High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Biology

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Summary

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

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Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

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Abstract

Vi presentiamo un protocollo di screening high-throughput rapido e poco costoso per identificare i regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina, un gene associato alla malattia di Parkinson. Cellule 293T sono transitoriamente trasfettate con plasmidi di una libreria di espressione ORF schierati, insieme con plasmidi reporter luciferasi, in un formato micropiastra un gene-per-bene. Attività di luciferasi di lucciola è analizzato dopo 48 ore per determinare gli effetti di ogni gene biblioteca upon alfasinucleina trascrizione, normalizzata a espressione da un costrutto di controllo interno (promotore hCMV dirigere Renilla luciferasi). Questo protocollo è facilitato da un robot banco racchiuso in un armadio biosicurezza, che esegue la movimentazione liquido asettico in formato a 96 pozzetti. Il nostro protocollo di trasfezione automatizzato è facilmente adattabile a high-throughput produzione biblioteca lentivirali o altri protocolli di screening funzionali che richiedono triple-transfezioni di un gran numero di plasmidi biblioteca unica nel coniugatonction con un insieme comune di plasmidi helper. Presentiamo anche un'alternativa economica e validato per disponibili in commercio, doppio reagenti luciferasi che impiega PTC124, EDTA, e pirofosfato di sopprimere l'attività luciferasi di lucciola prima della misura di Renilla luciferasi. L'utilizzo di questi metodi, abbiamo proiettato 7670 geni umani e identificato 68 regolatori di alfa-sinucleina. Questo protocollo è facilmente modificabile per indirizzare altri geni di interesse.

Introduction

La capacità di identificare i principali elementi regolatori genetici ed i fattori che agiscono su di essi è fondamentale per l'esplorazione di numerosi processi biologici. Tuttavia, identificando i fattori che regolano l'espressione dei geni in tipi di cellule rare, come specifiche popolazioni di neuroni, può essere impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo per identificare nuovi regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina (SNCA), un gene associato con la malattia di Parkinson ed espresso nei neuroni dopaminergici nella substantianigra pars compacta regione del mesencefalo. Compiamo questo utilizzando uno schermo giornalista high-throughput, dual-luciferasi, in vitro decostruire l'espressione di alfa-sinucleina in cellule 293T. Il promotore alfasinucleina viene clonato in un plasmide contenente il gene reporter di luciferasi di lucciola. Un plasmide disponibile in commercio, contenente la luciferasi Renilla sotto il controllo di un promotore costitutivamente attivo serve come controllo interno. Thescostrutti e giornalista sono co-trasfettati in cellule 293T in micropiastre con plasmidi da una libreria di espressione del DNA, in modo che ogni bene è trasfettate con una singola libreria plasmide. Dopo 48 ore, l'attività della luciferasi per ogni giornalista è misurata in sequenza usando un test a doppio bagliore. L'espressione relativa di alfa-sinucleina in risposta a ciascun gene libreria viene dedotto dal rapporto di lucciola: attività di luciferasi Renilla in ciascun pozzetto (F: rapporto R) dopo normalizzazione basato piastra.

Questo protocollo consente di schermare un gran numero di geni (~ 2,500 a settimana) per la loro capacità di transattivare un gene reporter utilizzando manodopera minima (1-2 persone) e un costo minimo (circa $ 3 costo reagente per test micropiastra). Regolatori trascrizionali di geni neuronali (ad esempio, alfa-sinucleina), che sono difficili da studiare in neuroni in coltura refrattari alla manipolazione genetica, possono essere confrontati side-by-side in questo saggio funzionale diretta. Noi includiamo nel nostroprotocollo un metodo dettagliato per la clonazione e la crescita dei plasmidi contenenti il ​​promotore alfa-sinucleina, poiché abbiamo scoperto che i plasmidi contenenti questa regione sono instabile quando cresciuta con procedure convenzionali (vedi Discussione). Abbiamo anche un'alternativa economica per i reagenti disponibili in commercio dual-luciferasi per saggi high-throughput. Questo protocollo può essere facilmente adattato per indirizzare altri elementi regolatori di interesse, o su qualsiasi processo che richiede alto throughput trasfezioni transitorie.

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Protocol

Per una panoramica sperimentale, vedi Figura 1.

1. Preparare plasmidi reporter contenente la alfa-sinucleina Promoter

Elementi regolatori del gene alfa-sinucleina (Figura 2) si estendono circa 10 kb, da monte NACP (non Un componente di beta amiloide) sequenza dinucleotide repeat 1,2 attraverso introne 2 3. Includiamo una porzione di questa regione in il nostro costrutto giornalista. Abbiamo trovato che i plasmidi contenenti introni 2 richieste procedure speciali per la crescita, come indicato di seguito. I plasmidi di luciferasi, pGL4.10 e pGL4.75 (Figura 3), sono disponibili in commercio da Promega e possono essere propagate utilizzando protocolli di biologia molecolare convenzionali.

  1. Amplificare i 2 componenti del promotore alfasinucleina in PCR separati utilizzando la ricetta nella Tabella 1 e primer in Tabella 2.
  2. Verify prodotti di PCR su un gel di agarosio e pulite utilizzando il kit di purificazione PCR Qiaquick (Qiagen), eluendo in 50 ml di TE (Tris-EDTA). Conservare il eluito 0,9 kb frammento a -20 ° C per un uso futuro.
  3. Digerire l'intero volume del 3,4 kb frammento di PCR, e 5 ug di pGL4.10, con SacI e XhoI. Trattare il vettore con il vitello Intestino fosfatasi alcalina (Roche) e gel purificare utilizzando il kit PureLink rapida Gel Extraction (Invitrogen).
  4. Legare il frammento e il vettore utilizzando T4 DNA ligasi (NEB). Pulire la reazione compilato utilizzando il kit PureLink PCR Micro (Invitrogen), eluizione in 10 microlitri di buffer TE.
  5. Trasforma 2 ml di pulito, reazione di ligazione in 20 microlitri di cellule competenti ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) e l'elettroporazione secondo le istruzioni del produttore. Agitare in un incubatore a 30 ° C a 225 rpm per 90 min. Distribuire 2 volumi su piastre LB contenenti 100 mg / ml ampicillina e incubare a 30 ° C per 2 giorni.
  6. Usando uno stuzzicadenti, selezionare 4-6 piccole colonie per inoculo in 2 ml di TB (Terrific Broth). Coltivare queste culture Miniprep in 30 ° C shaker O / N.
  7. Purificare il DNA plasmidico da 1,5 ml di ciascuna coltura miniprep utilizzando il kit PureLink HiPure Plasmid Miniprep (Invitrogen).
  8. Digerire le minipreps con BamHI e elettroforesi su gel di agarosio. Il clone corretto dovrebbe produrre frammenti di 2.8 kb e 4.9 kb.
  9. Restreak il restante cultura miniprep dalla corretta clone su un LB (Luria Broth) piastra fresca e crescere a 30 ° C per 2 giorni.
  10. Selezionare una piccola colonia e inoculare una coltura starter da 1,5 ml TB. Agitare O / N a 30 ° C. Non lasciate che la coltura starter crescere fino a saturazione.
  11. Diluire l'intera cultura di avviamento in 150 ml di TB preriscaldata e agitare a 30 ° C per 2 giorni. Prima di procedere alla fase successiva, con 1,5 ml di questa coltura per un miniprep e digestione supplementare per confermare che il clone non mutano durante replicati on.
  12. Purificare il DNA plasmidico dal restante coltura utilizzando il kit PureLink HiPure Plasmid Maxiprep (Invitrogen). Rendimenti attesi di questo plasmide intermedio sono 50-150 g per 150 ml di cultura.
  13. Scongelare il frammento di 0,9 kb congelati nel passaggio 1.2. Ripetere i passaggi 1,3-1,12 per clonare il frammento di 0,9 kb nel plasmide intermedio, digerire invece con KpnI e SacI. Legare, trasformare, selezionare e crescere per maxipreps come sopra. Digestione con BamHI dovrebbe produrre frammenti di 5.8 kb e 2,8 kb. Questo è il plasmide che verrà utilizzato per lo schermo.

2. Preparare Cellule 293T, Reporter, plasmidi e DNA Library for Screening

Cellule 293T vengono prima seminate in piastre da 96 pozzetti e trasfettate il giorno seguente. Plasmidi reporter e DNA biblioteca sono diluiti in piastre da 96 pozzetti. Abbiamo ottenuto lastre di trasfezione-grade libreria di DNA dal Nucleo DNA presso il Massachusetts General Hospital (ottenere = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Questo protocollo transfects una singola piastra di libreria in 2 piastre identiche di cellule 293T (Figura 1), quindi 2 piastre di celle deve essere seminate per ciascuna piastra biblioteca da schermare.

Nota: Coltivare cellule in media senza rosso fenolo o antibiotici, in quanto questi interferiscono con i saggi di luciferasi e aumentano la tossicità durante la transfezione, rispettivamente.

  1. Per ciascuna piastra libreria da proiettato, risospendere le cellule 293T trypsinized ad una concentrazione di 1,5 x 10 5 cellule / ml in DMEM contenente 14% FBS. Versare in un serbatoio sterile (Axygen).
  2. Posizionare il serbatoio, 2 chiare a fondo, piastre da 96 pozzetti (Corning), e una scatola di suggerimenti filtro pipetta (Agilent) sul ponte robot. Pipettare 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di entrambe le piastre, per una densità di 1,5 x 10 4 cellule per pozzetto.
  3. Centrifugare le piastre cellulari a 50 xg per 2 minuti, utilizzando una velocità di rampa basse per garantire la paritàdensità delle cellule durante ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C e 10% di CO 2 O / N.
  4. Diluire la lucciola e Renilla plasmidi reporter a 5 ng / ml in mezzi privi di siero. Combinare le diluizioni in un rapporto di 05:03 lucciola di Renilla plasmide (in volume) in un tubo da 15 ml.
  5. Preparare la plasmidi combinati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, dosaggio 17 ml per piastra biblioteca, oltre a 2-10 ml in eccesso, in ogni pozzetto.
  6. Ottenere trasfezione-grade lastre biblioteca DNA come sopra e diluire a 13,3 ng / ml con acqua priva di endotossine. Il volume minimo per bene dovrebbe essere di 28 ml.

3. Eseguire trasfezioni

Il giorno 2 dello schermo, plasmidi reporter e DNA libreria sono trasfettati in cellule 293T.

  1. Per ogni piatto biblioteca, mescolare 107,5 ml di RT Optifect (Invitrogen) con 4,3 ml di mezzi privi di siero (1:40 diluizione) in una provetta di polistirene. Incubare per 5 min a temperatura ambiente, e lan dispensare 44 microlitri (per piastra biblioteca) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, polistirolo V-fondo (Greiner).
  2. Posizionare la piastra di Optifect diluito, plasmidi reporter (Passo 2.5), DNA biblioteca (Punto 2.6), e una scatola di puntali sul ponte robot.
  3. Aspirare 17 ml di plasmidi reporter, 43 ml di Optifect diluita, e 26 ml di DNA biblioteca, inserendo una intercapedine d'aria 5 microlitri tra ogni aspirazione. Il DNA biblioteca dovrebbe essere aspirato ultimo per evitare la contaminazione incrociata. Versare il contenuto delle punte in una nuova lastra di polistirene V-fondo, mescolare, coprire e mettere da parte per 20 minuti per consentire complessi lipide / DNA per formare. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, sostituire i puntali e la piastra biblioteca, e ripetere.
  4. Scoprire la piastra miscela di Optifect / DNA e posizionarlo sul ponte robot con 2 piastre di cellule 293T. Utilizzando un unico box di puntali, aspirare 80 ml di Optifect: miscela di DNA e lentamente dispensare 40 microlitri su ogni piatto di cellule. Se transfezione piatti biblioteca multiple, ripetere per tutti Optifect: lastre DNA. Coprire le cellule.
  5. Centrifugare piastre delle celle a 1.200 xg per 30 min. Coprire e tornare alla incubatrice.
  6. Incubare le cellule per 4-6 ore. Durante questa incubazione, preparare supporti fresco miscelando 12 ml di DMEM contenente 10% FBS e 10 pg / ml ciprofloxacina (Cellgro) per ciascuna piastra biblioteca transfettate. Versare mezzi freschi in un serbatoio sterile.
  7. Posizionare 2 scatole di punte robot, una singola piastra di cellule, il serbatoio contenente terreno fresco, e un serbatoio di rifiuti sul ponte robot. Aspirare 100 microlitri di media dalle cellule e dispensare nel serbatoio rifiuti parzialmente riempito con etanolo al 70%. Usando le punte fresche, aspirare 100 ml di mezzi freschi e lentamente dispensare sulle celle. Ripetere l'operazione per tutte le piastre di cellule.
  8. Piastre Ritorno al incubatore per 48 ore.

4. Eseguire Dual-luciferasi saggi

Il giorno 4 dello schermo, lalucciola e Renilla saggi di luciferasi vengono eseguiti.

Nota: Il dosaggio dual-luciferasi richiede l'aggiunta sequenziale di 2 buffer di saggio, 3X tampone lucciola saggio e tampone di saggio 3X Renilla, come descritto nella Tabella 3 di lucciola e Renilla luciferasi non sono secreti, così le cellule devono essere lisate prima di misurare l'attività di luciferasi. . Tampone di saggio lucciola lisa le cellule e fornisce substrato per la luciferasi di lucciola; tampone Renilla estingue il segnale lucciola e fornisce substrato per la luciferasi Renilla.

  1. Per ciascuna piastra biblioteca, preparare 8 ml di tampone 3X lucciola saggio da soluzioni madre come descritto nella Tabella 3, e dispensare 82 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
  2. Per ciascuna piastra biblioteca, inoltre preparare 12 ml di tampone 3X Renilla e dispensare 122 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Mettere da parte sia l'lucciola e Renilla buffer di analisi.
  3. Posizionare una casella di puntali, un serbatoio di rifiuti, e 2 piatti di cellule (trasfettate dallo stesso piatto biblioteca) sul ponte robot.
  4. Aspirare 60 ml di mezzi di comunicazione di ogni piatto e gettare nel serbatoio rifiuti parzialmente riempito con il 70% di etanolo. Piastre di copertura e mettere da parte. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, ripetere per tutti i set di piatti.
  5. Mettere 2 scatole di puntali, il piatto di 3X tampone di lucciola saggio, e una serie di piatti cellulari sul ponte robot.
  6. Aspirare 40 ml di 3X tampone di lucciola saggio e aggiungere al primo piatto di cellule, mescolando bene. Il passaggio a nuovi puntali, ripetere per la seconda piastra di cella. Posizionare cellule a temperatura ambiente per 10 minuti per completare la lisi. Se trasfettando piatti biblioteca più, sostituire le scatole di punte e piastre cellulari, e ripetere.
  7. Record luminescenza da ciascun pozzetto di ciascuna piastra di cella su un luminometro, registrando per 1 sec per pozzetto. Piastre Ritorno al robotdeck.
  8. Mettere 2 scatole di puntali, il piatto di tampone 3X Renilla, e una serie di piatti cellulari sul ponte robot.
  9. Aspirare 60 ml di tampone 3X Renilla, e aggiungerlo al primo piatto di cellule, mescolando bene. Il passaggio a una nuova scatola di puntali, ripetere per la seconda piastra di cella. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, ripetere per tutti i set di piatti cellulari.
  10. Record luminescenza da tutte le piastre su un luminometro, registrando ogni pozzetto per 1 sec come sopra. Eliminare le piastre.

5. Analisi dei dati

  1. Calcolare la lucciola: rapporto Renilla luminescenza ("F: rapporto R") per ogni pozzetto dividendo conti di segnale lucciola dai conti di segnale Renilla.
  2. Calcolare il valore di induzione dividendo il F: rapporto R di ciascun pozzetto dalla F media: rapporto R della piastra, escludendo il più alto e più basso del 25% dei pozzi.
  3. La media dei valori di induzione di tutti replicatiper una piastra biblioteca transfettate. I geni che inducono o reprimendo l'alfa-sinucleina più di tre pieghe sono considerati "hits" in questa schermata e sono soggetti a ulteriore convalida e schermi secondari.

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Representative Results

Valori tipici luciferasi, F: tassi di R e valori di induzione per un singolo semipiastra sono mostrati in Figura 4 Nota il colpo in ben H2, un induttore 32 volte.. Geni che causano eccessiva tossicità (per esempio, ben E3), o pozzi che erano scarsamente transfettate, produrranno valori bassi per entrambi lucciola e Renilla luciferasi, ma un valore medio di induzione. Geni che causano induzione non specifico di attività di luciferasi, forse attraverso l'interazione con la spina dorsale pGL4, indurranno lucciola luciferasi e Renilla ugualmente, ottenendo un valore medio di induzione. Grandi differenze nei valori di induzione tra le repliche dovrebbero sollevare il sospetto di errori di esecuzione. È importante verificare che lo schermo viene effettuata all'interno del range lineare dei saggi del reporter in modo che i cloni che causano l'espressione aumentata verranno misurate come una maggiore attività di luciferasi. Abbiamo trasfettato crescente quantità di ciascun gene reporter per convalidare la linearitàdel saggio reporter sotto nostre condizioni sperimentali (Figura 5). E 'importante anche eseguire saggi, immediatamente dopo la fase di incubazione per evitare la non linearità causa di esaurimento del substrato. Abbiamo osservato significativa attività luciferasi di lucciola fino a 1 ora dopo l'aggiunta di reagenti (Figura 6).

Figura 1
Figura 1. Visione sperimentale. Ogni singola piastra di DNA biblioteca è combinato con 2 costrutti reporter e usato per trasfettare altre piastre di cellule. Dopo 48 ore, l'attività di ciascun giornalista luciferasi è misurata in sequenza. L'induzione del promotore specifico plasmide SNCA da ciascun plasmide libreria è calcolata dal rapporto tra lucciola di Renilla luciferasi dopo normalizatio base piastriformen.

Figura 2
Figura 2. Schematica della regione 5 'di alfa-sinucleina (SNCA), localizzato sul cromosoma 4, utilizzato nel plasmide reporter lucciola. Nomi Primer otterrebbero sequenze in Tabella 2. Separatori indicano un segmento di circa 8 kb eliminato dalla figura , altrimenti in scala. Il codone di inizio ATG per SNCA si trova nell'esone 3.

Figura 3
Figura 3. Luciferasi plasmidi reporter utilizzati in questo protocollo di screening. Le regioni genomiche SNCA vengono clonati nel sito di clonazione multiplo di pGL4.10 immediatamente a monte della luciferasi di lucciola. Un plasmide con HCMV-IE1 (citomegalovirus umano precoce immediato 1) promotore dirigere l'espressione di Renilla luciferasi è stato utilizzato come controllo interno. Entrambi i plasmidi sono disponibili in commercio da Promega.

Figura 4
Figura 4. Risultati rappresentativi per mezzo di una singola piastra a 96 pozzetti. A. Raw conta lucciola luciferasi B. Raw Renilla conta luciferasi C. F:.. Rapporti R, calcolato dividendo il valore in A per il valore dei valori B. D. induzione per ogni bene, calcolato dividendo ciascun F: rapporto R dalla media F:. rapporto R della piastra, escludendo la parte superiore e inferiore del 25% di pozzi E. Rappresentazione grafica dei valori di induzione un piatto unico, con ben H2, un colpo positivo, ha evidenziato. Hit H2 è un fattore di trascrizione neuronale non precedentemente associata con l'espressione SNCA. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5
Figura 5. Saggi linearità. Cellule sono state trasfettate con quantità crescenti di lucciola e plasmidi Renilla luciferasi sotto il controllo del promotore forte HCMV IE1 e dosati con il protocollo di cui sopra. (Quantità totale di DNA trasfettate è stato mantenuto costante mediante l'uso di un plasmide di bilanciamento neutro). A. Firefly saggio linearità. Si noti che l'attività lucciola rimane lineare attraverso un'ampia gamma di valori. B. Renilla saggio linearità. Si noti l'appiattimento della curva superiore a 15 ng / pozzetto.

S copi "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 6
.. Figura 6 Naturalmente il tempo di decadimento del segnale per il saggio di luciferasi di lucciola luciferasi reagenti sono stati aggiunti a una singola lastra transfettate con un CMV-luciferasi costruire al tempo 0; misurazioni seriali sono stati effettuati senza l'aggiunta di altri reagenti.

Componente Volume Concentrazione finale
BAC 2002-D6 a 5 ng / ml 4 pl -
5X Phusion GC Buffer 20 microlitri 1X
DMSO 6 pl 6%
dNTP (10 mm) 2 microlitri 200 micron
Forward Primer (100 micron) 1 ml 10 pM
REverse Primer (100 micron) 1 ml 10 pM
DDH 2 O 65 microlitri -
Phusion DNA polimerasi 1 ml -
Totale: 100 pl

Tabella 1. Dosaggio PCR per amplificare il promotore alfasinucleina.

Nome Sequenza Limitazione del sito
SNCA7 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' KpnI
SNCA8 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' SacI
SNCA1 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' SacI
SNCA2 5'-tag ctcgag ggctaatgaattcctttaca-3 ' XhoI

.. Tabella 2 primer per amplificare il promotore alfa-sinucleina Il Ripeti amplicone NACP dovrebbe produrre un frammento di 0,9 kb; l'altra lunghezza amplicone è di 3,4 kb. Per le posizioni di primer, si prega di fare riferimento alla Figura 2.

A: 3X Firefly Assay Buffer
Soluzioni Stock (conservare a -80 ° C) Volume per 100 ml 3X Firefly Assay Buffer Concentrazione finale (3X)
DTT 500 mM 3,0 ml 15 MM
10 mM coenzima A 6,0 ml 0,6 mm
ATP 100 mM 0.45 ml 0,45 mM
80 mg / mlluciferin 0,525 ml </ Td> 4,2 mg / ml
Tampone di lisi Triton 90,025 ml -
B. Triton Lysis Buffer
Component (conservare a RT) Volume per 100 ml Triton Lysis Buffer Concentrazione finale
Polvere Tris-HCl 1.705 g 0,1082 M
Polvere di Tris-base 0.508 g 0,0419 M
5 M NaCl 1.50 ml 75 mm
1 M MgCl 2 0.30 ml 3 mm
Triton X-100 liquido puro 0,75 ml 0,25%
Acqua a 100 volume totale ml -
C. 3X Renilla Assay Buffer
Volume per ~ 100 ml 3X Renilla Assay Buffer Concentrazione finale (3X)
PTC124 10 mM in DMSO 0,6 ml 0,06 mm
2 mm H-CTZ in etanolo 0,5 ml 0,01 mm
Renilla Sali 100 ml -
D. Renilla Sali
Component (conservare a RT) Volume per 100 ml Renilla Sali Concentrazione finale
0,5 M Na 2 EDTA 9,0 ml 45 mm
Na Pyrophosphate 1.34 g 30 mm
NaCl 8.33 g 1.425 M
Acqua a 100 volume totale ml -

Tabella 3. Soluzioni archivi e buffer di analisi per la lucciola e Renilla saggi di luciferasi. A. 3X lucciola saggio ricetta buffer. DTT, ditiotreitolo. Salvo indicato, tutti i componenti sono solubili in acqua. B. Triton tampone di lisi ricetta. C. 3X Renilla tampone ricetta. h-CTZ, h-coelenterazina. Fai 2 mm H-CTZ con l'aggiunta di 10 mg h-CTZ a 12,2 ml di EtOH 100% e 120 ml di HCl concentrato. PTC124 è solubile in DMSO. D. Renilla sali ricetta. Triton tampone di lisi e sali Renilla sono stabili per diverse settimane a 4 ° C e RT, rispettivamente. 3X tampone lucciola e tampone 3X Renilla devono essere mescolati entro 3-4 ore di eseguire il test luciferasi.

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Discussion

Alfasinucleina è stato implicato nel morbo di Parkinson (PD) come componente di corpi di Lewy 4, inclusioni intracellulari considerati patognomonici per la malattia. Numerosi studi di associazione genome-wide hanno collegato polimorfismi a singolo nucleotide in alfa-sinucleina con aumentato rischio di sporadici PD 5,6,7. Sebbene meno comune rispetto sporadici PD, PD familiare può essere causato anche da mutazioni nel alfa-sinucleina 8, così come la duplicazione e triplicazione della alfa-sinucleina locus 9,10,11, un fenomeno visto anche in sporadici PD 12. Presi insieme, questi studi rafforzano la centralità di alfa-sinucleina alla patogenesi del PD. Lo scopo di questo schermo era identificare geni che regolano alfasinucleina e quindi può giocare un ruolo nella patogenesi della malattia di Parkinson. Usando questo protocollo, abbiamo proiettato 7670 geni umani e identificato 154 risultati preliminari (almeno induttori 3 volte), che rappresenta 140geni unici. Questi risultati sono stati oggetto di analisi secondarie utilizzano nuove preparazioni di DNA per determinare hit riproducibilità. Hits nella gamma di 3 volte riprodotti nel 28% dei successivi saggi luciferasi. Riproducibilità aumentato al 59%, 69% e 78% in 4 -, 5 -, e induttori 5 volte, rispettivamente. Hits con induzioni oltre 7 volte riprodotti 100% del tempo. Abbiamo infine identificato 68 nuovi regolatori di alfa-sinucleina trascrizione.

Molte evidenze sperimentali suggeriscono che i 68 successi che abbiamo ottenuto sono dei veri regolatori di alfa-sinucleina. La nostra lista di risultati individuati comprende GATA3, un membro della famiglia dei fattori di trascrizione GATA già dimostrato di regolare l'espressione SNCA 3. Segnando uno dei pochi regolatori SNCA conosciuti dà grande fiducia nella affidabilità del nostro schermo. Inoltre, indipendentemente segnato come colpisce diversi membri della stessa famiglia di fattori di trascrizione neuronali, suggerendo che lo schermo è riproducibile e non l'identificazione dei genia caso. Soprattutto, in ulteriori test di follow-up, la capacità del nostro top colpisce per regolare l'espressione endogena SNCA in cellule neuronali è stato validato in sovraespressione e saggi atterramento. Abbiamo iperespresso alcuni dei top colpisce con BacMamvectors 3 in cellule dopaminergiche SY5Y ed erano in grado di aumentare i livelli endogeni SNCA 2-8 volte, mentre shRNA atterramento di questi risultati ha comportato diminuzione dei livelli SNCA mRNA. Questi studi dimostrano conclusivamente che i nostri migliori risultati sono regolatori dei livelli SNCA endogeni e non sono semplicemente artefatti del sistema luciferasi decostruito. Ulteriori studi di follow-up per altri successi saranno necessari per determinare i veri tassi positivi e falsi negativi falsi per l'elenco completo dei risultati del nostro schermo. Una descrizione completa dei successi e il loro rapporto con la malattia di Parkinson è in preparazione 14.

E 'importante considerare i limiti della nostra metodologia di screening. Va obvpagherò che lo schermo non identificare alcun regolatore non presenti nella libreria di screening. Mentre la nostra biblioteca di screening è stato notevole, contenente circa un quarto del genoma umano, non era completo. Data la semplicità della nostra analisi, librerie aggiuntive potrebbero essere schermati con facilità. Abbiamo aumentato il numero di geni schermati in modo mirato includendo paraloghi di risultati, quando disponibili, nelle nostre analisi secondarie. Abbiamo inoltre non avremmo segnare ogni colpo che legava alle regioni genomiche al di fuori di quelli inclusi nel nostro costrutto giornalista. Per massimizzare la possibilità di includere la regione corretta, il nostro reporter conteneva le sequenze fiancheggianti immediati per i diversi siti di inizio della trascrizione presenti nel promotore SNCA. È probabile che ulteriori fattori legano a regioni molto al di fuori della regione promotore immediato per regolare l'espressione SNCA. Questi potrebbero essere rilevati eseguendo schermate con ulteriori regioni a monte ea valle, se desiderato, anche se solo ~ 10 kb per volta possono esseressessed in questo modo a causa di limitazioni efficiente clonazione in vettori plasmidici e la stabilità delle alto numero di copie pGL4 vettori. In alternativa, il costrutto luciferasi potrebbe essere adattato in DNA BAC contenenti il ​​locus SNCA. Uno svantaggio di quest'ultimo approccio è che la transfezione di BAC anche in condizioni ideali è> 100 volte meno efficienti poi plasmidi 15. Un altro approccio sarebbe quello di "knock-in", il giornalista luciferasi nel endogeno SNCA locus, un metodo che è molto più laborioso quindi il nostro approccio. Abbiamo inoltre non avremmo segnare ogni colpo che è già espressa a saturare i livelli in modo che la sovraespressione non si traduce in una maggiore attività luciferasi. Per questo motivo abbiamo scelto di impiegare cellule 293T non neuronali, che potrebbero mancare i fattori neuronali che regolano SNCA, e anzi abbiamo fatto segnare un certo numero di fattori trascrizionali neuronali. Un potenziale svantaggio di cellule 293T, tuttavia, è che non potremmo segnare qualsiasi gene come un colpo se richiesta unafattori neuronali SUPPLEMENTARI per funzionare correttamente. Così, come tutti gli schermi, il nostro studio potrebbe mancare un numero di potenziali regolatori SNCA. Tuttavia, in termini pratici, i 68 successi abbiamo ottenuto aumento del numero di regolatori note di SNCA da più di 10 volte e richiederanno anni di lavoro di follow-up, in modo da ulteriori risultati possono non essere necessari nel nostro caso.

E 'anche importante capire i potenziali artefatti che possono verificarsi utilizzando questa metodologia. In schermi chimici, luciferasi è noto per i composti artifactually punteggio per la stabilizzazione della proteina luciferasi, piuttosto che per induzione della trascrizione. Per escludere artefatti stabilizzazione proteica, abbiamo proiettato i nostri risultati contro diversi altri costrutti promotore-luciferasi e non abbiamo trovato nessun colpi che sembravano agire post-trascrizionale elevando espressione di promotori costitutivi. Un altro potenziale artefatto potrebbe essere un fattore di transattivazione che si lega al vettore backbone pGL4 anzichéil promotore SNCA. Abbiamo impiegato il vettore pGL4 che è stato ampiamente mutagenizzato per rimuovere fattore di trascrizione siti di legame per evitare questo problema. Per valutare se una qualsiasi delle nostre visite richiesto la spina dorsale vettore per l'induzione, abbiamo usato la PCR per amplificare la regione vettore SNCA-luciferasi privo di spina dorsale e usato questo frammento lineare come reporter per analisi secondarie. Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nei valori di induzione tra il nostro giornalista plasmide completo e il costrutto privo di spina dorsale lineare con una sola eccezione. GATA2 mostrato induzione ~ 15 volte con il giornalista plasmide, ma solo ~ 2.7 volte con il giornalista lineare, suggerendo che alcuni di induzione GATA2 può essere dovuto al legame ai componenti dorsali.

Un certo numero di altri metodi per identificare regolatori trascrizionali sono stati descritti. Quasi 30 anni fa, la mappatura degli elementi di controllo trascrizionale-cis in qualità di forti promotori virali attraverso l'espressione del gene reporter transfettate è stata ESTablished 16. Questo metodo, a volte definito "promotore colpire," è caduto in disgrazia per la mappatura dei promotori specifici di cellule di tipo dal momento che è difficile da ottenere e transfettare linee cellulari primarie adeguati, e tali linee non può rappresentare con precisione il loro tessuto di origine. Il sistema di one-ibrido del lievito 17 elude questo problema fornendo un sistema giornalista decostruito per individuare le interazioni tra una libreria di geni di fusione e di uno specifico elemento cis-acting. Il nostro approccio è simile al sistema un ibrido del lievito nel suo design destrutturato, ma nel nostro sistema impieghiamo cloni espressione normali anziché fusioni geniche, impieghiamo cellule di mammifero anziché lievito, e conta robotica che permette side-by-side quantitativa letture funzionali per ogni gene prova. Un metodo promettente definito proteomica di isolati segmenti della cromatina (Pich), che permette l'identificazione di proteine ​​legate a specifiche regioni del genoma è stata descritta 18, ma non ha ancorastato applicato con successo a singola copia geni umani. Genome-wide immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq e ChIP-chip) studi sono stati utilizzati per identificare le regioni cis-agendo su larga scala 19. Questo metodo è potenzialmente potente, ma, come Pich, può essere meno utile per i tipi cellulari quali specifiche popolazioni di neuroni che non sono facilmente ottenuti nella cultura omogenea. Inoltre, quando abbiamo controllato database chip per i nostri risultati convalidati, non hanno mostrato vincolante di tali risultati al promotore SNCA. La ragione di questo non è chiaro, dato che siamo stati in grado di dimostrare di legame di questi fattori al promotore SNCA da Chip convenzionale 14; ma può essere dovuto alla mancanza di tutta la regione promotore SNCA essere impiegato in studi fiches utilizzando letture microarray (ChIP-chip). Pich, ChIP-seq, e altri approcci di proteomica possono quindi essere più utile quando accoppiato alle letture funzionali dirette che il nostro metodo genera.

Dual-luciferasisaggi impiegando lucciola luciferasi e Renilla offrire un metodo sensibile per studiare numerosi processi intracellulari in formato high-throughput 20. La fusione di un promotore bersaglio di luciferasi di lucciola è stato utilizzato per studiare la regolazione e struttura promotore trascrizionale di numerosi obiettivi in vitro, compresi alfasinucleina 1,2. Abbiamo sviluppato un'alternativa economica ai reagenti disponibili in commercio dual-luciferasi che fornivano segnale robusto e era lineare nell'intervallo nostra analisi (Figura 6). Il nostro metodo è adattato da un protocollo generosamente fornita da Ron Johnson al NIH e precedentemente descritto non commerciale saggio dual-luciferasi 21. Il tampone di saggio lucciola lisa le cellule e fornisce ATP e luciferina, i substrati di luciferasi di lucciola. Questa analisi produce una reazione bagliore con un'emivita di circa 1 ora (Figura 7). Il tampone Renilla placa la firefly segnale e fornisce substrato (coelenterazine). Si noti che il tampone Renilla sé non lisare le cellule e deve essere usato in combinazione con Triton tampone di lisi o tampone di lucciola test. Abbiamo trovato che precedentemente descritti buffer saggio Renilla prontamente precipitati a RT, quindi abbiamo eliminato solfato di sodio e diminuita la quantità di sodio pirofosfato del 60%. La nostra analisi comprende anche PTC124, un potente inibitore della luciferasi di lucciola 22 che contribuisce tempra supplementare nel saggio. Attività tempra è fornito anche da EDTA, NaCl, e pirofosfato nel buffer Renilla. Con queste nuove formulazioni, circa 99,5% dell'attività lucciola è bloccata mediante buffer Renilla. L'intensità e la riproducibilità dei segnali sia Renilla luciferasi di lucciola e sono leggermente migliorate mescolando dopo l'aggiunta dei buffer (fasi 4.6 e 4.10).

Nella nostra esperienza, completa unpromotore lpha-sinucleina in pGL4.10 è l'unica difficile da amplificare e clonare, forse a causa di regioni ricche di GC e complessa struttura secondaria in introne 2. Siamo rimasti molto successo con cellule competenti STBL4, che sono ottimizzati per la clonazione di inserti instabili. Anche dopo queste precauzioni, abbiamo spesso recuperato un mutante in cui E. coli DNA genomico è stato inserito all'estremità 3 'del costrutto. Questo mutante crea bande di circa 5,8 kb e 4 kb quando digerito con BamHI (rispetto a 5.8 kb e 2,8 kb nel clone corretta) e appare come colonie più grandi su piastre selettive. Un'attenta crescita di cellule competenti a 30 ° C e prevenire culture di raggiungere riduzioni di saturazione, ma non elimina, la probabilità di recupero del mutante. Si consiglia di verificare la purezza di tutte le preparazioni di DNA di restrizione digest e l'elettroforesi su gel prima di trasfezione.

Questo protocollo di screening è facilmente adattata ad altri promotori, und deve essere ottimizzata conseguenza, utilizzando come controlli positivi e negativi geni già noti per regolare il promotore bersaglio. Diverse considerazioni valgono per la clonazione e trasfezione dei plasmidi reporter. Quando clonando il promotore bersaglio nel plasmide reporter luciferasi di lucciola, il sito di inizio della luciferasi dovrebbe approssimare il sito di inizio traslazionale nel gene bersaglio. Schermi dual-luciferasi tipicamente collocare il plasmide Renilla sotto il controllo di un promotore minimo, come il promotore HSV-tk, per minimizzare gli effetti della dorsale plasmide. Tuttavia, abbiamo scoperto che uno dei nostri controlli positivi indotti questo promotore, così abbiamo optato per il promotore CMV. La quantità relativa di ciascun plasmide giornalista deve essere determinato empiricamente ed è influenzata dalla attività costitutiva di ciascun promotore. Basale Ideal (transfettate, ma uninduced) conta luciferasi dovrebbero essere almeno cinque a dieci volte su sfondo dalle cellule non trasfettate, per consentire l'individuazione di collgeni y che reprimono o che la tossicità causa, che si tradurrà in segnale più basso. Prima della proiezione, verificare che conta luciferasi previsti rientrano nel range lineare di ciascun saggio, che può variare tra luminometri. (Si noti che la nostra Renilla risiedono tipicamente cadere al limite superiore del range lineare nel nostro saggio.) Abbiamo trovato che aumentando il rapporto di DNA biblioteca di lucciola plasmide reporter provocato induzioni elevate, quindi abbiamo utilizzato la quantità minima di questo reporter.

Il protocollo di trasfezione deve essere ottimizzato pure. Abbiamo scelto 293T cellule per la loro relativa facilità di trasfezione, la cui efficacia è aumentata di 50 volte con l'aggiunta di una fase di centrifugazione (passo 3.5). La SY5Y linea dopaminergico è superiore a 100 volte meno transfectable nelle nostre mani, e, come discusso in precedenza, potrebbe non essere ottimale per eseguire lo screening sovraespressione. Il nostro tempo ottimale dosaggio è stato empiricamente determinato in 48 ore, così le nostre cellule sono state piastrate a bassa densità iniziale, Rendendo necessario l'uso di Optifect, che è progettato per trasfettare cellule a 10-70% di confluenza. Altre linee cellulari potrebbero richiedere diverse densità di partenza e le diverse reagenti di trasfezione. Abbiamo scelto di cambiare il supporto cella dopo trasfezione aggiungere antibiotici (che potrebbero causare tossicità se presenti durante trasfezione). Anche se questo riduce il rischio di contaminazione batterica, aumenta il costo dei materiali (in particolare Pronostici robot pipetta), quindi la necessità di questo passo dovrebbe essere valutato al momento di modificare questo protocollo per altri sistemi. I saggi di luciferasi possono essere utilizzati con l'ottimizzazione minima, ma prima di eseguire questo test in alta velocità con un tipo di cella diversa, verificare che le cellule siano adeguatamente lisate mediante tampone di lisi Triton. Si noti che Triton X-100 provoca coelenterazina autofluorescenza. Il segnale Renilla nel nostro test era abbastanza forte per banalizzare questo effetto, ma quando ottimizzare questo test per altri tipi di cellule, limita Triton X-100 volumi alla miNimal quantità necessaria per lisi cellulare.

Abbiamo presentato un metodo di screening rapido e relativamente poco costoso per identificare nuovi regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina utilizzando cellule trasfettate transitoriamente con un sistema dual-reporter di luciferasi. Questo protocollo è facilmente modificabile per indirizzare altri geni di interesse e può anche essere adattato per qualsiasi applicazione che richieda trasfezioni alto throughput, come la produzione di lentivirus 23.

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Disclosures

Questo lavoro è stato sostenuto da royalties ottenute con BacMamreagents licenze (US Patent 5.731.182).

Acknowledgments

Ringraziamo Giovanni Darga del DNA Nucleo MGH per la preparazione della biblioteca di screening del DNA. Christopher Chigas di Perkin Elmer ha fornito il supporto prezioso per la nostra Wallac 1420 luminometro. Steven Ciacco e Martin Thomae di Agilent fornito il supporto per il robot Bravo. Ringraziamo Ron Johnson e Steve Tito presso il NIH di generosità fornendo il loro protocollo del saggio di luciferasi dual-bagliore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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