Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

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Biology

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Summary

Répétition riche en leucine kinases 1 et 2 (et LRRK1 LRRK2) sont des protéines à domaines multiples qui codent à la fois GTPase et domaines de kinase et qui sont phosphorylées dans les cellules. Ici, nous présentons un protocole d'étiqueter LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec 32 P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer leur niveau global de phosphorylation cellulaire.

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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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Abstract

Leucine répétition riche kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont des paralogues qui partagent une organisation de domaine similaire, comprenant un domaine de sérine-thréonine kinase, un Ras de protéines complexe domaine (ROC), une extrémité C-terminale de ROC domaine (COR), et riche en leucine et répétitions ankyrine-comme à l'extrémité N-terminale. Les rôles cellulaires précises de LRRK1 LRRK2 et n'ont pas encore été élucidé, mais LRRK1 a été impliquée dans la tyrosine kinase du récepteur de signalisation 1,2, tandis que la LRRK2 est impliquée dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson 3,4. Dans ce rapport, nous présentons un protocole d'étiqueter les protéines LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec 32 P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de ces deux protéines dans les cellules. En résumé, l'affinité des protéines marquées LRRK sont exprimés dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après seulement quelquesheures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Via l'étiquette d'affinité (3xflag) les protéines de LRRK sont isolés à partir d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie (32 de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots. Le protocole peut être facilement adapté pour surveiller la phosphorylation de toute autre protéine qui peut être exprimée dans des cellules et isolé par immunoprécipitation.

Introduction

Leucine riche répétition kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont paralogues multidomaines qui partagent une organisation de domaine similaire. Les deux protéines codent pour une séquence de GTPase apparenté à la famille Ras (Ras GTPases de complexes de protéines, ou ROC) ainsi que d'un C-terminal du domaine ROC (COR), classer efficacement les deux protéines de la famille des protéines ROCO 5,6. N-terminale du domaine tandem ROC-COR, les deux protéines codant pour le domaine répétitions riches en leucine ainsi que d'un domaine ankyrine-like, alors que seulement LRRK2 code pour un tatou supplémentaire domein 6-8. C-terminale de ROC-COR, les deux protéines partagent un domaine de sérine-thréonine kinase, tandis que seulement la LRRK2 code pour un domaine de WD40 dans la région C-terminale 8. Les rôles cellulaires précises de LRRK1 LRRK2 et n'ont pas encore été élucidé, mais LRRK1 a été impliquée dans la tyrosine kinase du récepteur de signalisation 1,2, tandis que les points de preuve génétique à un rôle de LRRK2 dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson 3,4.

9-11. Bien LRRK1 sites de phosphorylation cellulaire n'ont pas encore été cartographiée, à l'aide de données provenant d'études phosphoprotéine coloration des taches de protéines de LRRK1 immunoprécipitée à partir des cellules COS7 suggère que la protéine LRRK1 est phosphorylé dans les cellules 12.

Ce document fournit un protocole de base pour tester le niveau de phosphorylation général de LRRK1 et LRRK2 dans des lignées cellulaires en utilisant un marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate. La stratégie globale est simple. Affinity marqué LRRK proteins sont exprimés dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après quelques heures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Le marqueur d'affinité (de 3xflag) est ensuite utilisée pour isoler les protéines de LRRK d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie (32 de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots.

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Protocol

Le présent protocole utilise radioactif marqué au 32P orthophosphate de suivre la phosphorylation cellulaire de LRRK2. Il est important de garder à l'esprit que toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l'aide des mesures de protection appropriées pour réduire l'exposition de rayonnement radioactif de l'opérateur et de l'environnement. Composés contenant des isotopes émettant des rayonnements ionisants peuvent être nocifs pour la santé humaine et l'octroi de licences et la réglementation stricte à un contrôle institutionnel et au niveau national leur utilisation. Les expériences de ce protocole ont été réalisées après la formation en cours d'utilisation ouverte de rayonnement de la source à la Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) et en suivant les lignes directrices de bonnes pratiques de laboratoire fournis par le ministère de la santé, de la sécurité et de l'environnement à l'université. Plusieurs étapes de notre protocole sont largement déployées comme la culture cellulaire, SDS-PAGE, Western blot et donnés ici sont des détails du protocole appliqué dans notre laboratoire. Il esthould noter que les conditions expérimentales précises varient d'un laboratoire à conséquence des mesures spécifiques pour garantir la manipulation correcte des matières radioactives doivent être adaptées à chaque nouveau laboratoire.

Utilisation des rayonnements open source est soumise à l'approbation réglementaire préalable et l'organisme de réglementation responsable de l'open source rayonnement de la recherche en laboratoire varie de pays à pays. Les utilisateurs devraient consulter leur agent de sécurité de rayonnement institutionnel afin de garantir que la procédure conforme aux règles et réglementations locales. Informations sur les organismes de réglementation se trouve: en Belgique, l'Agence fédérale de contrôle nucléaire ( http://www.fanc.fgov.be , site en français ou en néerlandais), au Royaume-Uni, le Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / radiation / ionisants / index.htm ), aux États-Unis le NucCommission de réglementation de Lear ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), au Canada, la Commission canadienne de sûreté nucléaire ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), et en Allemagne Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Consignes de sécurité relatives à ce protocole ont été notées dans le texte, mis en évidence par le symbole du trèfle radioactif ( Symbole Rad ).

Une. Marquage métabolique des cellules

  1. Préparer les cellules pour l'étiquetage.
    1. Culture des lignées de cellules HEK293T en fonction des conditions de culture standard (37 ° C, 5% CO 2) dans du DMEM avec 8% de sérum de veau foetal et de la gentamycine.
    2. Développer cellules suffisamment pourobtenir au moins 1 x 10 6 cellules par échantillon à tester.
    3. Trypsiniser cellules et étaler en plaques de 6 puits (diamètre 35 mm) à 10 6 cellules / puits.
    4. 24 heures après étalement des cellules, exprimer la protéine 3xflag-LRRK2 par transfection ou transduction médiée par vecteur lentiviral.
      1. Pour la transfection, mélanger par exemple 4 pg d'ADN (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmide 13-15 ou pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmide 15) et 8 pi de polyéthylèneimine linéaire (PEI linéaire, 1 mg / ml) dans 80 ul DMEM (sans ajouts ). Laisser complexe pour 15-30 min puis ajouter complexe de cellules en mélangeant bien dans le milieu actuel.
      2. Pour vecteur lentiviral médiation transduction, diluer vecteur lentiviral codant 3xflag-LRRK1 ou -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, en règle générale, la transduction avec deux fois plus d'unités de transduction, c'est à dire le nombre de particules de vecteur fonctionnelles, de lentivector qu'il ya de cellules) dans du milieu de culture. Une description du produit ion de LV-3xflag-LRRK1 / 2 a été décrit précédemment 15.
    5. Lorsque les cellules sont 80-100% de confluence (environ 48 heures après transfection ou transduction), rincer les cellules avec préchauffé (37 ° C) DMEM sans phosphates.
  2. cellules d'étiquetage avec 32 P-ortho-phosphate.
    1. Gardez à l'esprit les principes généraux de la sécurité lorsque vous travaillez avec des radiations.
      1. Symbole Rad Effectuer toutes les opérations avec 32 P dans une zone de rayonnement désigné.
      2. Symbole Rad Équipements de protection individuelle appropriés doivent être portés - selon la procédure d'exploitation standard dans notre laboratoire il s'agit notamment des blouses de laboratoire, des gants doubles et des lunettes de protection.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Tout travail avec 32 P doit être protégé contre les utilisateurs de 6 écrans mm de plexiglas pour minimiser l'exposition.
      4. Symbole Rad Dispositifs de surveillance personnels doivent toujours être utilisés - dans KUL tout utilisateur de rayonnement open source certifié porte un badge du film attaché à la poche de poitrine de la blouse de laboratoire pour surveiller l'exposition aux radiations lors des expériences.
      5. Symbole Rad Toutes les surfaces expérimentales devraient être évalués pour la radioactivité avant et après utilisation avec un compteur Geiger.
      6. Symbole Rad Tous les consommables potentiellement contaminés doivent être éliminés dans le strict respect des directives institutionnelles pour ral'élimination des chets radioactifs.
    2. Sous un flux laminaire, préparer un tube Falcon avec 2,1 ml de DMEM sans phosphates (préchauffé à 37 ° C) par plaque de 6 puits de cellules à l'étiquette.
      1. Par exemple, pour marquer les cellules dans tous les puits d'une plaque à 6 puits, de préparer 12,6 ml de milieu (6 x = 2,1). Il s'agit de prévoir des 2 ml de milieu pour être utilisé par 6 puits puits de plaque de cellules avec un excès de 5% en volume.
    3. Symbole Rad Préparer le banc à laquelle les expériences avec les rayonnements ionisants seront effectuées. L'espace de travail est recouverte par un tapis de déversement sur laquelle une couche protectrice de matériau absorbant est placé. Dans le cas où vous utilisez un revêtement avec une surface imperméable à l'eau, placez-le avec le côté absorbant jusqu'à.
    4. Symbole Rad Prévoir égalementun bocal en plexiglas sur l'espace de travail et placer le tube de milieu sans phosphate en elle.
    5. Symbole Rad Prenez de l'avance contenant recouvert avec le flacon de 32 orthophosphate marqué P du réfrigérateur et l'amener à la table de la radioactivité. Surveiller le conteneur de la contamination radioactive externe à l'aide d'un compteur Geiger.
    6. Symbole Rad Diluer 32 P marqué orthophosphate dans le tube de DMEM sans phosphates à une concentration de 24 pCi / ml.
      1. Remarque: à 2 ml par plaque de 6 puits et de cellules, ce qui correspond à 5 pCi marquée au 32P orthophosphate / cm 2 de cellules en culture.
      2. Symbole Rad Garderle tube dans le pot Perspex.
    7. Symbole Rad Fermer le récipient avec le reste de la 32 P marqué orthophosphate et remplacer dans le réfrigérateur.
    8. Symbole Rad Retirez les plaques de 6 puits avec des cellules doivent être étiquetés de l'incubateur et place sur le banc de la radioactivité.
    9. Symbole Rad Retirer le surnageant moyen et le jeter. Ajouter 2 ml de milieu sans phosphate marqué au 32P contenant orthophosphate / puits.
    10. Symbole Rad Placez les plaques de culture dans une boîte en plexiglas alors surveiller le conteneur for contamination radioactive externe à l'aide d'un compteur Geiger.
    11. Symbole Rad Transférer la boîte en plexiglas avec des cellules à un incubateur de cellules eucaryotes dédié à l'étiquetage métabolique isotopique.
    12. Symbole Rad Incuber pendant 1 à 20 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2.
      1. En général, un temps d'intégration de 3 heures ou plus est conseillé. Le temps d'incubation optimal peut être évaluée grâce à des expériences de cours de temps pour chaque protéine spécifique comme souhaité.
    13. Symbole Rad Facultatif: traiter les cellules avec le composé.
      1. Dans les expériences avec traitement par un composé (par exemple un inhibiteur de la kinase), une étape de traitement avec le composé est inclus dans un aprèsitial temps d'incubation sans composé pour permettre l'étiquetage. Après le temps d'incubation désirée, la boîte Perspex contenant les plaques de culture sont retirées de l'incubateur et amené sur le banc de la radioactivité.
      2. Symbole Rad moyen de marquage est enlevé et remplacé par un milieu exempt de phosphate préchauffée dans laquelle le composé est diluée à la concentration désirée. Jeter le milieu dans un tube de 50 ml pour la collecte des déchets qui est placé dans le pot Perspex.
      3. Symbole Rad Les cellules sont replacées dans la boîte Perspex et placées dans un incubateur cellulaire pendant le temps de contact désiré.
  3. Symbole Rad Recueillir lysats de Labécellules dirigées.
    1. Symbole Rad Éliminer le milieu à partir des cellules et les jeter dans le tube de collecte des déchets qui est placé dans le pot Perspex.
    2. Symbole Rad Rincer les cellules 2x avec de la glace SCT froid (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / rinçage), en rejetant la solution de rinçage dans un tube de collecte de déchets placés dans le pot en plexiglas.
    3. Symbole Rad Ajouter 0,5 ml de glace froide immunoprécipitation (IP) de tampon de lyse pour chaque bien et de recueillir lysat par pipetage lysat de haut en bas afin de desserrer toutes les cellules lysées.
      1. Préparer le volume requis de tampon de lyse IP (0,5 ml / échantillon plus 5% en excès) à l'avance, en ajoutant le cocktail d'inhibiteurs de protease et de phosphataseinhibiteur cocktail frais juste avant utilisation.
      2. La composition du tampon de lyse est Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glycérol 10%, cocktail inhibiteur de protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail.
    4. Symbole Rad Transférer le lysat dans un tube à centrifuger et incuber sur de la glace pendant au moins 10 min.
    5. Symbole Rad Centrifuger les lysats dans une microcentrifugeuse à> 5000 g pendant 10 min.
    6. Symbole Rad Éliminer les déchets radioactifs dans des poubelles dédiées qui sont stockés derrière des boucliers en plexiglas.

2. Analyser marquage des protéines d'intérêt

  1. Symbole Rad Isoler la protéine d'intérêt par immunopurification (IP).
    1. Symbole Rad Transférer les microtubes avec des lysats centrifugés dos à la glace et la pipette le surnageant dans un microtube contenant 10 pi volume de lit de billes d'agarose équilibrée drapeau-M2.
      1. Préparer les tubes avec billes d'agarose équilibrée drapeau-M2 à l'avance.
      2. Pour cela, une pipette d'un volume de bouillie flag-M2 agarose correspondant à 10 ul de volume de lit par exemple, plus un excès de 5%.
        1. En général, un volume de lit de 10 ul de billes correspond à 20 ul de suspension. Reportez-vous à la feuille de données du produit pour plus de détails.
      3. Equilibrer les billes par rinçage 3 fois dans 10 volumes (par rapport au volume de lit) de tampon de lyse IP.
      4. Distribuer perles équilibrées uniformément à 10 pi volume de lit / tube dans autant de tubes qu'il ya d'échantillons. Marquez les tubes avec un identifiant pour chaque échantillon.
    2. Symbole Rad Transférer les microtubes à tubes de 50 ml (environ 6 microcentrifuge tubes/50 tube ml) marqués avec un symbole du trèfle radioactif et garder sur la glace.
    3. Symbole Rad échantillons de transfert à un dispositif tournant derrière un bouclier en plexiglas dans la zone désignée d'une chambre froide pour la fin sur fin mélange à 4 ° C pendant 1-20 h.
    4. Symbole Rad Transférer les échantillons à un espace de travail désigné sur la glace.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Isoler la protéine liée billes d'agarose drapeau-M2 dans une micro (1000 xg, 1 min) et jeter le surnageant dans un tube de collecte des déchets.
    6. Symbole Rad Laver les protéines lié drapeau-M2 billes d'agarose par remise en suspension dans 1 ml de tampon de lavage IP.
      1. Composition du tampon de lavage IP: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Il est recommandé d'inclure également des inhibiteurs de la protéase et la phosphatase dans le tampon de lavage pour les protéines sensibles à la dégradation par les protéases co-purification ou de déphosphorylation par des phosphatases co-purification.
      2. Symbole Rad Isoler les protéines lié drapeau-M2 billes d'agarose dans une micro (1000 xg, 1 min) et jeter le surnageant dans une collection des déchetstube tion.
      3. Symbole Rad Répétez l'3x étape de lavage.
    7. Symbole Rad Après les lavages, remettre en suspension les billes dans une mémoire tampon de rinçage ml de PI (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, dithiothréitol (DTT) 2 mM, Triton 0.02%, de bêta-glycérophosphate 5 mM, Na 3 VO 4 0,1 mM).
    8. Symbole Rad Isoler les protéines liées billes d'agarose drapeau-M2 dans une micro (1000 xg, 1 min) et jeter le surnageant dans un tube de collecte des déchets. Retirez tout excès de tampon.
    9. Symbole Rad Resuspendre les billes dans 40 & mu; l de tampon échantillon SDS de chargement IP (mM pH Tris-HCl 160 6,8 SDS 2%, DTT 0,2 M, glycérol 40%, bleu de bromophénol 2 mg / ml).
      1. Les échantillons peuvent être analysés immédiatement ou stockées dans un congélateur à -20 ° C pour analyse ultérieure.
        1. Symbole Rad Pour le stockage des échantillons à -20 ° C, placer les échantillons dans des supports de tubes ou des boîtes dans une boîte en plexiglas dans un trèfle radioactif marqué congélateur dédié pour le stockage des échantillons radioactifs.
    10. Symbole Rad Éliminer les déchets radioactifs dans des poubelles dédiées qui sont stockés derrière des boucliers en plexiglas.
  2. Symbole Rad Résoudre échantillons IP par SDS-PAGE et blot à membrane de PVDF.
    1. Symbole Rad échantillons de chaleur dans un tampon de chargement à 95 ° C pendant 2 min et centrifuger pendant 1 min à> 1000 xg pour sédimenter les billes.
    2. Symbole Rad Préparer la protéine gel module électrophorèse sur le banc de radioactivité derrière un écran en plexiglas.
    3. Symbole Rad Charger les échantillons sur un 3-8% de gels SDS-PAGE tris-acétate.
      1. Ce type de gel est adapté à la résolution de haut poids moléculaire (HPM) de protéines. D'autres types de gels peuvent également être adaptés, par exemple un gel Bis-Tricine 4-20% ou Tris-glycine 4-20% de gels.
      2. Inclure un marqueur de poids moléculaire qui est approprié pour distinguer les tailles des protéines HMW.
    4. <li> Symbole Rad Effectuer une électrophorèse à 150 V pendant 1 h.
    5. Symbole Rad Après électrophorèse, enlever le gel de son boîtier de plastique et de transférer le gel dans un récipient avec un tampon de transfert Western blot.
      1. Composition du tampon de transfert Western blot: Tris 50 mM, glycine 40 mM, SDS 0,04%, méthanol 20%.
      2. Symbole Rad Couper les parties du gel qui collent à l'extérieur tels que les séparateurs de puits et la partie inférieure du gel qui dépasse.
    6. Préparer un polyfluorure de vinylidène (PVDF) par gel par immersion dans du methanol pendant 1 min, puis mettre dans un tampon de transfert.
      1. Les membranes sont découpées aux s taille ame comme le gel, plus une marge de 3 mm.
    7. Placez un module de transfert semi-sec sur le banc de la radioactivité et retirez le couvercle et la plaque d'électrode supérieure.
    8. Symbole Rad Préparer le sandwich buvard sur la surface du module de transfert semi-sec.
      1. Mouiller une épaisseur supplémentaire (2,5 mm d'épaisseur, 7,5 x 10 cm de large) filtre buvard dans un tampon de transfert et les placer sur la plaque inférieure du module de Blot.
      2. Symbole Rad Placer la membrane de PVDF mouillée pré-filtre sur le buvard.
      3. Symbole Rad Placez délicatement le gel sur la membrane de PVDF et éliminer les bulles d'air.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Terminez le sandwich de transfert en mouillant un filtre supplémentaire buvard épais dans un tampon de transfert et les placer sur la plaque de fond du module buvard. Retirez tout l'air bulles éventuellement présentes dans le sandwich buvard.
        S'il vous plaît noter que la description donnée ici est compatible avec le système SD trans-blot BioRad où des électrodes sont telles que les protéines migrent vers le bas sur la membrane. D'autres systèmes de tamponnement sont également compatibles avec ces étapes avec des adaptations mineures telles que celles éventuellement nécessaire pour prendre en compte une autre direction buvard ou, dans le cas de réservoir blot, déchets liquides supplémentaire pour être éliminés de la même manière que le tampon d'électrophorèse ci-dessus.
    9. Symbole Rad Retirez tout excès de tampon avec un papier absorbant et placer la plaque supérieure et le couvercle de la semi-d ry buvard module.
    10. Symbole Rad Transfert des protéines à 15 V pendant 1-2 heures.
    11. Symbole Rad Pendant ce temps, nettoyez le module d'électrophorèse.
      1. Symbole Rad Éliminer les déchets radioactifs dans des poubelles dédiées qui sont stockés derrière des boucliers en plexiglas.
      2. Symbole Rad Rincez le support d'électrophorèse avec de l'eau distillée (AD) et jeter l'eau de rinçage dans le conteneur de déchets radioactifs liquides.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Après le transfert, retirer la membrane de PVDF avec des protéines effacé du module de Blot.
    13. Symbole Rad Facultatif: réaliser une coloration Ponceau S de protéines transférées pour visualiser les protéines.
      1. Symbole Rad Transférer le blot dans un récipient d'incubation blot peu profond contenant une solution Ponceau S et incuber pendant 5 min.
      2. Symbole Rad Rincer 2x rapidement dans la MA.
    14. Symbole Rad Sécher la membrane.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Effectuer autoradiographie.
    1. Symbole Rad Exposer la membrane à une plaque de phosphorescence pendant 1-5 jours.
    2. Symbole Rad Lire la 32P hors de la plaque de phosphorescence exposée en utilisant un scanner phosphorescence Tempête 840 ou équivalent et enregistrer l'image comme une haute résolution tiff.
  4. Symbole Rad Détecter les niveaux de protéines par immunodétection.
    1. Symbole Rad Réhydrater les membranes en les plongeant brièvement en méthanol, puis transfert à un transfert de récipient d'incubation peu profond avec PBS. Symbole Rad Bloquer les membranes dans du PBS-T (PBS avec 0,1% de Triton) contenant 5% de lait.
    2. Symbole Rad Incuber les taches avec anti-LRRK2 anticorps 13,16 ou anticorps Anti Flag et autre processus avec des étapes de lavage appropriées et incubation d'anticorps secondaire.
    3. Symbole Rad Effectuer une détection de chimioluminescence pour confirmer les niveaux de protéines relatives de LRRK2.
  5. Quantifier l'incorporation de 32 P dans LRRK2.
    1. Effectuer une analyse densitométrique des bandes sur les autoradiogrammes blot et immuno-réactivité en utilisant un logiciel approprié tel que le logiciel ImageJ, un programme freeware disponible sur le Instit nationalLois de site Web de Santé ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Calculer des taux d'incorporation du phosphate comme le rapport du signal autoradiographique dessus du niveau de l'immunoréactivité.

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Representative Results

Afin de comparer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de LRRK1 et LRRK2 dans les cellules, 3xflag marqué LRRK1 et LRRK2 ont été exprimés dans les cellules HEK293T 15. Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 6 puits et marquées au 32 P et analysés comme décrit ci-dessus dans le texte de protocole. Figure 1 montre les résultats représentatifs pour le marquage métabolique des LRRK1 et LRRK2 dans des cellules HEK293T. Radioactifs phosphate incorporation est observée à la fois pour LRRK1 et LRRK2. Lors de la quantification des 32 niveaux normalisés aux niveaux de protéine telle que mesurée par analyse densitométrique de l'immuno-détection avec un anticorps anti-flag P, il a été trouvé que LRRK1 avait un niveau de phosphorylation de la moyenne qui est inférieure à la LRRK2 dans les conditions testées, bien que la signification statistique est pas atteint (P> 0,05).

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Figure 1. D'étiquetage métabolique de LRRK1 et LRRK2. A. LRRK1 et LRRK2 exprimés dans les cellules HEK293T ont été métaboliquement marqués au 32 P comme décrit dans le protocole et les résultats des sections. Représentés ici sont autoradiogrammes représentatives (panneau supérieur) du 32 P incorporation ainsi que les transferts de Western représentatives (panneau inférieur) de LRRK1 et la détection de LRRK2 par leurs balises 3xflag. B. Quantification de l'étiquetage métabolique comparative de LRRK1 et LRRK2 (N = 4).

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Discussion

Ce document fournit un protocole de base pour tester le niveau de phosphorylation général de LRRK1 et LRRK2 dans des lignées cellulaires en utilisant un marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate. La stratégie globale est simple. Affinity LRRK protéines marquées sont exprimées dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après quelques heures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Le marqueur d'affinité (de 3xflag) est ensuite utilisée pour isoler les protéines de LRRK d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie (32 de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots. Ce protocole est à distinguer de protocole pour mesurer au LRRK2tophosphorylation 17 en ce que l'étiquetage des LRRK1 ou LRRK2 est effectuée dans une culture cellulaire plutôt que dans une réaction de phosphorylation in vitro avec des protéines purifiées.

Il convient de noter que le protocole détaillé présenté ici peut être ajustée pour tenir compte de multiples variantes en fonction des besoins expérimentaux. Par exemple, comme l'étiquetage est efficace dans la plupart des lignées cellulaires courantes de laboratoire, ce protocole n'est pas limitée à l'utilisation de la lignée de cellules HEK293T. En outre, d'autres marqueurs d'affinité peuvent être utilisés comme une alternative à 3xflag, tels que HA, myc, V5, la GFP ou autres balises 18 que plusieurs balises peuvent être utilisées pour LRRK1 efficacement immunoprécipitat ou LRRK2. Dans le cas où un anticorps spécifique de la protéine est disponible pour la protéine qui est adapté pour l'immunoprécipitation, comme c'est le cas pour la LRRK2 11, ce qui peut être mis en oeuvre aussi bien. Avec un anticorps spécifique de la protéine de classe d'immunoprécipitation, il est également possible d'effectuer le marquage métabolique des LRRKdes protéines exprimées de manière endogène dans des lignées cellulaires. Dans le cas de la LRRK2, plusieurs anticorps monoclonaux ont été décrits qui peuvent immunoprécipitation de LRRK2 endogène 19. Enfin, le protocole de marquage métabolique, décrite ici pour la LRRK2 LRRK1 et peut également être adapté à toute autre protéine qui peut être immunoprécipitée à partir de lignées cellulaires à l'aide de la stratégie générale décrite ci-dessus.

Un facteur clé avant d'effectuer le marquage métabolique des protéines dans la culture de cellules est de savoir comment cette technique se compare aux autres méthodes permettant de déterminer la phosphorylation de la protéine cellulaire. Par exemple, la phosphorylation à des sites spécifiques peut être suivie par un immunoblot en utilisant un anticorps phospho-spécifique. Ce procédé suit des étapes similaires à celles décrites ici, à l'exception des étapes de marquage isotopique, et, pour cette raison, cette technique est souvent favorisée par rapport à marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate quand elle est disponible. Le marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate fournit un signal qui est représentatif de l'état de phosphorylation globale de la protéine, donc il ne peut pas fournir des informations sur la phosphorylation des sites spécifiques. Pour les protéines avec de multiples sites de phosphorylation, comme cela est le cas pour la LRRK2 10,11, la technique de marquage métabolique fournit une évaluation en une étape du niveau de phosphorylation globale qui peut constatée avec des anticorps phospho-spécifiques dans l'attente d'étapes multiples d'immunodétection. Par exemple, la LRRK2 est hautement phosphorylée dans sa région d'inter-ANK-LRR, à savoir les sites de S910/S935/S955/S973 11,20 ainsi que dans d'autres régions, y compris 10 le site S1292 récemment caractérisé 21. Afin de décortiquer les rôles des phosphosites individuelles, il est recommandé de préférer des expériences avec des anticorps spécifiques phosphosite. Par exemple phosphosite anticorps spécifiques ont permis de discerner que les phosphosites S910/S935/S955/S973 sont déphosphorylerd en plusieurs mutants pathogènes tels que R1441C / G, Y1699C, I2020T, mais pas dans les G2019S 11,22, tandis que la maladie LRRK2 formes mutantes présentent généralement des niveaux élevés de phospho-S1292 21. Toutefois, le marquage métabolique sont utiles pour un certain nombre d'autres études de phosphorylation cellulaire. Le marquage métabolique est toujours une technique applicable par exemple dans le cas de sites de phosphorylation inconnu ou lorsque phospho-anticorps ne sont pas disponibles ou de faible sensibilité. Enfin, le marquage métabolique permet de comparer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de protéines différentes (comme montré ici en comparant les niveaux de phosphorylation cellulaire de LRRK1 et LRRK2, figure 1), un comparateur qui est difficile à faire avec des anticorps spécifiques de phosphosite donné les différences de sensibilité à partir d'un anticorps à l'autre .

En conclusion, le présent Protocole permet une évaluation efficace des niveaux de phosphorylation de l'ensemble des protéines dans les cellules LRRK. Le protocole peut être facilement adapté pour surveillerphosphorylation de toute autre protéine qui peut être exprimée dans des cellules et isolé par immunoprécipitation. L'utilisation de ce protocole est recommandé lorsque des anticorps spécifiques phosphosite ne sont pas disponibles pour la protéine dans l'étude ou comme une étape dans leur validation. Ce protocole est particulièrement utile lorsque le but est de comparer expérimental phosphorylation globale de deux ou plusieurs protéines différentes en tant que telles comparaisons via marquage métabolique sont pas sollicités par des différences dans la sensibilité de détection de la phosphorylation d'une protéine à l'autre. Spécifiquement pour LRRK1 et LRRK2, cette technique peut être utilisée pour surveiller les changements relativement dépendants de l'activité de phosphorylation de LRRK1 et LRRK2, étant donné que ces changements ont commencé à être décrit pour LRRK2 11,13,23, tandis que la réglementation de la phosphorylation LRRK1 est mal comprise.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes également reconnaissants à la Fondation Michael J. Fox soutenir cette étude. Nous remercions la Fondation de la recherche - Flandre FWO (FWO G.0666.09, chercheuse senior pour la communion de JMT), l'IWT SBO/80020 projet Neuro-CIBLE, la KU Leuven (OT/08/052A et IOF-KP/07 / 001) pour leur soutien. Cette recherche a également été soutenu en partie par les Fonds Druwé-Eerdekens gérés par la Fondation Roi Baudouin pour JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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