ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

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Summary

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2(LRRK1およびLRRK2)は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。

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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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Abstract

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2(LRRK1およびLRRK2)は、セリン - スレオニンキナーゼドメイン、複合タンパク質ドメインのラス(ROC)、ROCドメイン(COR)のC-末端を含め、同様のドメイン構成を共有パラログであるおよびロイシンリッチとN末端にアンキリン様​​リピート。 LRRK2は、パーキンソン病3,4の病因に関与している間LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1は、1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関与しているまだ解明されてきた。本稿では、それによって細胞におけるこれら2タンパク質の全体的なリン酸化レベルを測定する手段を提供し、32 Pオルトリンを持つ細胞にLRRK1とLRRK2タンパク質を標識するためのプロトコルを提示する。簡潔には、親和性はLRRKタ ​​ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンはわずか後の細胞に同化されているインキュベーション時間およびリン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグを介して(3XFLAG)LRRKタンパク質は免疫沈降により、他の細胞成分から単離される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー(32 P信号)およびウエスタン検出(タンパク質シグナル)によって行われる。プロトコルは、容易に細胞内で発現され、免疫沈降によって単離することができる任意の他のタンパク質のリン酸化を監視するように適合させることができる。

Introduction

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2(LRRK1およびLRRK2)は、同様のドメイン構成を共有するマルチドメインパラログである。両タンパク質は、効果的ROCOタンパク質ファミリー5,6に両方のタンパク質を分類、分子量GTPase(複合体タンパク質のRasは、またはROC)のRasファミリーだけでなく、ROCドメイン(COR)のC末端に似アーゼ配列をコードする。 ROC-CORドメインタンデムのN末端 ​​のみLRRK2は、余分なアルマジロdomein 6-8をコードしている間、両 ​​方のタンパク質は、ロイシンリッチリピートドメインだけでなく、アンキリン様ドメインをコードする。 ROC-CORのC末端のみLRRK2がC末端領域8のWD40ドメインをコードしながら、両方のタンパク質は、セリン-トレオニンキナーゼドメインを共有する。 LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1 1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関係している、解明されていたが、パーキンソン病の3,4の病因にLRRK2の役割への遺伝的証拠を指しています。

9月11日で発生する細胞のリン酸化部位の大部分を示している。 LRRK1細胞のリン酸化部位をマッピングするには至っていないものの、COS7細胞から免疫沈降LRRK1タンパク質のブロットのリンタンパク質染色を用いた研究からの証拠は、LRRK1タンパク質が細胞12内のリン酸化されていることを示唆している。

本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRK proteタグインは、32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現される。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に同化され、リン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグ(3XFLAG)を次に免疫沈降によって他の細胞成分からLRRKタンパク質を単離するために使用される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー(32 P信号)およびウエスタン検出(タンパク質シグナル)によって行われる。

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Protocol

この議定書は、LRRK2の細胞のリン酸化に従うことを放射性32 P標識オルトリンを使用しています。これは、放射性の試薬ですべての操作は、オペレータおよび環境への放射性放射線の被ばくを最小限にするために、適切な保護措置を使用して実行する必要があることを念頭に置くことが重要です。電離放射線は、制度的、国家レベルで人の健康と厳格なライセンスおよび規制に害を及ぼす可能性が発する同位元素を含む化合物は、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、カトリック大学ルーベン(KUルーベン)でのオープンソースの放射線使用中の訓練に従い、大学の健康、安全、環境部門が提供する優れた実験室での実践ガイドラインに従って実施した。我々のプロトコルのいくつかのステップが広く、細胞培養、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングとして展開され、ここで与えられている私たちの研究室で適用されるプロトコルの詳細です。それは、Shouldは、正確な実験条件は、実験室からの研究室ごとに異なる​​ことに注意されているため、放射性物質の適正な取扱いを確保するための具体的な対策は、それぞれの新しい実験室環境に適合させる必要があります。

オープンソースの放射線の使用は、従来、規制当局の承認の対象であり、実験室での研究におけるオープンソースの放射線を担当する規制機関は国によって異なります。ユーザーは、そのプロシージャがローカルルールや規制に準拠していることを確認するために、その制度上の放射線安全管理者に相談してください。規制機関に関する情報が記載されています。ベルギーで、原子力制御用、連邦局( http://www.fanc.fgov.beフランス語やオランダ語で、ウェブサイト)、イギリスでは、健康と安全エグゼクティブ( HTTP: / / www.hse.gov.uk /放射線/イオン/ index.htmを )、米国でのNucリア規制委員会( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html )、カナダのカナダ原子力安全委員会( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ )、およびドイツダスBundesamtエリーゼStrahlenschutz中( http://www.bfs.de/de/bfs )。このプロトコルに関連する安全上の注意は、テキストに記載されているが、(放射性三つ葉マークで強調RADシンボル )。

1。細胞の代謝標識

  1. 標識に細胞を準備します。
    1. 培養HEK293T細胞株を8%ウシ胎児血清及びゲンタマイシンを含むDMEM中で標準の培養条件(37℃、5%CO 2)に記載の方法。
    2. 十分に細胞を拡大テストするためのサンプルあたり少なくとも1×10 6個の細胞を得る。
    3. 細胞をトリプシン処理し、十分に10 6細胞/ 6ウェルプレート(直径35mm)にプレートアウト。
    4. 24時間後、細胞をプレーティングした後、トランスフェクションまたはレンチウイルスベクター媒介形質導入を通じて3XFLAG-LRRK2タンパク質を発現する。
      1. トランスフェクションのために、追加することなく、(サンプル4μgのDNAを(pCHMWS-3XFLAG-LRRK2プラスミド13〜15またはpCHMWS-3XFLAG-LRRK1プラスミド15)と80μlのDMEM中にリニアポリエチレン(直鎖PEI、1 mg / ml)を、8μLあたりミックス)。 15〜30分間、複雑にできるようにして存在する媒体にうまく混合することにより、細胞へのコンプレックスを追加します。
      2. レンチウイルスベクター媒介形質導入のために、レンチウイルスベクターのエンコーディング3XFLAG-LRRK1を希釈または-2(LV-3XFLAG-LRRK1、LV-3XFLAG-LRRK2は、経験則として、倍の数の変換ユニットと伝達する、機能的なベクター粒子のすなわち数、レンチベクターの培養培地への細胞)が存在するように製品の説明 LV-3XFLAG-LRRK1 / 2のイオン15は、以前に記載されいる。
    5. 細胞が80%〜100%コンフルエント(トランスフェクションまたは形質導入後約48時間)である場合には、リン酸塩ずに温めておいた(37℃)DMEMで細胞を洗浄してください。
  2. 32 P-オルト-リン酸とラベル細胞。
    1. 放射線を扱う際の安全性の心の一般的な原則に留めておく。
      1. RADシンボル指定された放射領域に32 Pですべての操作を実行します。
      2. RADシンボル適切な個人用保護具を着用する必要があります - 私たちの研究室での標準操作手順の下で、これらは、白衣、二重手袋、保護眼鏡が含まれています。
      3. 32 PとG "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>すべての作業は、露出を最小限にするために6ミリメートルパースペックスの画面で、ユーザーからシールドする必要があります。
      4. RADシンボル個人的な監視装置が常に使用されるべきである - KUL内のすべての認定を受け、オープンソースの放射線ユーザーは、実験中に放射線被ばくを監視するために白衣の胸ポケットに装着フィルムバッジを身に着けている。
      5. RADシンボル全ての実験表面はガイガーカウンターで使用する前と後の放射能を評価​​すべきである。
      6. RADシンボルすべての汚染された可能性の消耗品は、RAのための制度的なガイドラインを厳守で処分する必要がありますdioactive廃棄物処理。
    2. 層流の下で、ラベルに細胞の6ウェルプレート当たり(37℃に予熱)リン酸塩を含まないDMEMの2.1ミリリットルでファルコンチューブを準備します。
      1. 例えば、6ウェルプレートの全てのウェル中の標識細胞に12.6 mlの培地(2.1 X = 6)を調製。これを2mlの培地体積の5%過剰の細胞の6ウェルプレートのウェルあたりに使用されるために提供することである。
    3. RADシンボル電離放射線を用いた実験が実行される時にベンチを用意します。作業スペースは、吸収性材料の保護ライナが配置される時にスピルマットで覆われている。あなたは1防水面でライナーを使用している場合には、吸収面を上にして置きます。
    4. RADシンボルまた、提供ワークスペース上のパースペックスジャー、その中にリン酸塩を含まない培地のチューブを配置します。
    5. RADシンボル冷蔵庫から32 Pラベルされたオルトリンのバイアルをリード並ぶコンテナを取り、放射能ベンチにそれを持って来る。ガイガーカウンターを使用して外部放射能汚染のための容器を監視します。
    6. RADシンボル 24μCiの/ mlの濃度でリン酸塩を含まないDMEMのチューブに32 Pラベルされたオルトリン希釈する。
      1. 注:Pは、培養細胞のオルトリン/ cm 2のラベルが付い μCiの32 5への細胞の6ウェルプレート当たり2ミリリットルで、これは対応しています。
      2. RADシンボルキープパースペックスジャーチューブ。
    7. RADシンボル 32 Pラベルされたオルトリンの残りの部分と、容器を閉じ、冷蔵庫に交換してください。
    8. RADシンボル放射能ベンチでインキュベーターと場所からの標識される細胞で6ウェルプレートを取り外します。
    9. RADシンボルメディア上清を除去し、廃棄します。 32 Pを含むリンを含まない培地の2ミリリットルを追加するだけでなく/オルトリンラベル。
    10. RADシンボルパースペックスボックスに培養プレートを配置し、コンテナFOを監視ガイガーカウンターを使用してR外部放射能汚染。
    11. RADシンボル同位体代謝標識専用の真核細胞の培養器に細胞とパースペックスボックスを転送します。
    12. RADシンボル 5%CO 2中37℃で1-20時間インキュベートする。
      1. 一般的には、3時間以上の取り込み時間が勧められる。所望に応じて最適なインキュベーション時間は、各特定のタンパク質の経時変化実験を介して評価することができる。
    13. RADシンボルオプション:化合物で細胞を処理。
      1. (例えば、キナーゼ阻害剤など)、化合物処理を用いた実験では、化合物処理工程においては、後に含まれているラベル付けを可能にする化合物を含まないitialインキュベーション時間。所望のインキュベーション時間の後、培養プレートを含むパースペックスボックスをインキュベーターから取り出し、放射能をベンチにした。
      2. RADシンボル標識培地は、化合物を所望の濃度に希釈されその中に温めておいたリン酸塩を含まない培地で取り外して交換されている。パースペックスジャーに入れている廃棄物の収集のための50mlチューブに培地を捨てる。
      3. RADシンボル細胞を、パースペックスボックス内で置換し、所望の接触時間のための細胞インキュベーター中に入れる。
  3. RADシンボルラベの溶解物を収集LEDセル。
    1. RADシンボル細胞から培地を除去し、パースペックスジャーに入れている廃棄物収集チューブに捨てる。
    2. RADシンボル細胞はパースペックスジャーに入れ廃棄物収集チューブにリンス液を廃棄し、氷冷TBS(50mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.4で、2ミリリットル/リンス)で2回すすいでください。
    3. RADシンボル各ウェルに、氷冷​​免疫沈降(IP)の溶解緩衝液0.5ミリリットルを追加し、すべて溶解した細胞を緩めるために、上下に溶解液をピペットで溶解液を収集します。
      1. プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼを添加し、事前にIP溶解緩衝液(0.5ミリリットル/試料+5%過剰)の必要量を調製使用直前に新鮮な阻害剤カクテル。
      2. 溶解緩衝液の組成は、20mMトリスpH7.5の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%トリトン、10%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテルである。
    4. RADシンボルマイクロ遠心チューブにライセートを移し、少なくとも10分間氷上でインキュベートする。
    5. RADシンボル 10分間> 5000×gで微量での溶解物を遠心分離する。
    6. RADシンボルパースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。

2。目的のタンパク質の標識を分析

  1. RADシンボル免疫精製(IP)によって目的のタンパク質を分離します。
    1. RADシンボル戻って氷を遠心分離溶解物とのマイクロチューブを転送し、平衡化FLAG-M2アガロースビーズ10μlのベッド容量を含むマイクロ遠心チューブに上清をピペットで。
      1. 事前に平衡化FLAG-M2アガロースビーズとチューブを準備します。
      2. このために、10μlのサンプルあたりのベッドボリュームプラス5%過剰に対応するフラグ-M2アガローススラリーの量をピペット。
        1. 一般的には、ビーズの10μlのベッド容量は20μlでスラリーに対応している。詳細は、製品データシートを参照してください。
      3. のIP溶解緩衝液10容(床容量に対して)で3回洗浄することによってビーズを平衡化させます。
      4. サンプルがあると同数のチューブに10μlのベッド容量/チューブに均等に平衡化したビーズを配布します。各サンプルの識別子で、チューブにラベルを付けます。
    2. RADシンボル放射性三つ葉記号で標識された50ミリリットルのチューブ(約6マイクロ遠心tubes/50 mlのチューブ)にマイクロチューブを移し、氷上に保つ。
    3. RADシンボル 1月20日時間4℃で混合末に比べ終わりのための低温室の指定領域内のパースペックスシールドの背後にある回転装置に転送するサンプル。
    4. RADシンボル氷の上で指定された作業スペースにサンプルを転送します。
    5. 50523rad1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>マイクロ遠心(1,000×gで、1分)にFLAG-M2アガロースビーズに結合したタンパク質をスピンダウンし、廃棄物収集チューブに上清を捨てる。
    6. RADシンボル 1ミリリットルのIP洗浄緩衝液中に再懸濁することによりFLAG-M2アガロースビーズに結合したタンパク質を洗浄します。
      1. IP洗浄緩衝液の組成:トリス25mMのpH7.5の400mMのNaClを、1%トリトン。また、同時精製プロテアーゼによるまたは同時精製ホスファターゼによる脱リン酸化による劣化に敏感なタンパク質のための洗浄緩衝液中のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤が含まれることをお勧めします。
      2. RADシンボル微量タンパク質結合されたFLAG-M2アガロースビーズ(1,000×gで、1分)をスピンダウンし、廃棄物のコレクション1に上澄みを捨てるTiONからチューブ。
      3. RADシンボル洗浄ステップを3回繰り返します。
    7. RADシンボル洗浄後、1ミリリットルIPリンス緩衝液(トリス25mMのpH7.5のMgCl 2を 10mMのジチオスレイトール(DTT)、2mMの、トリトン0.02%、β-グリセロリン酸、5mMの、のNa 3 VO 4、0.1mMの)中にビーズを再懸濁する。
    8. RADシンボルマイクロ遠心(1,000×gで、1分)でのタンパク質結合されたFLAG-M2アガロースビーズをスピンダウンし、廃棄物収集チューブに上清を捨てる。すべての余分なバッファを削除します。
    9. RADシンボル 40&Mへの再懸濁ビーズuは、IP試料のSDSローディングバッファーlの(トリス-HCl 160mMのpH6.8の、2%SDS、0.2 M DTT、40%グリセロール、ブロモフェノールブルー2 mg / mlで)。
      1. サンプルは直ちに分析又は不純な分析のために-20°Cの冷凍庫に保存することができる。
        1. RADシンボル -20℃でのサンプルの保存のため、放射性試料の保管専用の冷凍庫のラベルが付いた放射性三つ葉シンボル内のパースペックスボックス内チューブホルダーやボックス内の場所のサンプル。
    10. RADシンボルパースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。
  2. RADシンボル SDS-PAGEおよびBLOを介してIPサンプルを解決PVDF膜へのt。
    1. RADシンボルビーズを沈殿させる>千×​​gで1分間、2分間遠心95℃まで負荷バッファーでの熱のサンプル。
    2. RADシンボルパースペックス画面の背後にある放射能ベンチでタンパク質ゲル電気泳動モジュールを準備します。
    3. RADシンボル 3から8パーセントトリス - アセテートSDS-PAGEゲルにロードしたサンプル。
      1. このタイプのゲルは、高分子量(HMW)タンパク質を分離するのに適している。他のゲル型はまた、4〜20%ビス - トリシンゲル又はトリス - グリシン4〜20%ゲルとして、適し得る。
      2. HMWタンパク質の大きさを識別するのに適した分子量マーカーが含まれる。
    4. <李> RADシンボル 1時間150 Vで電気泳動を行う。
    5. RADシンボル電気泳動後、そのプラスチックケースからジェルを取り外して、ウェスタンブロッティングトランスファーバッファーの入った容器にゲルを移す。
      1. ウェスタンブロットトランスファーバッファーの組成:50mMのトリス、40mMのグリシン、0.04%SDS、20%メタノール。
      2. RADシンボルこのような井戸セパレータやはみ出しゲルの底部分としてはみ出すゲルの部分を切り取ります。
    6. 1分間メタノールに浸漬してゲルごとに1つのポリフッ化ビニリデンを調製(PVDF)膜、次に転写緩衝液中に置く。
      1. 膜はSに切断されるジェルプラス3ミリメートルのマージンとしてAMEサイズ。
    7. 放射能ベンチにセミドライブロッティングモジュールを置き、カバーと上部電極板を取り外します。
    8. RADシンボルセミドライブロッティングモジュールの表面にブロッティングサンドイッチを準備します。
      1. ブロッティングモジュールの底板上に転写バッファーと場所でフィルタをブロッティング(厚さ2.5mm、7.5×10cmのラージ)エキストラ厚いを濡らす。
      2. RADシンボルブロッティングフィルター上のプリウェットPVDF膜を置きます。
      3. RADシンボル慎重にPVDF膜上にゲルを置き、気泡を除去する。
      4. 523/50523rad1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>ブロッティングモジュールの底板上に転写バッファーと場所に余分な厚いブロッティングフィルターを濡らすことでブロットサンドイッチを完成させます。全ての空気を削除ブロッティングサンドイッチ最終的に存在する泡。
        ここでの説明は、電極は、タンパク質が膜上に下向きに移動するようなものであるバイオラッドトランスブロットSDシステムと互換性があることに注意してください。その他ブロッティングシステムはまた、最終的には考慮に入れ、他のブロッティング方向や、タンクブロッティングの場合には、上記の電気泳動緩衝液と同じ方法で処分することに余分な液体廃棄物を取るために必要なものなど軽微な改造での手順と互換性があります。
    9. RADシンボル吸収性ティッシュですべての余分なバッファを削除して、天板を配置し、半Dのカバー RYブロッティングモジュール。
    10. RADシンボル 1〜2時間、15Vでタンパク質を転送します。
    11. RADシンボルこの間、電気モジュールをクリーンアップ。
      1. RADシンボルパースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。
      2. RADシンボル蒸留水(AD)との電気モジュールをすすぎ、放射性液体廃棄物容器内の洗浄水を捨てます。
    12. 0523/50523rad1.jpg "/>転送後、ブロッティングモジュールからブロッティングしたタンパク質とのPVDF膜を取り除く。
    13. RADシンボルオプション:タンパク質を可視化するためにブロットしたタンパク質のポンソーS染色を行う。
      1. RADシンボルポンソーS溶液を含有する浅いブロットインキュベーション容器にブロットを移し、5分間インキュベートする。
      2. RADシンボル ADで素早く2Xを洗い流す。
    14. RADシンボル膜を乾燥させます。
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpgは "/>オートラジオグラフィーを行ってください。
    1. RADシンボル 1-5日間燐光板に膜を公開します。
    2. RADシンボルストーム840りん光スキャナまたは同等を使用して公開される燐光プレートのオフ32Pを読んで、高解像度のTIFFなどの画像を保存します。
  4. RADシンボル免疫検出を介してタンパク質レベルを検出する。
    1. RADシンボルメタノールに簡単にそれらを浸漬することにより、膜を再水和、次いでPBSで浅いブロットのインキュベーション容器に移す。 RADシンボル 5%ミルクを含有するPBS-T(0.1%トリトンを含むPBS)で膜をブロックする。
    2. RADシンボル適切な洗浄工程および二次抗体のインキュベーションをさらに抗LRRK2抗体13,16または抗FLAG抗体およびプロセスでブロットをインキュベートします。
    3. RADシンボル LRRK2の相対的なタンパク質レベルを確認するために、化学発光検出を実行します。
  5. LRRK2における32 Pの取り込みを定量化する。
    1. このようなImageJソフトウェア、国立Institで提供フリーウェアプログラムとして適切なソフトウェアを使用してブロットオートラジオグラムと免疫反応性でバンドの濃度分析を行う健康ウェブサイトのユート族( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )。
    2. 免疫反応性のレベルを超えるオートラジオグラフィーシグナルの比としてリン酸を組み込む濃度を計算します。

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Representative Results

細胞においてLRRK1とLRRK2全体のリン酸化レベルを比較するために、3XFLAGはLRRK1タグとLRRK2をHEK293T細胞で発現させた15。細胞を、6ウェルプレートで培養し、32 Pで標識し、プロトコル·テキストで上記のように分析した。 図1は、HEK293T細胞におけるLRRK1およびLRRK2の代謝標識のための代表的な結果を示す。放射性リン酸取り込みはLRRK1およびLRRK2の両方で観察される。抗flag抗体を用いた免疫検出のデンシトメトリー分析によって測定された32 Pレベルの定量の際にタンパク質レベルに対して正規化し、それは統計的有意であるがLRRK1は、試験した条件下でLRRK2よりも低い平均リン酸化レベルを有していることが見出された(P> 0.05)に達していない。

1.JPG "/>
図1。LRRK1およびLRRK2の代謝標識。 A. LRRK1とLRRK2がHEK293T細胞において発現が代謝的プロトコールに記載のように32 Pで標識した切片をもたらす。ここで示している彼らの3XFLAGタグ経由LRRK1およびLRRK2の検出の32 P取り込みだけでなく、代表的なウェスタンブロット(下のパネル)の代表オートラジオグラム(上のパネル)があります。 B. LRRK1およびLRRK2の比較代謝ラベリングの定量化(N = 4)。

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Discussion

本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRKタ ​​ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に同化され、リン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグ(3XFLAG)を次に免疫沈降によって他の細胞成分からLRRKタンパク質を単離するために使用される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー(32 P信号)およびウエスタン検出(タンパク質シグナル)によって行われる。このプロトコルは、LRRK2 AUを測定するためのプロトコルとは区別すべきであるLRRK1またはLRRK2の標識は、細胞培養ではなく、精製タンパク質用いたin vitroリン酸化反応で行われることをtophosphorylation 17。

これは、ここに提示の詳細なプロトコールは、実験の必要性に応じて複数のバリエーションに適応するように調整することができることに留意すべきである。標識化は、最も一般的な実験用の細胞株において効率的であるように、例えば、このプロトコルは、HEK293T細胞株の使用に限定されない。また、他のアフィニティータグは、HA、mycのように、3XFLAGの代替として使用することができる、V5、GFPまたは複数のタグのような他のタグ18を効率的免疫沈降LRRK1またはLRRK2に用いることができる。場合、タンパク質特異的抗体は、LRRK2 11の場合のように、免疫沈降のために適しているタンパク質に利用可能であり、これも同様に実施することができる。免疫沈降グレードのタンパク質特異的抗体により、LRRKの代謝標識を行うことも可能であるタンパク質は、内因的に細胞株において発現。 LRRK2の場合には、いくつかのモノクローナル抗体は、内因性LRRK2 19のいずれ缶免疫沈降に記載されている。最後に、LRRK1およびLRRK2のためにここに記載代謝標識プロトコルは、また、上記の一般的な方法を用いて細胞株から免疫沈降され得る任意の他のタンパク質に適用することができる。

細胞培養におけるタンパク質の代謝標識を行う前に重要な考慮事項は、この技術は、細胞タンパク質のリン酸化を決定するために利用可能な他の方法と比較する方法である。例えば、特定の部位でのリン酸化は、リン酸特異的抗体を用いたイムノブロッティングによってモニターすることができる。この方法は、同位体ラベリング工程を除く、ここで説明したものに類似した手順に従い、それが利用可能な場合、この理由のため、この技術は、しばしば、32 P-オルトリン酸で代謝標識よりも好まれる。 32 Pで代謝標識オルトリン酸は、タンパク質の全体的なリン酸化状態を表す信号を提供するので、それは、特定の部位のリン酸化についての情報を提供することができない。それはLRRK2 10,11の場合のように複数のリン酸化部位を有するタンパク質については、代謝標識技術は、複数の免疫検出工程を保留中のリン酸特異的抗体を用いて確かめることができ、全体的なリン酸化レベルを一段階評価を提供する。例えば、LRRK2はS910/S935/S955/S973 11,20のサイト、つまりだけでなく、最近特徴付けS1292サイト21を含むその他の地域10において、そのANK-LRRドメイン間領域で高度にリン酸化される。個々のphosphositesの役割を分析するためには、phosphosite特異的な抗体を用いた実験を好むことをお勧めします。例えば、特異的抗体をphosphosite S910/S935/S955/S973のphosphositesが脱リン酸化されていることを識別することができましたこのようなR1441C / Gなど、いくつかの病原性の変異体におけるD、Y1699C、I2020Tはなく、G2019Sにおける11,22、LRRK2疾患変異形が一般的に高いリン酸-S1292レベル21を示しているが。しかし、代謝標識は、細胞のリン酸化の他の多くの研究のために有用である。代謝標識は常に未知のリン酸化部位例内のインスタンスに適用可能な技術であり、あるいはリン酸化抗体が利用できない場合や、低感度の。 (ここに示されているようLRRK1およびLRRK2の細胞のリン酸化レベルを比較する、図1)最後に、代謝標識は、別の抗体からの感度の差を所定のphosphosite特異的抗体を用いて行うことが挑戦している比較、異なるタンパク質の全体的なリン酸化レベルを比較することができ。

結論として、本プロトコルは、細胞中LRRKタンパク質の全体的なリン酸化レベルの効率的な評価を可能にする。プロトコルは、容易に監視するように適合させることができる細胞中で発現され、免疫沈降によって単離することができる任意の他のタンパク質のリン酸化。 phosphosite特異的抗体が試験か、その検証のステップとして、タンパク質のため入手できない場合、このプロトコルを使用することが推奨されます。実験の目標は、代謝標識を介して、このような比較として、2以上の異なるタンパク質の全体的なリン酸化を比較することである場合、このプロトコルは特に有用であるが、別のタンパク質からのリン酸化の検出感度の違いによって付勢されていない。具体的にはLRRK1およびLRRK2のために、この技術は、比較的LRRK1リン酸化の調節はあまり理解されている間、このような変化は、LRRK2 11,13,23について記載され始めていることを考えるとLRRK1およびLRRK2のリン酸化の活性依存性変化をモニターするために使用することができる。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々はまた、この研究をサポートしているマイケル·J·フォックス財団に感謝しています。フランダースFWO(FWOプロジェクトG.0666.09、JMTの主任研究員フェローシップ)、IWT SBO/80020プロジェクト神経ターゲットKUルーベン(OT/08/052AとIOF-KP/07 / 001) - 私たちは、研究財団に感謝彼らのサポートのため。この研究はまた、JMTにキングボードウィン財団が運営するファンドDruwé-Eerdekensによって部分的にサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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