Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2), bir serin-tireonin kinaz, kompleks protein etki alanının bir Ras (ROC), ROC etki (COR) bir C-terminali dahil olmak üzere, benzer bir etki organizasyon paylaşan paraloglarıdır ve lösin bakımından zengin ve N-terminalinde ankirin-benzeri tekrarlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri LRRK2 Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde implike ise ancak LRRK1, 1,2 sinyal tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, aydınlatılamamıştır henüz. Bu raporda, bu şekilde, bu hücreler 2 proteinlerin genel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan, 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 proteinleri etiketlemek için bir protokol mevcut. Kısacası, afinite LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sonra hücreler tarafından asimile sadece bir kaçinkübasyon süresi ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri, bu şekilde radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi ile (3xflag) LRRK proteinlerin immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerinden izole edilmiştir. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir. Protokol kolayca hücrelerinde ifade edilir ve immüno-çökeltme ile izole edilebilir herhangi bir başka proteinin fosforilasyonunu izlemek için adapte edilebilir.

Introduction

Lösin zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) benzer bir etki organizasyon paylaşan multidomain paraloglarıdır. Her iki protein de etkili ROCO protein ailesine 5,6 proteinleri de sınıflandırma, GTPases (Complex Proteinlerin Ras veya ROC) Ras ailesi, hem de etki ROC (COR) bir C-terminaline yakın bir GTPaz dizisini kodlar. Sadece LRRK2 İlave armadillo Domein 6-8 kodlayan ise ROC-COR etki tandem N-terminal, her iki proteinin de, bir lösin-zengini tekrar etki hem de ankirin benzeri alanı kodlar. Sadece LRRK2 C-terminal bölgesinde 8, içinde bir WD40 alanını şifreleyen ise ROC-COR C-terminal, her iki proteinin de, bir serin-tireonin kinaz etki alanını paylaşırlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri ancak LRRK1 1,2 işaret tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, henüz aydınlatılamamıştır varken Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde LRRK2 için bir role genetik kanıtlar.

9-11 arasında bir küme meydana geldiği hücre fosforilasyon bir çoğunluğu göstermiştir. LRRK1 hücre fosforilasyon siteleri eşlenmesi için henüz rağmen, COS7 hücrelerinden imüno LRRK1 protein lekelerinin fosfoprotein boyaması kullanılarak çalışmalar göstermiştir LRRK1 protein hücrelerinde fosforile 12 olduğunu göstermektedir.

Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK prote etiketlendiins 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi (3xflag), daha sonra, immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerden LRRK proteinleri izole etmek için kullanılır. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mevcut protokol LRRK2 hücresel fosforlanmasını takip radyoaktif 32 P-etiketli ortofosfat kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri operatör ve çevreye radyoaktif radyasyon maruziyeti en aza indirmek için uygun koruyucu önlemler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Iyonlaştırıcı radyasyon yayan izotoplar içeren bileşikler, kurumsal ve ulusal düzeyde kontrol kullanımı insan sağlığı ve sıkı lisanslama ve düzenlemeler için zararlı olabilir. Bu protokolde deneyler Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) açık kaynak radyasyon kullanımı konusunda eğitim takip ve üniversitede sağlık, güvenlik ve çevre departmanı tarafından sağlanan iyi laboratuvar uygulamaları yönergeleri takip gerçekleştirilmiştir. Protokolde çeşitli adımlar, yaygın olarak, hücre kültürü, SDS-PAGE, Western blot olarak dağıtılan ve laboratuvarda uygulanan burada protokol detaylar verilmiştir. Bu should deneysel koşullar laboratuvardan laboratuvara değişir unutulmamalıdır; radyoaktif malzemenin uygun kullanımını sağlamak için bu nedenle özel önlemler her yeni laboratuvar ortamında adapte edilmelidir.

Açık kaynak radyasyon kullanımı önce düzenleyici onayına tabidir ve laboratuvar araştırma açık kaynak radyasyon sorumlu düzenleyici kurum ülkeden ülkeye değişir. Kullanıcılar bu işlem, yerel kurallara ve düzenlemelere uyması sağlanması için kurumsal radyasyon güvenlik görevlisi ile başvurmalısınız. Düzenleyici kurumlar ile ilgili bilgiler bulunabilir: Belçika, Nükleer Kontrolü Federal Ajansı ( http://www.fanc.fgov.be , web sitesi, Fransızca veya Hollandaca), Birleşik Krallık, Sağlık ve Güvenlik Yönetim ( http: / / www.hse.gov.uk / radyasyon / iyonlaştırıcı / index.htm ), Amerika Birleşik Devletleri'nde Nuc içindelear Düzenleme Komisyonu ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html Kanada), Kanada Nükleer Güvenlik Komisyonu ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), ve Almanya Das Bundesamt für STRAHLENSCHUTZ in ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Bu protokol ile ilgili güvenlik önlemleri metinde not edilmiştir, radyoaktif yonca sembolü (vurgulanır Rad Sembol .)

1.. Hücreler metabolik etiketleme

  1. Etiketleme için hücrelerin hazırlanması.
    1. Kültür HEK293T hücre hatları, standart kültür koşullarına göre (37 ° C,% 5 CO2) 8% fetal buzağı serumu ve gentamisin ile DMEM içerisinde.
    2. Için yeterli hücrelerin açtest numune başına en az 1 x 10 6 hücreleri elde etmek.
    3. Hücreleri tripsinize edin ve de 10 6 hücre / 6 yuvalı plakalar (35 mm çapında) içine plaka.
    4. 24 saat hücreleri kaplama sonra, transfeksiyonla veya lentiviral vektör aracılı transdüksiyon yoluyla 3xflag-LRRK2 proteini ifade.
      1. Transfeksiyon için, katkı maddesi olmaksızın (örnek 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmid 13-15 veya pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmid 15) ve 80 ul DMEM içine doğrusal polietilenimin (PEI doğrusal, 1 mg / ml) içinde 8 ul başına karıştırın .) 15-30 dakika kompleksi için izin daha sonra orta günümüze içine iyi karıştırılması ile hücrelere kompleks ekleyin.
      2. Lentiviral vektör aracılı transdüksiyon için, lentiviral vektör kodlama 3xflag-LRRK1 sulandırmak veya -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, bir kural olarak, iki katı kadar nakleden birimleri ile transduce, fonksiyonel vektör parçacıkların yani sayı, hücre), kültür ortamı içine vardır Lentivector olarak. Ürünün bir açıklaması LV-3xflag-LRRK1 / 2 arasında iyon, daha önce 15 tarif edilmiştir.
    5. Hücreler% 80-100 konfluent (yaklaşık 48 saat sonra, transfeksiyon ya da transdüksiyon) olduğunda, fosfatlar olmaksızın, önceden ısıtılmış (37 ° C) hücreler DMEM ile yıkayın.
  2. 32 P-orto-fosfat ile etiket hücreleri.
    1. Radyasyon ile çalışırken emniyet zihin genel ilkeleri tutun.
      1. Rad Sembol Belirlenmiş bir radyasyon alanı 32 P ile tüm işlemleri gerçekleştirmek.
      2. Rad Sembol Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir - laboratuarımızda standart işletim prosedürü altında bu laboratuvar önlüğü, çift eldiven ve koruyucu gözlük içerir.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 32 P Tüm iş maruziyeti en aza indirmek için 6 mm perspex ekranlar kullanıcılardan korumalı olmalıdır.
      4. Rad Sembol Kişisel izleme cihazları her zaman kullanılmalıdır - KUL içindeki tüm sertifikalı açık kaynak radyasyon kullanıcı deneyler sırasında radyasyona maruz izlemek için laboratuvar önlüğü göğüs cebinde bağlı bir film rozeti takıyor.
      5. Rad Sembol Tüm deneysel yüzeyler bir Geiger sayacı ile kullanım öncesi ve sonrası radyoaktivite açısından değerlendirilmelidir.
      6. Rad Sembol Tüm potansiyel olarak kontamine sarf ra için kurumsal kurallarına sıkı sıkıya bağlı olarak atılmalıdırdioactive atık bertaraf.
    2. Bir laminar akış altında, bir etikete hücrelerin 6-çukurlu plaka başına (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) fosfatlar olmadan DMEM içinde 2.1 ml 'si ile bir Falcon tüpü hazırlayın.
      1. Örneğin, 6-çukurlu bir levhanın her kuyularda etiket hücrelere, 12,6 mi, orta (x = 2,1 6) hazırlanması. Bu 2 ml'lik ortam hacmi içinde% 5 fazla olan hücreler 6-çukurlu plaka gözenek başına kullanılmak üzere sağlanmasıdır.
    3. Rad Sembol Iyonlaştırıcı radyasyon ile deneyler yapılacak hangi tezgah hazırlayın. Çalışma alanı emici malzeme koruyucu astar yerleştirildiği üzerine bir dökülme mat ile kaplıdır. Eğer bir su geçirmez yüzeyi ile bir kalemi kullanıyorsanız durumda, emici tarafı yukarıya yerleştirin.
    4. Rad Sembol Ayrıca sağlamakbir perspex çalışma alanı üzerine kavanoz ve içinde fosfat serbest ortamın tüp yerleştirin.
    5. Rad Sembol Buzdolabı dışında 32 P etiketli ortofosfat flakon ile kurşun kaplı kabı alın ve radyoaktivite tezgah getirmek. Bir Geiger sayacı kullanan dış radyoaktif kontaminasyon için konteyner izleyin.
    6. Rad Sembol 24 uCi / ml 'lik bir konsantrasyonda fosfat olmayan DMEM tüpe 32P etiketli ortofosfat seyreltin.
      1. Not: iyi hücreler 6-çukurlu plaka başına 2 ml, bu 5 uCi 32 kültürlenmiş hücrelerin P etiketli ortofosfat / cm 2 karşılık gelir.
      2. Rad Sembol TutmakPerspex kavanoza tüp.
    7. Rad Sembol 32P etiketli ortofosfat geri kalan kısmı ile kap kapatın ve buzdolabında değiştirin.
    8. Rad Sembol Radyoaktivite bankta inkübatör ve yerden etiketlenmesine hücreleri ile 6 oyuklu plakalar çıkarın.
    9. Rad Sembol Orta süpernatant kaldırmak ve atın. Ihtiva eden fosfat içermeyen ortam 2 ml ekle 32 ortofosfat / oyuk etiketli.
    10. Rad Sembol Bir Perspex kutusu içine Kültür levhalarını, daha sonra bir kap fo izlemekBir Geiger sayacı kullanarak r dış radyoaktif kirlenme.
    11. Rad Sembol Izotopik metabolik etiketleme için özel bir ökaryotik hücre inkübatör hücreleri ile Perspex kutusu aktarın.
    12. Rad Sembol % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 1-20 saat süreyle inkübe edin.
      1. Genel olarak, 3 saat ya da daha fazla olan bir birleşme süresi tavsiye edilir. Istenilen şekilde uygun inkübasyon süresi her özel protein için bir zaman akışı deneylerinde yoluyla değerlendirilebilir.
    13. Rad Sembol İsteğe bağlı: bileşik hücreleri tedavi.
      1. (Örneğin, bir enzim inhibitörü gibi) bileşiği, tedavi ile deneylerde bir bileşik, muamele aşaması, bir yapılmasının ardından dahildiretiketlenmesi için izin vermek için bileşik olmadan inkübasyon süresi itial. İstenilen kuluçka süresinden sonra, kültür plakaları içeren bir Perspex kutusu kuluçka makinesinden çıkarılır ve radyoaktivite, tezgah getirildi.
      2. Rad Sembol Etiketleme ortam bileşik, istenen konsantrasyonda seyreltilir, içine önceden ısıtılmış fosfat içermeyen ortam çıkarılır ve değiştirilir. Perspex kavanoza yerleştirilir atık toplama için bir 50 ml tüp içinde orta atın.
      3. Rad Sembol Hücreler, perspeks kutuya değiştirilir ve arzu edilen temas süresi için hücre kuluçka makinesine yerleştirilir.
  3. Rad Sembol Labe lisatlan toplayınyol hücreleri.
    1. Rad Sembol Hücrelerden orta çıkarın ve Perspex kavanoza yerleştirilir atık toplama tüpüne atın.
    2. Rad Sembol Hücreler Perspex kavanoza yerleştirilmiş bir atık toplama tüpüne çalkalama solüsyonu atarak, soğuk TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, 2 mL / yıkama) ile 2 kez yıkayın.
    3. Rad Sembol Her bir oyuğa buz gibi soğuk, immüno-çökeltme (IP) liziz tamponu içinde 0.5 ml ekleyin ve bütün hücrelerin lize gevşetmek amacıyla, yukarı ve aşağı lizat pipetleme lizat toplar.
      1. Proteaz inhibitörü kokteyl ve fosfataz ekleme, IP liziz tamponu vaktinden (0.5 ml / numune +% 5 fazla) of istenen hacmi hazırlanmasıKullanımdan hemen önce taze inhibitör kokteyli.
      2. Liziz tamponu bileşimi Tris 20 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM,% 1 Triton, Gliserol% 10, proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyl.
    4. Rad Sembol Bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve lizat, en az 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
    5. Rad Sembol 10 dakika boyunca> 5,000 xg'de bir mikrosantrifüj içinde lizatları santrifüjleyin.
    6. Rad Sembol Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.

2. İlgi Proteinlerin Etiketleme analiz

  1. Rad Sembol Immün-(IP) ile ilgili bir proteini izole.
    1. Rad Sembol Tekrar buza santrifüje lizatları ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın ve dengelenmiş flag-M2 agaroz boncuklar 10 ul yatak hacmi ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içine pipetle süpernatant.
      1. Vaktinden önce dengelenmiş flag-M2 agaroz taneleri ile tüpleri hazırlayın.
      2. Bunun için, 10 ul numune başına yatak hacmi artı% 5 fazlalık karşılık gelen flag-M2 agaroz harç maddenin bir hacmi pipetle.
        1. Genel olarak, boncuklar bir 10 ul yatak hacmi 20 ul bulamaca karşılık gelir. Daha fazla bilgi için ürün veri sayfasına bakın.
      3. IP liziz tamponu 10 hacim (yatak hacmi göre) içinde 3 kez durulama ile boncuk dengelenmesi.
      4. Örnekleri olduğu gibi birçok tüpleri içine 10 ul yatak hacmi / tüp eşit olarak dengelenmiş boncuk dağıtmak. Her numune için bir tanımlayıcı ile tüpleri etiketleyin.
    2. Rad Sembol Bir radyoaktif yonca sembolü ile etiketlenmiş 50 ml tüpler (yaklaşık 6 mikrosantrifuj tubes/50 ml tüp) için mikrosantrifüj tüpleri aktarın ve buz üzerinde tutmak.
    3. Rad Sembol 1-20 saat için 4 ° C 'de karıştırma ucuna uç için bir odanın iç alanında belirlenmiş bir Perspex koruma kalkanının ardında, bir döner cihaz aktarın örnekleri.
    4. Rad Sembol Buz üzerinde belirli bir çalışma alanı için örnekleri aktarın.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> mikrosantrifujde (1.000 xg, 1 dak) bayrak-M2 agaroz boncuk bağlı protein aşağı Spin ve bir atık toplama tüpüne süpernatant atın.
    6. Rad Sembol 1 ml IP yıkama tamponu içinde yeniden süspanse ile proteine ​​bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk yıkayın.
      1. IP yıkama tamponu bileşimi: Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 400 mM,% 1 Triton. Ayrıca ko-temizleyici proteaz ile ya da co-temizleyici fosfatazla defosforilasyona bozunmaya duyarlı proteinler için yıkama tamponu içinde proteaz ve fosfataz inhibitörleri önerilir.
      2. Rad Sembol Mikrosantrifuj'de proteine ​​bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk (1000 xg, 1 dak) Spin ve atık toplama merkezleri haline süpernatant atıntion tüpü.
      3. Rad Sembol Yıkama adım 3x tekrarlayın.
    7. Rad Sembol Yıkamadan sonra, 1 ml yıkama IP tampon maddesi (25 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, ditiyotreitol (DTT) 2 mM,% 0.02 Triton, beta-gliserofosfat, 5 mM, Na 3 VO 4 0.1 mM) içine boncuklar tekrar süspansiyon.
    8. Rad Sembol Mikrosantrifuj'de protein bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk (1000 xg, 1 dak) Spin ve bir atık toplama tüpüne süpernatant atın. Tüm aşırı tamponu çıkarın.
    9. Rad Sembol 40 & m içine süspanse boncuklaru; IP numune SDS yükleme tamponu (Tris-HCl 160 mM pH 6.8,% 2 SDS, 0.2 M DTT,% 40 gliserol, bromofenol mavi 2 mg / ml).
      1. Örnekler hemen analiz veya gizli analizi için -20 ° C dondurucuda saklanabilir.
        1. Rad Sembol Radyoaktif örneklerin saklanması için özel bir radyoaktif yonca sembolü etiketli dondurucuda bir perspex kutuda tüp tutucular veya kutulara -20 ° C, yer örneklerinde örneklerin saklanması için.
    10. Rad Sembol Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.
  2. Rad Sembol SDS-PAGE ve blo üzerinden IP örnekleri çözümlemekPVDF membrana t.
    1. Rad Sembol Boncuklar: pelet> 1000 xg'de 1 dakika için 2 dakika ve santrifüj boyunca 95 ° C'ye kadar yükleme tamponu içinde ısı örnekleri.
    2. Rad Sembol Bir perspex ekran arkasında radyoaktivite bankta protein jel elektroforezi modülü hazırlayın.
    3. Rad Sembol A% 3-8 tris-asetat, SDS-PAGE jelleri üzerine yük örnekleri.
      1. Jel Bu tip yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) proteinleri çözmek için uygundur. Diğer jel tipleri, aynı zamanda, bir% 4-20 Bis-Trisin jel veya Tris-glisin 4-20% jeller gibi, uygun olabilir.
      2. HMW proteinlerin boyutları ayırt etmek uygun olan bir moleküler ağırlık işaretleyici içerir.
    4. <li> Rad Sembol 1 saat boyunca 150 V'ta elektroforez yapın.
    5. Rad Sembol Elektroforezisten sonra, plastik muhafazadan jel kaldırmak ve Western lekeleme yolu transfer tampon maddesi ile bir kap için jel aktarın.
      1. Western blotting transfer tampon maddesi bileşimi: Tris 50 mM, 40 mM glisin,% 0.04 SDS,% 20 metanol.
      2. Rad Sembol Böyle iyi ayırıcılar ve sopalarla jelin alt bölümü olarak sopa jel parçalarını kesti.
    6. 1 dakika boyunca metanol içinde daldırılarak jel başına bir poliviniliden florür hazırlayın (PVDF) membran, daha sonra transfer tampon maddesi içinde yer.
      1. Membranlar s kesilir jel artı 3 mm kenar olarak ame boyutu.
    7. Radyoaktivite bankta yarı-kuru emme modülü yerleştirin ve kapağını ve üst elektrot plakasını çıkarın.
    8. Rad Sembol Yarı-kuru blotlama modülünün yüzeyinde blot sandviç hazırlayın.
      1. Lekeleme modülün alt plaka üzerine transfer tampon ve yerine filtreyi lekeleme (7.5 x 10 cm geniş, kalın 2.5 mm) bir ekstra kalın ıslatın.
      2. Rad Sembol Blot filtresi üzerindeki önceden ıslak PVDF membran yerleştirin.
      3. Rad Sembol Dikkatlice PVDF zar üzerinde jel yerleştirilir ve hava kabarcıklarını çıkarmak.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> kurutma modülünün alt plaka üzerine transfer tampon ve yerinde ekstra kalın bir lekeleme filtresi ıslatarak leke sandviç tamamlayın. Tüm havayı çıkarın blot sandviç sonunda mevcut kabarcıklar.
        Burada verilen açıklama elektrotlar proteinler membran üzerine aşağıya doğru göç şekildedir BioRad trans-leke SD sistemi ile uyumlu olduğunu unutmayınız. Diğer kurutma sistemleri, aynı zamanda, bu sonuçta dikkate bir lekeleme yöne çekmek için gerekli ya da, tank blotting, yukarıda elektroforez tamponu ile aynı şekilde bertaraf edilmesi için ilave sıvı atığın durumunda olduğu gibi küçük uyarlamalarla bu adımlar ile uyumludur.
    9. Rad Sembol Emici bir doku ile tüm fazla tamponunu çıkarın ve üst plaka ile yarı-d kapağı yerleştirmek ry blot modülü.
    10. Rad Sembol 1-2 saat süre ile 15 V de proteinleri aktarın.
    11. Rad Sembol Bu süre boyunca, elektroforez modülünü temizlemek.
      1. Rad Sembol Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.
      2. Rad Sembol Damıtılmış su (AD) ile elektroforez modülü durulayın ve radyoaktif sıvı atık konteynerine durulama suyunu atın.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> transferinden sonra, lekeleme modülü lekelenen proteinler ile PVDF membran kaldırmak.
    13. Rad Sembol İsteğe bağlı: proteinleri görselleştirmek için lekelenen proteinler, Ponceau S boyama yapar.
      1. Rad Sembol Ponceau S çözeltisi içeren basit bir leke inkübasyon kabına transfer leke ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
      2. Rad Sembol MS hızlı 2x durulayın.
    14. Rad Sembol Membran kurutun.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> otoradyografisim gerçekleştirin.
    1. Rad Sembol 1-5 gün için bir fosforesans plakaya membran Açığa.
    2. Rad Sembol Eşdeğer bir Fırtına 840 yakamoz tarayıcı kullanarak veya maruz fosforesans plaka kapalı 32P okuyun ve yüksek çözünürlüklü TIFF olarak kaydetmek.
  4. Rad Sembol İmmuno yoluyla protein seviyesini algılar.
    1. Rad Sembol Metanol içine batırılarak ile membranlar rehidrate, sonra PBS ile basit bir leke inkübasyon kabına transfer. Rad Sembol % 5 süt ihtiva eden (% 0.1 Triton ile PBS) PBS-T içinde bloke membranlar.
    2. Rad Sembol Uygun yıkama adımları ve ikincil antikor inkübasyon anti bayrak antikor ve süreci daha da anti-LRRK2 antikor 13,16 veya lekelerini kuluçkaya yatmaktadır.
    3. Rad Sembol LRRK2 göreli protein düzeylerini onaylamak için chemilüminesan algılama gerçekleştirin.
  5. LRRK2 32 P katılmasını ölçmek.
    1. Böyle ImageJ yazılım, Milli INSTIT mevcut ücretsiz bir program olarak uygun yazılım kullanarak leke otoradyogramlar ve imünoreaktivitenin üzerindeki bantların dansiyometrik analizi yapınSağlık web sitesi utes ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Imünoreaktivite seviyesinin üzerinde otoradyografik sinyalinin oranı olarak dahil fosfat seviyelerini hesaplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyon düzeylerini karşılaştırmak amacıyla, 3xflag LRRK1 etiketli ve LRRK2 HEK293T hücrelerde 15 olarak ifade edildi. Hücreler, 6 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi ve 32 P ile etiketlenmiş ve protokol metinde yukarıda tarif edildiği gibi analiz edildi. Şekil 1, HEK293T hücrelerinde LRRK1 ve LRRK2 metabolik etiketlenmesi için temsili sonuçlar gösterilmektedir. Radyoaktif fosfat birleşme LRRK1 ve LRRK2 her ikisi için gözlemlenmiştir. Istatistiksel anlamlılık olmasına rağmen, anti-flag antikor ile İmmuno densitometrik analizi ile ölçüldüğü gibi protein seviyelerinin normalize 32 P seviyelerinin ölçümü üzerine, bu, LRRK1 test edilen koşullar altında LRRK2 daha düşük bir ortalama bir fosforilasyon seviyesi saptandı (P> 0.05) ulaşmış değil.

1.jpg "/>
Şekil 1.. LRRK1 ve LRRK2 Metabolik etiketleme. A. LRRK1 ve LRRK2 HEK293T hücrelerinde ifade metabolik protokolde tarif edildiği gibi 32 P ile etiketlenmiş ve bölümleri sonuçlar edilmiştir. 32 P dahil temsili otoradyogramlan (üst panel) yanı sıra bunların 3xflag etiketler ile LRRK1 ve LRRK2 tespiti için temsili Western blotlar (alt panel) burada tasvir. LRRK1 ve LRRK2 karşılaştırmalı metabolik etiketleme B. miktarının (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi (3xflag), daha sonra, immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerden LRRK proteinleri izole etmek için kullanılır. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve Western algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir. Bu protokol LRRK2 au ölçmek için protokol ayırt edilmelidirbu LRRK1 etiketlenmesi veya LRRK2 olarak tophosphorylation 17 oldukça saflaştırılmış proteinleri ile in vitro fosforilasyon reaksiyonunun göre hücre kültüründe gerçekleştirilir.

Burada sunulan ayrıntılı protokol deneysel gereksinimlerine bağlı olarak birden fazla varyasyonları yerleştirmek için ayarlanabilir olduğu unutulmamalıdır. Etiketleme en bilinen bir laboratuvar hücre hatlarında etkili olarak Örneğin, bu protokol HEK293T hücre çizgisinin kullanımıyla sınırlı değildir. Ayrıca, diğer afinite etiketleri örneğin HA, 3xflag alternatif olarak kullanılabilir, myc, V5, GFP veya başka etiketler 18 gibi çok etiketler verimli İmmüno LRRK1 veya LRRK2 için kullanılabilir. Halinde, bir protein-spesifik antikor LRRK2 11 için olduğu gibi, immüno-çökeltme için uygun olan bir protein için kullanılabilir, bu da uygulanabilir. Bir immünopresipitasyon sınıf proteinine özel antikor ile, LRRK metabolik etiketlenmesi de mümkündürproteinler, endojen hücre hatları olarak ifade edilmiştir. LRRK2 durumunda, çeşitli monoklonal antikorlar endojen LRRK2 19 arasında olan kutu imüno tarif edilmiştir. Son olarak, LRRK1 ve LRRK2 için burada tarif edilen metabolik etiketleme protokol, aynı zamanda, yukarıda tarif edilen genel strateji kullanılarak hücre çizgilerinden imüno edilebilir herhangi bir başka protein ile uyarlanabilir.

Hücre kültürü protein metabolik etiketleme gerçekleştirmeden önce önemli bir husus, bu teknik, hücresel protein fosforizasyonunu belirlemek için mevcut diğer yöntemlere karşılaştırır nasıl. Örneğin, belirli bölgelerde fosforilasyon bir fosfo-spesifik antikor imüno-benekleme ile izlenebilir. Bu yöntem, izotopik etiketleme adımları hariç, burada tarif edilen, ve, uygun olduğunda, bu nedenle, bu teknik, çoğu zaman 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketlenmesi fazla tercih edilmektedir benzer adımları izler. Metabolik etiketleme 32 P-ortofosfat bu nedenle belirli sitelerin fosforilasyonu hakkında bilgi sağlayamaz, proteinin genel fosforilasyon durumu temsil eden bir sinyal sağlar. Bu LRRK2 10,11 için olduğu gibi, çok sayıda fosforilasyon sahip proteinler için, metabolik etiketleme tekniği, sadece birden çok immunodeteksiyon adımları bekleyen, fosfo-spesifik antikorlar ile tespit edebilir genel fosforilasyon seviyesinin tek-aşamalı bir değerlendirme sağlar. Örneğin, LRRK2 S910/S935/S955/S973 11,20 siteleri örneğin, yanı sıra son zamanlarda, özelliği S1292 sitesi 21 de dahil olmak üzere başka bölgelerde 10, kendi ANK-LRR alanları arası bölgede oldukça fosforlu olan. Bireysel phosphosites rollerini teşrih amacıyla, bu phosphosite özel antikorlar ile deneyler tercih edilmesi önerilir. Örneğin, spesifik antikorlar, S910/S935/S955/S973 phosphosites fosfor giderilmesi olduğunu farketmek için izin phosphositeBu tür R1441C / G, Y1699C, I2020T değil, G2019S olarak 11,22, gibi çeşitli patojenik mutantlar d LRRK2 hastalık mutant formları, genellikle daha yüksek fosfo-S1292 seviyeleri 21 gösterirken. Bununla birlikte, metabolik etiketleme hücre fosforilasyon diğer çalışmaların bir dizi için yararlıdır. Metabolik etiketleme her zaman bilinmeyen fosforilasyon durumlarında mesela uygulanabilir bir teknik, ya da fosfo-antikorları mevcut olmadığında veya düşük duyarlılık. (LRRK1 ve LRRK2, şekil 1 'fosforilasyonu, hücre seviyeleri karşılaştırılarak, burada gösterildiği gibi) Son olarak, metabolik etiketleme başka bir antikordan hassasiyetinde belirgin farklılıklar verilen phosphosite özel antikorlar ile yapmak zorlu bir karşılaştırma, farklı proteinler genel fosforilasyonu seviyelerini karşılaştıran sağlar: .

Sonuç olarak, mevcut protokolü hücrelerdeki LRRK proteinlerin genel fosforilasyon seviyesi etkili değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Protokol kolayca izlemek için adapte edilebilirhücrelerinde ifade edilir ve immüno-çökeltme ile izole edilebilir herhangi bir başka protein fosforilasyonu. Phosphosite-spesifik antikorlar çalışmaya ya da doğrulama bir adım olarak protein için kullanılabilir olduğunda, bu protokolün kullanılması önerilir. Deney hedef metabolik etiketlenmesi ile karşılaştırmalar bu gibi 2 veya daha fazla farklı proteinin genel fosforilasyonunu karşılaştırma olduğunda bu protokol, özellikle yararlı olan başka bir protein fosforilasyon algılama hassasiyeti farklılıklardan önyargılı değildir. Özellikle LRRK1 ve LRRK2 için, bu teknik, nispeten LRRK1 fosforilasyon düzenleme az anlaşılmıştır ise bu tür değişikliği, LRRK2 11,13,23 için tarif başlanmıştır verilen LRRK1 ve LRRK2 fosforilasyonuyla aktivitesine bağlı değişiklikleri izlemek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz de bu çalışmayı destekleyen Michael J. Fox Vakfı'na müteşekkiriz. Flanders FWO (FWO proje G.0666.09, JMT kıdemli araştırmacı bursu), IWT SBO/80020 proje Nöro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A ve IOF-KP/07 / 001) - Biz Araştırma Vakfı'na teşekkür verdikleri destek için. Bu araştırma aynı zamanda JMT için King Baudouin Vakfı tarafından yönetilen Fon Druwé-Eerdekens tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430, (910), 405-413 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics