الأيضية وصفها من لوسين ريتش كرر تحركات 1 و 2 مع المشعة الفوسفات

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي بروتينات متعددة المجالات التي ترميز كل من GTPase والمجالات كيناز والتي هي فسفرته في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الشاملة phophorylation الخلوية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة، بما في ذلك مجال كيناز سيرين ثريونين، وهو رأس من البروتينات المعقدة المجال (ROC)، لC-محطة المجال ROC (مجلس النواب)، ويسين الغنية ويكرر مثل ankyrin في N-محطة. أدوار الخلوية الدقيقة للLRRK1 وLRRK2 لم يتم بعد توضيح، ولكن LRRK1 وقد تورط في التيروزين كيناز مستقبلات إشارات 1،2، بينما هو متورط LRRK2 في التسبب في مرض باركنسون 3،4. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 البروتينات في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الفسفرة العام لهذه البروتينات في الخلايا 2. باختصار، الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد سوى عدد قليلوصفت بذلك بالإشعاع ساعة من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات. عبر العلامة تقارب (3xflag) يتم عزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لمراقبة الفسفرة من أي البروتين الأخرى التي يمكن التعبير عنها في الخلايا وعزلها مناعي.

Introduction

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs متعددة المجالات التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة. كل من البروتينات ترميز سلسلة GTPase أقرب إلى الأسرة من رأس GTPases (رأس من البروتينات المعقدة، أو ROC) فضلا عن C-محطة المجال ROC (مجلس النواب) وتصنيفها على نحو فعال على حد سواء البروتينات للبروتين الأسرة ROCO 5،6. N-محطة من جنبا إلى جنب مجال ROC-النواب، سواء البروتينات ترميز تكرار المجال يسين الغنية فضلا عن المجال مثل ankyrin، في حين LRRK2 فقط يشفر المدرع اضافية domein 6-8. C-محطة من ROC-النواب، سواء البروتينات مشاركة سيرين ثريونين كيناز-المجال أثناء LRRK2 فقط بترميز مجال WD40 في المنطقة C-محطة 8. أدوار الخلوية الدقيقة للLRRK1 وLRRK2 لم يتم بعد توضيح، ولكن LRRK1 وقد تورط في التيروزين كيناز مستقبلات إشارات 1،2، في حين تشير الأدلة الوراثية إلى دور للLRRK2 في التسبب في مرض باركنسون 3،4.

الطبقة = "jove_content"> والفسفرة من البروتينات هو آلية تنظيمية مشتركة في الخلايا. على سبيل المثال، يمكن أن الفسفرة من الضروري لتفعيل الانزيمات أو لتوظيف البروتينات إلى مجمع الإشارة. الفسفرة الخلوية من LRRK2 تميزت على نطاق واسع وأظهرت الخرائط phosphosite غالبية مواقع الفسفرة الخلوية أن تحدث في كتلة بين تكرار ankyrin ويسين تكرار المجالات الغنية 9-11. على الرغم من LRRK1 مواقع الفسفرة الخلوية لديها حتى الآن ليتم تعيينها، أدلة من الدراسات باستخدام بروتين فسفوري؛ فسوبروتين تلطيخ البقع من immunoprecipitated البروتين LRRK1 من خلايا COS7 تشير إلى أن البروتين هو LRRK1 فسفرته في الخلايا 12.

تقدم هذه الورقة بروتوكول الأساسية لمعايرة مستوى الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في خطوط الخلايا باستخدام وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية. الاستراتيجية الشاملة واضح ومباشر. تقارب الموسومة LRRK المتواجدوأعرب الإضافية في الخلايا HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد ساعات قليلة فقط من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات وصفت بذلك بالإشعاع. ثم يتم استخدام العلامة تقارب (3xflag) لعزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول المشعة 32 ف المسمى الفوسفاتية لمتابعة الفسفرة الخلوية من LRRK2. من المهم أن نضع في الاعتبار أن جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية ينبغي أن يقوم باستخدام تدابير وقائية مناسبة للحد من التعرض للإشعاع المشعة للمشغل والبيئة. المركبات التي تحتوي على النظائر التي تنبعث منها الإشعاعات المؤينة يمكن أن تكون ضارة على صحة الإنسان والترخيص واللوائح الصارمة في عنصر تحكم المؤسسي والوطني مستوى استخدامها. وأجريت التجارب في هذا البروتوكول في أعقاب التدريب على استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر في الجامعة الكاثوليكية في لوفين (KU لوفين) وتمشيا مع المبادئ التوجيهية الممارسة المخبرية الجيدة التي تقدمها وزارة الصحة والسلامة والبيئة في الجامعة. وينتشر العديد من الخطوات في بروتوكول لدينا على نطاق واسع مثل زراعة الخلايا، SDS-PAGE، النشاف الغربية وتعطى هنا تفاصيل البروتوكول كما هو مطبق في مختبرنا. كانت لياليالجدير بالذكر أن hould معها ظروف تجريبية دقيقة تختلف من مختبر الى مختبر، وينبغي بالتالي أن تتكيف تدابير محددة لضمان التعامل السليم مع المواد المشعة إلى كل إعداد مختبر جديد.

استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر يخضع لموافقة الجهات الرقابية المسبقة والهيئة التنظيمية المسؤولة عن الإشعاع المصدر المفتوح في البحوث المختبرية يختلف من بلد إلى آخر. يجب على المستخدمين استشارة المؤسسية ضابط السلامة من الإشعاع الخاصة بهم من أجل ضمان أن تكون إجراءات تتوافق مع القواعد واللوائح المحلية. معلومات عن الهيئات التنظيمية يمكن العثور: في بلجيكا، والوكالة الاتحادية للرقابة النووية ( http://www.fanc.fgov.be ، موقع باللغة الفرنسية أو الهولندية)، في المملكة المتحدة، والصحة والسلامة بالمملكة المتحدة ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / الإشعاع / المؤينة / index.htm ملاحظات )، في الولايات المتحدة للمجلس التوحيد الوطنىاللجنة التنظيمية لير ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html )، في كندا لجنة السلامة النووية الكندية ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ )، و في ألمانيا داس الاتحادي للFÜR Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). ولوحظ وجود احتياطات السلامة ذات الصلة لهذا البروتوكول في النص، وأبرزت مع رمز البرسيم المشعة ( راد الرمز ).

1. وصفها التمثيل الغذائي للخلايا

  1. إعداد الخلايا لوصفها.
    1. خطوط الخلايا الثقافة HEK293T وفقا لظروف ثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) في DMEM مع 8٪ مصل العجل الجنين والجنتاميسين.
    2. توسيع الخلايا بما فيه الكفاية لالحصول على ما لا يقل عن 1 × 10 6 خلايا لكل عينة لاختبار.
    3. يعرض للتريبسين الخلايا وخروج الى لوحة 6 لوحات جيدة (35 مم) في 10 6 خلية / جيدا.
    4. 24 ساعة بعد الطلاء خارج الخلايا، والتعبير عن بروتين 3xflag-LRRK2 عبر ترنسفكأيشن أو ناقلات lentiviral بوساطة تنبيغ.
      1. لترنسفكأيشن، مزيج لكل عينة 4 ميكروغرام الحمض النووي (pCHMWS-3xflag LRRK2 البلازميد 13-15 أو pCHMWS-3xflag LRRK1 البلازميد 15) و 8 ميكرولتر من polyethyleneimine الخطية (PEI الخطية، 1 ملغ / مل) في 80 ميكرولتر DMEM (بدون إضافات ). السماح لمجمع ل15-30 دقيقة ثم تضاف إلى الخلايا المعقدة عن طريق خلط جيدا في الوقت الحاضر المتوسطة.
      2. لناقلات lentiviral بوساطة تنبيغ، وتمييع lentiviral ناقلات ترميز 3xflag-LRRK1 أو -2 (LV-3xflag-LRRK1، LV-3xflag-LRRK2، وكقاعدة عامة من الإبهام، كما تنبيغ مع العديد من وحدات transducing مرتين، أي عدد جزيئات النواقل وظيفية، من lentivector كما أن هناك خلايا) في ثقافة المتوسط. وصف المنتج وقد سبق وصفها أيون من LV-3xflag-LRRK1 / 2 15.
    5. عندما الخلايا هي 80-100٪ متموجة (حوالي 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن أو تنبيغ)، وشطف الخلايا مع prewarmed (37 درجة مئوية) DMEM دون الفوسفات.
  2. خلايا التسمية مع 32-P-أورثو فوسفات.
    1. نأخذ في الاعتبار المبادئ العامة للسلامة عند العمل مع الإشعاع.
      1. راد الرمز أداء جميع العمليات مع 32 P في منطقة الإشعاع المعينة.
      2. راد الرمز يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة - بموجب إجراءات التشغيل القياسية في مختبرنا وتشمل هذه معطف المختبر، والقفازات ونظارات واقية مزدوجة.
      3. ز "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> كل عمل مع 32 P يجب أن تكون محمية من المستخدمين عن طريق شاشات 6 مم البرسبيكس لتقليل التعرض.
      4. راد الرمز وينبغي دائما أجهزة الرصد الشخصية استخدامها - ضمن KUL كل شهادة المستخدم الإشعاع مفتوحة المصدر يرتدي شارة الفيلم تعلق على الجيب الأمامي للصدر من معطف المختبر لمراقبة التعرض للإشعاع أثناء التجارب.
      5. راد الرمز ينبغي تقييم جميع الأسطح تجريبية لالإشعاعي قبل وبعد الاستعمال مع عداد جيجر.
      6. راد الرمز يجب التخلص من جميع المواد الاستهلاكية يحتمل أن تكون ملوثة من في الالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية المؤسسية لراالتخلص من النفايات dioactive.
    2. تحت تدفق الصفحي، وإعداد أنبوب فالكون مع 2.1 مل من DMEM دون الفوسفات (prewarmed إلى 37 درجة مئوية) في لوحة 6 جيدا من الخلايا لالتسمية.
      1. على سبيل المثال، إلى خلايا التسمية في جميع الآبار من لوحة 6 جيدا، وإعداد 12.6 مل المتوسطة (= 6 × 2.1). هذا هو لتوفير 2 مل المتوسطة لاستخدامها في 6 جيدا لوحة جيدا من الخلايا الزائدة مع 5٪ من حيث الحجم.
    3. راد الرمز إعداد مقاعد البدلاء التي سيتم تنفيذ التجارب مع الإشعاعات المؤينة. يتم تغطية مساحة العمل التي حصيرة التسرب الذي تقوم عليه يتم وضع بطانة واقية من مادة ماصة. في حال كنت تستخدم بطانة مع سطح ماء واحد، وضعه مع الجانب ماصة تصل.
    4. راد الرمز توفر أيضا لجرة البرسبيكس على مساحة العمل ووضع أنبوب من الفوسفات المتوسطة حرة في ذلك.
    5. راد الرمز اتخاذ الحاوية اصطف الرصاص مع القارورة من 32 الفوسفاتية P المسمى من الثلاجة وجعله على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي. مراقبة الحاويات عن التلوث الإشعاعي الخارجي باستخدام عداد جيجر.
    6. راد الرمز تمييع 32 P المسمى الفوسفاتية في أنبوب من DMEM دون الفوسفات بتركيز 24 μCi / مل.
      1. ملاحظة: في 2 مل لكل لوحة 6 جيدا جيدا من الخلايا، وهذا يتوافق مع 5 μCi 32 P المسمى الفوسفاتية / سم 2 من الخلايا المستزرعة.
      2. راد الرمز احتفظأنبوب في جرة البرسبيكس.
    7. راد الرمز إغلاق الحاوية مع ما تبقى من 32 ف المسمى الفوسفاتية واستبدال في الثلاجة.
    8. راد الرمز إزالة 6 لوحات جيدة مع الخلايا ليكون المسمى من الحاضنة ومكان على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي.
    9. راد الرمز إزالة طاف المتوسطة وتجاهل. إضافة 2 مل من المتوسط ​​خالية من الفوسفات التي تحتوي على 32 P المسمى الفوسفاتية / جيد.
    10. راد الرمز وضع لوحات الثقافة في مربع البرسبيكس ثم مراقبة الحاويات FOص التلوث الإشعاعي الخارجي باستخدام عداد جيجر.
    11. راد الرمز نقل مربع البرسبيكس مع الخلايا إلى حاضنة خلية حقيقية النواة مخصص لوضع العلامات الأيضية النظائر.
    12. راد الرمز احتضان لمدة 1-20 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
      1. بشكل عام، ينصح الوقت إدماج 3 ساعة أو أكثر. يمكن تقييم فترة حضانة الأمثل من خلال التجارب بالطبع الوقت لكل بروتين معين كما تريد.
    13. راد الرمز اختياري: علاج الخلايا مع المجمع.
      1. في التجارب مع العلاج المركب (مثل مثبط كيناز)، يتم تضمين خطوة العلاج المركب بعد فيitial فترة حضانة دون مركب للسماح لوضع العلامات. بعد فترة حضانة المطلوب، يتم إزالة مربع البرسبيكس تحتوي على لوحات ثقافة من الحاضنة وتقديمهم إلى مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي.
      2. راد الرمز تتم إزالة وسم المتوسطة والاستعاضة عنها prewarmed المتوسطة حرة الفوسفات الذي يتم تخفيفه المجمع في التركيز المطلوب. تجاهل المتوسطة في أنبوب 50 مل لجمع النفايات التي يتم وضعها في جرة البرسبيكس.
      3. راد الرمز يتم استبدال الخلايا في مربع البرسبيكس وضعها في حاضنة الخلية للمرة الاسم المطلوب.
  3. راد الرمز جمع لست] من ابيخلايا بقيادة الولايات المتحدة.
    1. راد الرمز إزالة متوسطة من الخلايا وتجاهل في أنبوب جمع النفايات التي يتم وضعها في جرة البرسبيكس.
    2. راد الرمز شطف الخلايا 2X مع الثلج الباردة TBS (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 2 مل / شطف)، ونبذ الحل شطف في أنبوب جمع النفايات وضعت في جرة البرسبيكس.
    3. راد الرمز إضافة 0.5 مل من الجليد الباردة مناعي (IP) تحلل العازلة إلى كل بئر وجمع المحللة من قبل pipetting المحللة صعودا وهبوطا من أجل تخفيف جميع الخلايا هي lysed.
      1. إعداد حجم المطلوب من IP تحلل العازلة (0.5 مل / عينة بالإضافة إلى 5٪ الزائدة) في وقت مبكر، مضيفا كوكتيل البروتياز المانع والفوسفاتيزالمانع الكوكتيل الطازجة فقط قبل الاستخدام.
      2. تكوين تحلل العازلة هو 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، تريتون 1٪، الجلسرين 10٪، مثبط البروتياز الكوكتيل والفوسفاتيز المانع كوكتيل.
    4. راد الرمز نقل المحللة إلى أنبوب microcentrifuge واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    5. راد الرمز الطرد المركزي لست] في microcentrifuge في> 5،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    6. راد الرمز التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.

2. تحليل وصفها من البروتينات الهامة

  1. راد الرمز عزل بروتين من الفائدة بمقدار immunopurification (IP).
    1. راد الرمز نقل أنابيب microcentrifuge مع بالطرد المركزي لست] إلى الجليد وماصة طاف في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 10 ميكرولتر حجم سرير من معايرتها الخرز الاغاروز العلم-M2.
      1. إعداد أنابيب مع العلم معايرتها-M2 الخرز الاغاروز في وقت مبكر.
      2. لهذا، ماصة وبلغ حجم التداول العلم-M2 الطين الاغاروز الموافق 10 ميكرولتر حجم سرير لكل عينة، بالإضافة إلى فائض بنسبة 5٪.
        1. عموما، حجم السرير 10 ميكرولتر من الخرز يتوافق مع 20 ميكرولتر الطين. الرجوع إلى ورقة بيانات المنتج لمزيد من التفاصيل.
      3. تتوازن حبات من قبل الشطف 3X في 10 مجلدات (نسبة إلى حجم السرير) من تحلل العازلة IP.
      4. توزيع حبات معايرتها بالتساوي في 10 ميكرولتر حجم السرير / أنبوب في العديد من الأنابيب كما أن هناك عينات. تسمية أنابيب مع معرف لكل عينة.
    2. راد الرمز نقل أنابيب microcentrifuge إلى 50 مل أنابيب (حوالي 6 ميكروسنتريفوج tubes/50 أنبوب مل) المسمى مع رمز البرسيم المشعة والحفاظ على الجليد.
    3. راد الرمز عينات نقل إلى جهاز الدوران وراء درع البرسبيكس في مجال معين من غرفة باردة لأكثر من نهاية نهاية الاختلاط في 4 درجات مئوية لمدة 1-20 ساعة.
    4. راد الرمز نقل العينات إلى مساحة العمل المعينة على الجليد.
    5. 50523rad1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> تدور باستمرار البروتين ملزمة الخرز الاغاروز-M2 العلم في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في أنبوب جمع النفايات.
    6. راد الرمز غسل البروتين ملزمة العلم-M2 الخرز الاغاروز عن طريق إعادة التعليق في 1 غسل العازلة مل IP.
      1. تكوين غسل العازلة IP: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم 400 ملم، تريتون 1٪. فمن المستحسن أن تشمل أيضا البروتيني والفوسفاتيز مثبطات في غسل العازلة للبروتينات حساسة للتدهور من قبل البروتياز شارك في تنقية أو لنزع الفسفات بواسطة phosphatases شارك في تنقية.
      2. راد الرمز تدور باستمرار البروتين ملزمة العلم-M2 الخرز الاغاروز في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في جامعي النفاياتنشوئها الأنبوب.
      3. راد الرمز كرر الخطوة غسل 3X.
    7. راد الرمز بعد يغسل، resuspend والخرز في 1 مل IP شطف العازلة (تريس 25 ملم ودرجة الحموضة 7.5، MgCl 2 10 ملي، dithiothreitol (DTT) 2 مم، 0.02٪ تريتون، بيتا جليسروفوسفات 5 ملم، نا 3 VO 4 0.1 ملم).
    8. راد الرمز تدور باستمرار البروتين ملزمة الخرز الاغاروز-M2 العلم في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في أنبوب جمع النفايات. إزالة كافة العازلة الزائدة.
    9. راد الرمز Resuspend الخرز في 40 م وش، ل IP من عينة العازلة SDS التحميل (تريس، حمض الهيدروكلوريك 160 ملم ودرجة الحموضة 6.8، SDS 2٪، 0.2 M DTT، الجلسرين 40٪، برموفينول الأزرق 2 ملغ / مل).
      1. ويمكن تحليل عينات مباشرة أو تخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية لتحليل خفية.
        1. راد الرمز لتخزين العينات في -20 درجة مئوية، ومكان العينات في أصحاب أنبوب أو مربعات في مربع البرسبيكس في الفريزر رمزا البرسيم المشعة وصفت مخصصة لتخزين العينات المشعة.
    10. راد الرمز التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.
  2. راد الرمز لحل عينات IP عبر SDS-PAGE وBLOر إلى غشاء PVDF.
    1. راد الرمز عينات الحرارة في المخزن التحميل إلى 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في> 1،000 x ج لتكوير الخرز.
    2. راد الرمز تحضير هلام بروتين حدة الكهربائي على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي وراء حجاب البرسبيكس.
    3. راد الرمز عينات تحميل الصعود إلى 3-8٪ خلات تريس المواد الهلامية SDS-PAGE.
      1. يناسب هذا النوع من الجل لحسم عالية الوزن الجزيئي (HMW) البروتينات. ويمكن أيضا أن تكون مناسبة أنواع الجل أخرى، مثل 4-20٪ مكرر Tricine هلام أو تريس، جليكاين 4-20٪ المواد الهلامية.
      2. وتشمل علامة الوزن الجزيئي الذي هو مناسبة لتبين أحجام البروتينات HMW.
    4. <لى> راد الرمز أداء الكهربائي عند 150 V لمدة 1 ساعة.
    5. راد الرمز بعد الكهربائي، إزالة هلام من غلاف من البلاستيك ونقل الجل إلى حاوية مع ويسترن العازلة نقل النشاف.
      1. تكوين الغربية العازلة نقل النشاف: 50 ملي تريس، جليكاين 40 ملم، 0.04٪ SDS، الميثانول 20٪.
      2. راد الرمز قطع أجزاء من الهلام التي يلتزم بها مثل الفواصل جيدا والجزء السفلي من هلام التي تتمسك بها.
    6. إعداد واحد فلوريد البولي فينيل (PVDF) الغشاء في هلام عن طريق غمس في الميثانول لمدة 1 دقيقة، ثم وضع في المخزن نقل.
      1. يتم قطع الأغشية إلى ليالي حجم AME مثل هلام زائد هامش 3 مم.
    7. وضع وحدة النشاف شبه الجافة على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي وإزالة الغطاء العلوي من لوحة والقطب.
    8. راد الرمز إعداد شطيرة النشاف على سطح وحدة النشاف شبه الجافة.
      1. الرطب اضافية سميكة (2.5 مم، 7.5 × 10 سم كبيرة) مرشح النشاف في المخزن نقل ووضعت على لوحة أسفل وحدة النشاف.
      2. راد الرمز وضع غشاء PVDF ما قبل الرطب على مرشح النشاف.
      3. راد الرمز وضع بعناية الجل على الغشاء PVDF وإزالة أي فقاعات الهواء.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> أكمل شطيرة صمة عار اضافية عن طريق تبليل عامل تصفية النشاف سميكة عازلة في نقل ومكان على لوحة أسفل وحدة النشاف. إزالة كل الهواء فقاعات الحالية في نهاية المطاف في شطيرة النشاف.
        يرجى ملاحظة أن الوصف الوارد هنا هو متوافق مع BIORAD عبر صمة عار نظام SD حيث الأقطاب الكهربائية هي تلك التي البروتينات تهاجر نحو الأسفل على الغشاء. نظم النشاف الأخرى هي أيضا متوافقة مع هذه الخطوات مع تعديلات طفيفة مثل تلك المطلوبة في نهاية المطاف إلى أن تأخذ في الاعتبار اتجاه آخر النشاف، أو في حالة النشاف دبابات، والنفايات السائلة اضافية ليتم التخلص منها في نفس الطريقة كما العازلة الكهربائي أعلاه.
    9. راد الرمز إزالة كافة العازلة الزائدة مع الأنسجة ماصة ووضع لوحة أعلى وغطاء شبه د راي النشاف وحدة.
    10. راد الرمز نقل البروتينات في 15 V لمدة 1-2 ساعة.
    11. راد الرمز خلال هذا الوقت، وتنظيف وحدة الكهربائي.
      1. راد الرمز التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.
      2. راد الرمز شطف وحدة الكهربائي مع الماء المقطر (AD) وتجاهل ماء الشطف في حاوية النفايات المشعة السائلة.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> بعد نقل، وإزالة الغشاء PVDF مع البروتينات نشف من وحدة النشاف.
    13. راد الرمز اختياري: إجراء تلطيخ الشقائقية S من البروتينات نشف لتصور البروتينات.
      1. راد الرمز نقل وصمة عار لسفينة الحضانة وصمة عار الضحلة التي تحتوي على الشقائقية S حل واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. راد الرمز شطف 2X بسرعة في م.
    14. راد الرمز يجف الغشاء.
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> إجراء تصوير الإشعاع الذاتي.
    1. راد الرمز تعرض الغشاء إلى لوحة تفسفر لمدة 1-5 أيام.
    2. راد الرمز قراءة 32P الخروج من لوحة تفسفر يتعرض باستخدام العاصفة 840 تفسفر الماسح الضوئي أو ما يعادلها وحفظ الصورة باعتبارها عالية الدقة شجار.
  4. راد الرمز الكشف عن مستويات البروتين عبر مناعي.
    1. راد الرمز ترطيب الأغشية عن طريق غمس منهم لفترة وجيزة في الميثانول، ثم نقل إلى الضحلة وصمة عار سفينة الحضانة مع برنامج تلفزيوني. راد الرمز منع الأغشية في برنامج تلفزيوني-T (PBS مع 0.1٪ تريتون) التي تحتوي على الحليب 5٪.
    2. راد الرمز احتضان البقع مع المضادة للLRRK2 الأجسام المضادة أو مكافحة 13،16 الضد العلم وعملية أخرى مع الخطوات المناسبة وغسل الحضانة الضد الثانوية.
    3. راد الرمز تنفيذ الكشف لمعان كيميائي للتأكد من مستويات البروتين النسبية LRRK2.
  5. تحديد إدماج 32 P في LRRK2.
    1. إجراء تحليل الكثافة من العصابات على autoradiograms وصمة عار وتفاعلية مناعية باستخدام البرمجيات المناسبة مثل يماغيج البرمجيات، وبرنامج مجاني متوفر على Instit الوطنية[أوتس الصحة الانترنت ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. حساب مستويات التأسيس الفوسفات كما أن نسبة إشارة autoradiographic على مستوى مناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل مقارنة مستويات الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في الخلايا، الموسومة 3xflag LRRK1 وأعرب عن LRRK2 في الخلايا HEK293T 15. كانت الخلايا المستزرعة في 6 لوحات جيدة والمسمى مع 32 P وتحليلها كما هو موضح أعلاه في نص البروتوكول. الشكل 1 يبين نتائج ممثلة لوضع العلامات الأيضية من LRRK1 وLRRK2 في الخلايا HEK293T. لوحظ إدراج الفوسفات المشعة لكلا LRRK1 وLRRK2. على القياس الكمي لمستويات 32 P تطبيع مستويات البروتين مقاسا تحليل الكثافة من مناعي مع العلم المضادة للأجسام المضادة، وجدنا أن LRRK1 كان متوسط ​​مستوى الفسفرة التي هي أقل من LRRK2 في ظل ظروف اختبار، على الرغم من أهمية الإحصائية لم تصل (P> 0.05).

1.JPG "/>
الشكل 1. وضع العلامات الأيضية لLRRK1 وLRRK2. أعرب A. LRRK1 وLRRK2 في الخلايا HEK293T وصفت عملية الأيض مع 32 P كما هو موضح في البروتوكول والنتائج أقسام. يصور هنا autoradiograms ممثل (اللوحة العليا) من 32 P التأسيس فضلا عن البقع الغربية ممثل (اللوحة السفلى) من LRRK1 وكشف LRRK2 عبر به 3xflag بهم. B. الكمي من وضع العلامات الأيضية النسبية للLRRK1 وLRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه الورقة بروتوكول الأساسية لمعايرة مستوى الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في خطوط الخلايا باستخدام وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية. الاستراتيجية الشاملة واضح ومباشر. الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد ساعات قليلة فقط من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات وصفت بذلك بالإشعاع. ثم يتم استخدام العلامة تقارب (3xflag) لعزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع. هذا البروتوكول هو لتمييزها عن بروتوكول الاتحاد الافريقي لقياس LRRK2يتم تنفيذ tophosphorylation 17 في أن وسم أو LRRK1 LRRK2 في الثقافة الخلية بدلا من في المختبر في رد فعل الفسفرة مع البروتينات المنقى.

تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول مفصلة المقدمة هنا يمكن تعديلها لاستيعاب لاختلافات متعددة، تبعا للاحتياجات التجريبية. على سبيل المثال، كما هو وضع العلامات كفاءة في معظم خطوط الخلايا مختبر مشتركة، لا يقتصر هذا البروتوكول لاستخدام خط الخلية HEK293T. أيضا، قد يتم استخدام علامات تقارب أخرى كبديل لل3xflag، مثل HA، MYC، 18 به كما متعددة يمكن استخدامها V5، GFP أو علامات أخرى لLRRK1 immunoprecipitate بكفاءة أو LRRK2. في حالة الأجسام المضادة بروتين محدد متاح للبروتين التي تناسب مناعي، كما هو الحال بالنسبة لLRRK2 11، وهذا يمكن أن تنفذ أيضا. مع البروتين محددة الأجسام المضادة مناعي الصف، بل هو أيضا من المجدي وضع العلامات الأيضية من أداء LRRKالبروتينات أعرب التطور الطبيعي في خطوط الخلايا. في حالة LRRK2، وقد وصفت العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والتي يمكن أن مناعي من LRRK2 الذاتية 19. أخيرا، وبروتوكول وضع العلامات الأيضية، وصفت هنا لLRRK1 وLRRK2 يمكن أيضا أن تتكيف مع أي البروتين الأخرى التي يمكن immunoprecipitated من خطوط الخلايا باستخدام الاستراتيجية العامة المذكورة أعلاه.

من الاعتبارات الرئيسية قبل إجراء وضع العلامات الأيضية من البروتينات في خلية ثقافة هو كيف يقارن هذا الأسلوب إلى أساليب أخرى متاحة لتحديد الخلوية البروتين الفسفرة. على سبيل المثال، الفسفرة في مواقع محددة يمكن رصدها من قبل immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة الفوسفات محددة. هذا الأسلوب يتبع خطوات مماثلة لتلك التي وصفها هنا، باستثناء الخطوات وضع العلامات النظائر، ولهذا السبب، غالبا ما فضل هذه التقنية على وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية عندما كان متوفرا. وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية يوفر إشارة الذي هو ممثل الدولة الفسفرة الشاملة من البروتين، وبالتالي فإنه لا يمكن تقديم معلومات عن الفسفرة من مواقع محددة. لبروتينات مع مواقع الفسفرة متعددة، كما هو الحال بالنسبة لLRRK2 10،11، توفر تقنية وضع العلامات الأيضية تقييم من خطوة واحدة على مستوى الفسفرة الشاملة التي يمكن التأكد من الفوسفات مع الأجسام المضادة المحددة في انتظار خطوات فقط مناعي متعددة. على سبيل المثال، LRRK2 هو فسفرته للغاية في المنطقة بين المجالات ANK-LRR به، أي المواقع S910/S935/S955/S973 11،20 وكذلك في مناطق أخرى 10 بما في ذلك موقع S1292 تتميز مؤخرا 21. من أجل تشريح أدوار phosphosites الفردية، فمن المستحسن أن تفضل التجارب مع الأجسام المضادة المحددة phosphosite. على سبيل المثال phosphosite سمحت الأجسام المضادة المحددة لتبين أن phosphosites S910/S935/S955/S973 هي dephosphorylateد في عدة طفرات المسببة للأمراض مثل R1441C / G، Y1699C، I2020T، ولكن ليس في G2019S 11،22، في حين أشكال متحولة المرض LRRK2 تظهر عموما أعلى مستويات الفوسفات-S1292 21. ومع ذلك، ووضع العلامات الأيضية هي مفيدة لعدد من الدراسات الأخرى من الفسفرة الخلوية. وضع العلامات الأيضية هو دائما تقنية قابلة للتطبيق على سبيل المثال في حالات الفسفرة مواقع مجهولة، أو عندما الفوسفات الأجسام المضادة ليست متاحة أو حساسية منخفضة. أخيرا، ووضع العلامات الأيضية يسمح بمقارنة مستويات الفسفرة العام للبروتينات مختلفة (كما هو موضح هنا مقارنة مستويات الفسفرة الخلوية من LRRK1 وLRRK2، الرقم 1)، مقارنة الذي يمثل تحديا للقيام مع الأجسام المضادة phosphosite محددة نظرا الاختلافات في حساسية من الضد إلى أخرى .

في الختام، هذا البروتوكول يتيح تقييم كفاءة من مستويات الفسفرة العام للبروتينات في الخلايا LRRK. يمكن بسهولة أن تتكيف مع بروتوكول مراقبةالفسفرة من أي البروتين الأخرى التي يمكن التعبير عنها في الخلايا وعزلها مناعي. فمن المستحسن استخدام هذا البروتوكول عندما الأجسام المضادة phosphosite محددة لا تتوفر للبروتين في الدراسة أو كخطوة في التحقق من صحة بهم. هذا البروتوكول هو مفيد خصوصا عندما يكون الهدف هو مقارنة تجريبية الفسفرة العام لل2 أو أكثر من البروتينات المختلفة ومثل هذه المقارنات عبر وضع العلامات الأيضية ليست منحازة الاختلافات في حساسية الكشف عن الفسفرة من البروتين واحد إلى آخر. خصيصا لLRRK1 وLRRK2، هذه التقنية يمكن استخدامها لمراقبة النشاط نسبيا التغييرات التي تعتمد في الفسفرة من LRRK1 وLRRK2، بالنظر إلى أن هذه التغييرات قد بدأت في وصفها لLRRK2 11،13،23، بينما يفهم LRRK1 تنظيم الفسفرة سيئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونحن ممتنون أيضا لمؤسسة فوكس J. مايكل دعم هذه الدراسة. نشكر مؤسسة أبحاث - فلاندرز FWO (مشروع FWO G.0666.09، وكبار الزمالة الباحث إلى فريق الرصد المشترك)، وIWT SBO/80020 المشروع العصبية الهدف، وجامعة لوفين الكاثوليكية (OT/08/052A وIOF-KP/07 / 001) لدعمهم. وأيد هذا البحث أيضا في جزء من صندوق Druwé-Eerdekens تدار من قبل مؤسسة الملك بودوان لفريق الرصد المشترك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430, (910), 405-413 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics