hæld i en steril beholder (Axygen).
  2. Anbring reservoiret 2 klar rundbundede, 96-brønds-plader (Corning), og en æske filter pipettespidser (Agilent) på robotten dæk. Overføres 100 pi af celler i hver brønd i begge plader, til en densitet på 1,5 x 10 4 celler pr.
  3. Centrifuger cellepladerne ved 50 g i 2 minutter ved hjælp af en lav rampe hastigheder for at sikre ligecelledensitet hele hver brønd. Inkuberes ved 37 ° C og 10% CO 2 O / N.
  4. Fortynd ildflue og Renilla reporter plasmider til 5 ng / ul i serumfrie medier. Kombiner fortyndinger i forholdet 5:03 ildflue til Renilla plasmid (volumen) i en 15 ml konisk rør.
  5. Pipette de kombinerede plasmider i hver brønd i en 96-brønds plade, dispensering 17 pi pr bibliotek plade plus 2-10 pi overskud, i hver brønd.
  6. Opnå transfektion-grade DNA bibliotek plader som ovenfor og fortyndes til 13,3 ng / mikroliter med endotoksin-frit vand. Den mindste volumen pr vel bør være 28 pi.

3. Udfør Transfektioner

På dag 2 af skærmen, er reporterplasmider og bibliotek DNA transficeret ind 293T celler.

  1. For hvert bibliotek plade, blandes 107.5 pi RT Optifect (Invitrogen) med 4,3 ml serumfrit medium (1:40 fortynding) i et polystyrenrør. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur, ogn dispensere 44 pi (per bibliotek plade) i hver brønd i en 96-brønds, polystyren V-bund plade (Greiner).
  2. Pladen af ​​fortyndet Optifect, reporterplasmider (trin 2.5), Bibliotek DNA (trin 2.6), og en æske pipettespidser på robotten dækket.
  3. Aspirer 17 pi reporterplasmider, 43 pi fortyndet Optifect, og 26 pi bibliotek DNA, indsætter et 5 ul luft mellem hver aspiration. Biblioteket DNA skal aspireres sidst for at undgå krydskontaminering. Dispensér indholdet af tips til en ny polystyren V-bund plade, mix, dække, og der er afsat 20 minutter til at tillade lipid / DNA-komplekserne til at danne. Hvis transfektion flere bibliotekets plader, erstatte pipettespidser og bibliotek plade, og gentag.
  4. Afdække Optifect / DNA-blanding plade og placere den på robotten dæk med 2 plader af 293T celler. Ved hjælp af en enkelt kasse af pipettespidser, aspirat 80 ul af Optifect: DNA-blandingen og langsomt dispensere 40 ul på hver plade af celler. Hvis transdesinficering af flere bibliotekets plader, gentag for alle Optifect: DNA-plader. Dæk celler.
  5. Centrifuger cellepladerne ved 1200 xg i 30 minutter. Dæk og vende tilbage til inkubatoren.
  6. Inkubér cellerne i 4-6 timer. Under denne inkubering forberede frisk medium ved at blande 12 ml DMEM indeholdende 10% FBS og 10 ug / ml ciprofloxacin (Cellgro) for hver transficeret bibliotek plade. Hæld frisk medier i en steril beholder.
  7. Placer 2 kasser med robot tips, en enkelt plade af celler, reservoiret indeholder frisk medier, og et spild reservoir på robotten dæk. Aspirer 100 pi medier fra celler og dispensere i spildreservoiret delvist fyldt med 70% ethanol. Brug friske tips, aspirat 100 ul af friske medier og langsomt dispensere på cellerne. Gentag for alle plader af celler.
  8. Retur plader til inkubatoren i 48 timer.

4.. Udfør dual-luciferaseassays

På dag 4 af skærmen,ildflue og Renilla luciferase assays udføres.

Bemærk: Den dobbelt luciferase assay kræver sekventiel tilsætning af to assay buffere, 3X ildflue assaypuffer og 3X Renilla assaybuffer, som beskrevet i tabel 3 Firefly og Renilla luciferaser ikke udskilles, og dermed skal cellerne lyseres før måling af luciferaseaktivitet. . Firefly assaybuffer lyserer cellerne og giver substrat for ildflueluciferase; Renilla assaybuffer quencher ildflue signalet og substrat for Renilla-luciferase.

  1. For hvert bibliotek plade, forberede 8 ml 3X ildflue assaypuffer fra stamopløsninger, som beskrevet i tabel 3 og dispensere 82 ul i hver brønd i en 96-brønds V-bund plade.
  2. For hvert bibliotek plade, også forberede 12 ml 3X Renilla assaypuffer og dispensere 122 ul i hver brønd i en 96-brønds V-bund plade. Braklægning bådeFirefly og Renilla assay buffere.
  3. Placer en kasse af pipettespidser, et spildreservoir og 2 plader af celler (transficeret fra det samme bibliotek plade) på robotten dæk.
  4. Aspirer 60 pi medier fra hver plade og bortskaffes i spildreservoiret delvist fyldt med 70% ethanol. Dækplader og afsat. Hvis transfektion flere bibliotekets plader, gentag for alle sæt plader.
  5. Placer 2 kasser med pipettespidser, plade af 3X ildflue assaypufferen, og et sæt af celleplader på robotten dækket.
  6. Aspirer 40 pi 3X ildflue assaypuffer og føje den til den første plade af celler, blanding grundigt. Skift til nye pipettespidser, gentag for den anden celle plade. Anbring cellerne ved stuetemperatur i 10 min for at fuldføre lysis. Hvis transfektion flere bibliotekets plader, erstatte de kasser med tips og celleplader, og gentag.
  7. Optag luminescens fra hver brønd i hver celle plade på et luminometer, optagelse i 1 sekund per brønd. Retur plader til robottendæk.
  8. Placer 2 kasser med pipettespidser, plade af 3X Renilla assaypuffer, og et sæt af celleplader på robotten dækket.
  9. Aspirer 60 ul 3X Renilla assay buffer, og føje den til den første plade af celler, blanding grundigt. Skift til en ny kasse med pipettespidser, gentag for den anden celle plade. Hvis transfektion flere bibliotekets plader, gentag for alle sæt celleplader.
  10. Optag luminescens fra alle plader på et luminometer, optagelse hver brønd i 1 sek som ovenfor. Kassér plader.

5.. Dataanalyse

  1. Beregn ildflue: Renilla luminescens ratio ("F: forholdet R") for hver brønd ved at dividere de tællinger af ildflue signal ved tællinger af Renilla signal.
  2. Beregn induktion værdi ved at dividere F: forholdet R for hver brønd med det gennemsnitlige F: forholdet R for den plade, idet det bedste og laveste 25% af brønde.
  3. Gennemsnittet af induktion værdier på tværs af gentagelserfor en enkelt transficeret bibliotek plade. Gener, der inducerer eller represserende alfa-synuclein mere end tre-folder betragtes som "hits" på denne skærm, og er genstand for yderligere validering og sekundære skærme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typiske luciferase værdier, F: R nøgletal og induktions-værdier for en enkelt halv plade er vist i figur 4. Bemærk hit i godt H2, en 32-fold inducer.. Gener, der forårsager overdreven toksicitet (for eksempel godt E3) eller brønde, der var dårligt transficerede, vil producere lave værdier for både ildflue og Renilla luciferaser, men et gennemsnit induktion værdi. Gener, der forårsager ikke-specifik induktion af luciferaseaktivitet, måske via interaktion med pGL4 rygrad, vil inducere ildflue og Renilla luciferaser lige, hvilket resulterer i en gennemsnitlig induktion værdi. Store forskelle i induktion værdier mellem gentagelser bør rejse mistanke for udførelse fejl. Det er vigtigt at kontrollere, at skærmen er udført inden for det lineære område af reporter assays så kloner, der forårsager øget ekspression vil blive målt som øget luciferaseaktivitet. Vi transficerede stigende mængde af hver reportergen at validere linearitetfor reporter assay under vore eksperimentelle betingelser (figur 5). Det er også vigtigt at udføre assayene Umiddelbart efter inkubation for at undgå ikke-linearitet skyldes substratmangel. Vi observerede signifikant ildflueluciferaseaktivitet, op til 1 time efter tilsætning af reagenser (figur 6).

Figur 1
Fig. 1. Eksperimentel overblik. Hver enkelt plade af bibliotekets DNA kombineres med 2 reporterkonstruktioner og anvendes til at transficere duplikatplader af celler. Efter 48 timer, er aktiviteten af ​​hver luciferasereporter målt sekventielt. Den specifikke induktion af SNCA promotoren plasmid ved hvert bibliotek plasmid beregnes som forholdet mellem ildflue til Renilla-luciferase efter plade-baserede normalization.

Figur 2
Figur 2. Skematisk af 5'-regionen af alfa-synuclein (SNCA), der ligger på kromosom 4, der anvendes til ildflue reporterplasmidet. Primer navne svarer til sekvenser i tabel 2. Hatch mærker angiver en omtrent 8 kb segment fjernet fra figuren ellers at skalere. ATG-startkodonen for SNCA ligger i exon 3.

Figur 3
Figur 3.. Luciferasereporter plasmider, der anvendes i denne screening protokol. Er SNCA genomiske regioner klonet i kloningssted PG multipleL4.10 umiddelbart opstrøms for ildflue-luciferase. Et plasmid med hCMV-IE1 (humant cytomegalovirus umiddelbare tidlige 1)-promotor dirigere ekspressionen af Renilla-luciferase, blev anvendt som en intern kontrol. Begge plasmider er kommercielt tilgængelig fra Promega.

Figur 4
Fig. 4. Repræsentative resultater for halvdelen af en enkelt plade med 96 brønde. A. Rå ildflueluciferase tæller B. Raw Renilla luciferase tæller C. F:.. R nøgletal, beregnet ved at dividere værdien i A med værdien i B. D. Induktion værdier for hver brønd, beregnes ved at dividere hver F: forholdet R med det gennemsnitlige F:. forholdet R for den plade, eksklusive de øverste og nederste 25% af brøndene E. Grafisk repræsentation af induktion henblik en enkelt plade, med godt H2, en positiv hit, fremhævet. Hit H2 er en neuronal transskription faktor, der ikke tidligere var forbundet med SNCA udtryk. Klik her for at se større figur .

Figur 5
Figur 5. Linearitet assays. Celler blev transficeret med stigende mængder af ildflue og Renilla luciferase plasmider under kontrol af den stærke hCMV-IE1-promotoren og analyseret med ovennævnte protokol. (Total mængde DNA transficeret blev holdt konstant ved brug af en neutral balanceblok plasmid). A. Firefly linearitet assay. Bemærk at ildflue aktivitet forbliver lineær gennem en bred vifte af værdier. B. Renilla linearitet assay. Bemærk udfladning af kurven over 15 ng / brønd.

ntent "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 6
.. Figur 6. Tidsforløb for henfald signal for ildflue-luciferaseassayet Luciferase reagenser blev tilsat til en enkelt plade transficeret med CMV-luciferase konstruktion ved tid 0; serielle målinger blev foretaget uden tilsætning af yderligere reagenser.

Component Volumen Slutkoncentration
BAC 2002-D6 på 5 ng / ul 4 pi -
5X Phusion GC Buffer 20 pi 1X
DMSO 6 pi 6%
dNTPs (10 mm) 2 pi 200 uM
Forward Primer (100 uM) 1 pi 10 uM
Reverse Primer (100 uM) 1 pi 10 uM
ddH2O 65 pi -
Phusion DNA Polymerase 1 pi -
I alt: 100 pi

Tabel 1.. PCR opsætning til forstærkning af alfa-synuclein promotor.

Navn Sequence Begrænsning site
SNCA7 5'-GTC GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' Kpnl
SNCA8 5'-TGC GAGCTC aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' Sad
SNCA1 5'-tct GAGCTC tctgagcatttccctaggtg-3 ' Sad
SNCA2 5'-tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' XhoI

.. Tabel 2. Primere til forstærke alfa-synuclein promotor Den NACP Gentag amplikon skal producere en 0,9 kb fragment; den anden amplicon længde er 3,4 kb. For primer steder, henvises til figur 2.

A: 3X Firefly Assay Buffer
Stock Solutions (opbevares ved -80 ° C) Volumen pr 100 ml 3X Firefly Assay Buffer Slutkoncentration (3X)
500 mM DTT 3,0 ml 15 mM
10 mM coenzym A 6,0 ml 0,6 mM
100 mM ATP 0,45 ml 0,45 mM
80 mg / mlluciferin 0,525 ml </ Td> 4,2 mg / ml
Triton lysepuffer 90,025 ml -
B. Triton Lysis Buffer
Komponent (opbevares ved RT) Volumen pr 100 ml Triton Lysis Buffer Slutkoncentration
Tris-HCI pulver 1.705 g 0,1082 M
Tris-base-pulver 0,508 g 0,0419 M
5 M NaCl 1,50 ml 75 mm
1 M MgCl2 0.30 ml 3 mM
Triton X-100 ren flydende 0,75 ml 0,25%
Vand til 100 ml totalvolumen -
C. 3X Renilla Assay Buffer
Volumen pr ~ 100 ml 3X Renilla Assay Buffer Slutkoncentration (3X)
10 mM PTC124 i DMSO 0,6 ml 0,06 mM
2 mM h-CTZ i ethanol 0,5 ml 0,01 mm
Renilla Salts 100 ml -
D. Renilla Salts
Komponent (opbevares ved RT) Volumen pr 100 ml Renilla Salts Slutkoncentration
0,5 M Na2EDTA 9,0 ml 45 mM
Na pyrophosphat 1,34 g 30 mM
NaCl 8,33 g 1,425 M
Vand til 100 ml totalvolumen -

Tabel 3. Stamopløsninger og assay buffere til ildflue og Renilla luciferase assays. A. 3X ildflue assaybuffer opskrift. DTT, dithiothreitol. Medmindre andet er angivet, alle komponenter er opløselige i vand. B. Triton lysepuffer opskrift. C. 3X Renilla assaybuffer opskrift. h-CTZ, h-coelenterazin. Lav 2 mM h-CTZ ved tilsætning af 10 mg h-CTZ til 12,2 ml 100% EtOH og 120 pi koncentreret HCI. PTC124 er opløseligt i DMSO. D. Renilla salte opskrift. Triton lysepuffer og Renilla salte er stabile i adskillige uger ved 4 ° C og stuetemperatur, hhv. 3X ildflue assaypuffer og 3X Renilla assaybufferen bør blandes inden 3-4 hr udføre den luciferaseassay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alpha-synuclein har været impliceret i Parkinsons sygdom (PD) som en komponent af Lewy organer 4, intracellulære inklusioner anses pathognomonic for sygdommen. Talrige genom-dækkende forening undersøgelser har knyttet enkelt nukleotid polymorfier i alfa-synuclein med øget risiko for sporadisk PD 5,6,7. Selvom mindre udbredt end sporadiske PD kan familiær PD også blive forårsaget af mutationer i alfa-synuclein 8 samt overlapning og tre eksemplarer af alfa-synuclein locus 9,10,11, et fænomen ses også i sporadiske PD 12. Tilsammen disse undersøgelser styrke det centrale i alfa-synuclein til patogenesen af ​​PD. Formålet med denne skærm var at identificere gener, der regulerer alfa-synuclein og kan derfor spille en rolle i patogenesen af ​​Parkinsons sygdom. Ved hjælp af denne protokol, vi screenet 7.670 humane gener og identificeret 154 indledende hits (mindst 3 gange induktorer), svarende til 140unikke gener. Disse hits var genstand for sekundære analyser ved brug af nye DNA-præparater til at bestemme hit reproducerbarhed. Hits i 3-dobbelte område er gengivet i 28% af de efterfølgende luciferaseassays. Reproducerbarhed steg til 59%, 69% og 78% i 4 -, 5 -, og 5-fold induktorer, hhv. Hits med induktioner over 7-fold gengivet 100% af tiden. Vi i sidste ende identificeret 68 nye regulatorer af alfa-synuclein transskription.

Flere linjer af beviser tyder på, at de 68 hits, vi opnåede er virkelige regulatorer af alfa-synuclein. Vores liste over identificerede hits omfatter GATA3, et medlem af GATA familie af transkriptionsfaktorer tidligere har vist at regulere SNCA udtryk 3. Scoring en af ​​de få kendte SNCA lovgivere giver stor tillid til pålideligheden af ​​vores skærm. Desuden har vi selvstændigt scoret som rammer flere medlemmer af den samme familie af neuronale transkriptionsfaktorer, hvilket tyder på, at skærmen er reproducerbare og ikke identificere genertilfældigt. Vigtigst er det, i yderligere opfølgende analyser, evne til vores top hits til at regulere endogen SNCA udtryk i neuronale celler blev valideret i overekspression og knockdown assays. Vi overudtrykt et par af de øverste hits hjælp BacMamvectors 3 i SY5Y dopaminerge celler og var i stand til at øge endogene SNCA niveauet 2-8 fold, mens shRNA knockdown af disse hits medført et fald i SNCA mRNA niveauer. Disse undersøgelser endegyldigt vise, at vores top hits er regulatorer af endogene SNCA niveauer, og er ikke blot artefakter for dekonstrueret luciferase system. Yderligere opfølgende undersøgelser for andre hits vil være forpligtet til at bestemme den sande falsk positive og falsk negative priser for den fulde liste over hits i vores skærm. En komplet beskrivelse af de hits og deres forhold til Parkinsons sygdom er under udarbejdelse 14.

Det er vigtigt at overveje de begrænsninger af vores screening metodologi. Det bør obvskellige, at skærmen ikke ville identificere nogen regulator ikke præsentere i screeningen biblioteket. Mens vores screening bibliotek var betydelig, som indeholder omkring en fjerdedel af det menneskelige genom, det ikke var udtømmende. Da det er enkelt vores analyse, kan yderligere biblioteker screenes med lethed. Vi har øget antallet af gener screenes på en målrettet måde ved at inkludere paraloger af hits, når de foreligger, i vores sekundære analyser. Vi vil også ikke score nogen hit som bundet til genomiske regioner uden for dem, der indgår i vores reporter konstruktion. For at maksimere chancen for at herunder korrekt region vores reporter indeholdt umiddelbare flankerende sekvenser for de multiple transcription start sites fundet i SNCA promotoren. Det er sandsynligt, at yderligere faktorer binde til regioner langt uden for det umiddelbare promotorregion at regulere SNCA ekspression. Disse kunne påvises ved at udføre skærme med yderligere opstrøms og nedstrøms regioner, hvis det ønskes, men kun ~ 10 kb på et tidspunkt kunne være enssessed på denne måde på grund af begrænsninger på effektiv kloning i plasmidvektorer og stabiliteten af ​​de højt kopital pGL4 vektorer. Alternativt kunne luciferase konstruktionen eftermonteres i BAC DNA'er indeholdende SNCA locus. En ulempe ved denne fremgangsmåde er, at transfektion af BAC'er selv under ideelle forhold er> 100 gange mindre effektiv derefter plasmider 15. En anden fremgangsmåde ville være at "knock-in" luciferasereporteren ind i den endogene SNCA locus, en metode, der er langt mere besværlig, så vores tilgang. Vi vil også ikke score nogen hit som allerede udtrykt ved mættende niveauer, således at overekspression ikke resultere i øget luciferaseaktivitet. Af denne grund har vi valgt at ansætte ikke-neuronale 293T celler, som kan have vanskeligt neuronale faktorer regulerer SNCA, og faktisk vi score en række af neuronale transkriptionsfaktorer. En potentiel ulempe ved 293T celler, er imidlertid, at vi måske ikke score nogen gen som et hit, hvis det krævede enDERLIGERE neuronale faktorer til at fungere ordentligt. Således, ligesom alle skærme, kunne vores undersøgelse glip af en række potentielle SNCA regulatorer. Men i praksis de 68 hits vi opnåede forøgelse af antallet af kendte regulatorer af SNCA med mere end 10 gange og vil kræve mange års arbejde for at følge op, så yderligere hits er måske ikke nødvendigt i vores tilfælde.

Det er også vigtigt at indse de potentielle artefakter, der kan opstå ved brug af denne metode. I kemiske skærme, luciferase er berygtet for artifactually scorende forbindelser ved stabilisering af luciferase protein snarere end ved induktion af transkription. For at udelukke proteinstabilisering artefakter, vi screenede vores hits mod flere andre promotor-luciferase konstruktioner og fandt ikke nogen hits som syntes at handle post-transkriptionelt ved at løfte udtryk fra konstitutive promotorer. En anden potentiel artefakt kunne være en transaktiverende faktor, som binder til pGL4 vektorrygraden snarere endden SNCA promotoren. Vi beskæftigede pGL4 vektor, der er blevet grundigt mutageniseret at fjerne transskription faktor bindende websteder for at undgå dette problem. At vurdere, om nogen af ​​vores hits krævede vektorgrundstrukturen til induktion, vi brugte PCR til at opformere SNCA-luciferase vektor region blottet for enhver rygrad og brugt dette lineære fragment som reporter for sekundære analyser. Vi fandt ingen signifikant forskel i induktions-værdier mellem vores komplette plasmid reporter og den lineære rygrad-fri konstruktion med én undtagelse. GATA2 viste ~ 15-fold induktion med plasmidet reporter, men kun ca 2,7 gange med lineære reporter, hvilket tyder på, at nogle af GATA2 induktion kan skyldes binding til backbone komponenter.

Er blevet beskrevet en række andre metoder til at identificere transkriptionelle regulatorer. Næsten 30 år siden blev den kortlægning af cis-virkende transkriptionskontrolelementer i stærke viruspromotorer via transficeret reporter genekspression established 16. Denne metode, som undertiden betegnes "promotor bashing", er faldet i unåde for kortlægning af celle-type-specifikke promotorer, da det er vanskeligt at opnå og transfektion egnede primære cellelinier, og sådanne linjer muligvis ikke nøjagtigt repræsentere deres væv af oprindelse. Gæren en hybrid-system 17 går rundt dette problem ved at give en dekonstrueret reporter system til at registrere samspil mellem et bibliotek af fusion gener og en specifik cis-virkende element. Vores tilgang er magen til den gær en hybrid-system i sin dekonstrueret design, men i vores system, vi anvender normale udtryk kloner snarere end genfusioner, vi ansætter pattedyrceller snarere end gær, og vi beskæftiger robotteknologi som giver side-by-side kvantitativ funktionelle aflæsninger for hver test-gen. Betegnes som en lovende metode proteomics af isolerede kromatin segmenter (Pich), som tillader identifikation af proteiner bundet til specifikke genomregioner er blevet beskrevet 18, men har endnu ikkeblevet anvendt med succes til en enkelt kopi menneskelige gener. Genom-dækkende kromatin immunoprecipitation (chip-seq og chip-chip) undersøgelser er blevet brugt til at identificere cis-virkende regioner på en stor skala 19. Denne metode er potentielt kraftfuld, men, ligesom Pich, kan være mindre nyttigt for celletyper såsom specifikke neuronale populationer, som ikke let opnås i homogen kultur. Desuden, når vi har kontrolleret chip databaser til vores validerede hits, de har ikke vist binding af disse hits til SNCA promotor. Grunden til dette er ikke klart, da vi har været i stand til at demonstrere binding af disse faktorer til SNCA promotor ved konventionel chip 14; men det kan være på grund af mangel af hele SNCA promotor region vil blive ansat i CHIP undersøgelser ved hjælp af microarray udlæsninger (chip-chip). Pich, chip-seq samt andre proteom tilgange kan derfor være mest nyttig, når koblet til direkte funktionelle udlæsninger, at vores metode genererer.

Dual-luciferaseanalyser, der anvender ildflue og Renilla luciferaserne tilbyder en følsom metode til at studere en række intracellulære processer i high-throughput format 20. Sammensmeltningen af et mål-promotor til ildflue-luciferase har været anvendt til at undersøge den transkriptionelle regulering og promotor struktur af talrige mål in vitro, herunder alfa-synuclein 1,2. Vi udviklede et billigt alternativ til kommercielt tilgængelige dual-luciferase-reagenser, der er fastsat robust signal og var lineær i området i vores assay (figur 6). Vores metode er tilpasset fra en protokol generøst leveres af Ron Johnson på NIH og en tidligere beskrevet ikke-kommerciel dual-luciferaseassayet 21. Ildflue assaybuffer lyserer cellerne og giver ATP og luciferin, substraterne ildflueluciferase. Dette assay giver en glød reaktion med en halveringstid på cirka 1 time (figur 7). The Renilla assaybuffer quencher fireflY-signalet og giver passende substrat (coelenterazin). Bemærk, at Renilla assaybuffer sig selv ikke vil lysere cellerne og skal anvendes i kombination med enten Triton lysisbuffer eller ildflue-assaybuffer. Vi fandt, at tidligere beskrevne Renilla assay buffere let udfældede ved stuetemperatur, og dermed elimineres vi natriumsulfat og faldt mængden af natriumpyrophosphat med 60%. Vores analyse omfatter også PTC124, en potent inhibitor af ildflueluciferase 22, der bidrager yderligere quenching i assayet. Afkølende aktivitet er også leveret af EDTA, NaCl og pyrophosphat i Renilla buffer. Med disse nye formuleringer er cirka 99,5% af ildflue aktivitet standset ved Renilla buffer. Intensiteten og reproducerbarhed af både ildflue og Renilla luciferase signaler blev lidt bedre ved blanding efter tilsætning af buffere (trin 4.6 og 4.10).

Det er vores erfaring, komplet enpha-synuclein promotor i pGL4.10 er unikt svært at forstærke og klon, måske på grund af GC-rige regioner og kompleks sekundær struktur i intron 2. Vi var mest succes med STBL4 kompetente celler, som er optimeret til kloning af ustabile skær. Selv efter disse forholdsregler, vi ofte genvundet en mutant, hvor E. coli genomisk DNA blev indsat i 3'-enden af konstruktionen. Denne mutant skaber bånd på ca 5,8 kb og 4 kb ved fordøjelse med BamHI (versus 5,8 kb og 2,8 kb i den korrekte klon), og vises som større kolonier på selektive plader. Omhyggelig vækst af kompetente celler ved 30 ° C og forhindre kulturer fra at nå mætning falder, men udelukker ikke, at sandsynligheden for at inddrive mutant. Vi anbefaler, at kontrollere renheden af ​​alle DNA-præparater af restriktionsfordøjelse og gelelektroforese før transfektion.

Denne screening protokol kan let tilpasses til andre promotorer, end skal optimeres til anvendelse som positive og negative kontroller gener, der allerede er kendt for at regulere målet promotoren. Flere overvejelser gælder for kloning og transfektion af reporterplasmider. Ved kloning targetpromotoren i ildflue luciferase reporter plasmid bør startstedet af luciferase tilnærme translationsstartstedet i målgenet. Dual-luciferase-skærme typisk placere Renilla plasmid under kontrol af en minimal promotor, såsom HSV-tk-promotor, for at minimere virkningerne af plasmidrygraden. Vi fandt imidlertid, at en af ​​vores positive kontroller inducerede denne promotor, derfor valgte vi for CMV-promotoren. Den relative mængde af hver reporterplasmid bør bestemmes empirisk og er påvirket af konstitutiv aktivitet af hver promotor. Ideel baseline (transficeret, men uinducerede) luciferase tæller bør være mindst fem til ti gange over baggrund fra utransficerede celler, for at muliggøre detektion af library-gener, der undertrykker eller der forårsager toksicitet, hvilket vil resultere i lavere signal. Før screening kontrollere, at de forventede luciferase tæller falder inden for det lineære område af hver analyse, som kan variere mellem luminometre. (Bemærk, at vores Renilla tæller falder typisk i den øvre ende af det lineære område i vores assay.) Vi har fundet, at forøgelse af forholdet mellem biblioteket DNA til ildflue-reporterplasmid resulterede i højere induktioner, således anvendte vi den minimale mængde af denne reporter.

Den transfektionsprotokol skal optimeres så godt. Vi valgte 293T celler til deres relative lethed af transfektion effektivitet som steg 50 gange med tilføjelse af et centrifugeringstrin (trin 3.5). Dopaminerge linje SY5Y er over 100 gange mindre transficerbare i vores hænder, og som diskuteret ovenfor, er måske ikke optimale til udførelse overekspression screening. Vores optimale assay tid blev empirisk bestemt til at være 48 timer, og dermed vores celler udpladedes ved en lav initial densitet, Hvilket nødvendiggør brugen af ​​Optifect, som er designet til at transficere celler ved 10-70% konfluens. Andre cellelinjer kan kræve forskellige udgangspunkter tætheder og forskellige transfektionsreagenser. Vi valgte at ændre celle medier efter transfektion at tilføje antibiotika (som kan forårsage toksicitet, hvis til stede under transfektion). Selv om dette mindsker sandsynligheden for bakteriel forurening, det øger omkostningerne i materialer (især robot pipettespidser), og dermed nødvendigheden af ​​dette trin bør evalueres i forbindelse med tilpasning af denne protokol til andre systemer. Luciferase assays kan anvendes med minimal optimering, men før denne assay med højt gennemløb med en anden celletype, kontrollere, at cellerne passende lyseres ved Triton lysisbuffer. Bemærk, at Triton X-100 forårsager coelenterazin autofluorescens. Den Renilla signal i vores analyse var stærk nok til at bagatellisere denne effekt, men når optimere denne assay for andre celletyper, begrænse Triton X-100 mængder til miNimal beløb, der kræves for celle lysis.

Vi har præsenteret en hurtig og forholdsvis billig metode til screening til identifikation af hidtil ukendte transkriptionelle regulatorer af alfa-synuclein anvendelse af celler transient transficeret med en dual-luciferase reporter system. Denne protokol er nemt modificeres til at målrette andre gener af interesse og kan også tilpasses til enhver applikation kræver high-throughput transfektioner, såsom lentivirus produktion 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbejde blev støttet af royalties opnået ved licens BacMamreagents (US patent 5.731.182).

Acknowledgements

Vi takker John Darga af MGH DNA Core til forberedelse af DNA screening biblioteket. Christopher Chigas af Perkin Elmer uvurderlig støtte til vores Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco og Martin Thomae af Agilent ydet støtte til Bravo robot. Vi takker Ron Johnson og Steve Titus på NIH for generøst at give deres dual-glød luciferaseassayet protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10, (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113, (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388, (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71, (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70, (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2, (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356, (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics