Metabolisk mærkning af Leucin Rich Gentag Kinaser 1 og 2 med Radioaktivt Fosfat

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er Multidomain proteiner, som koder for både GTPase og kinase-domæner, og som er phosphoryleret i celler. Her præsenterer vi en protokol til at mærke LRRK1 og LRRK2 i celler med 32P orthophosphat, hvilket giver et middel til at måle deres samlede cellulære phophorylation niveauer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) paraloger, der deler en lignende domæne organisation, herunder en serin-threonin kinase domæne, et Ras af komplekse proteiner domæne (ROC), en C-terminal af ROC domæne (COR), og leucin-rige og ankyrin-lignende gentagelser i den N-terminale ende. De præcise cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er endnu ikke klarlagt, men LRRK1 har været impliceret i tyrosinkinasereceptor signalering 1,2, mens LRRK2 er impliceret i patogenesen af Parkinsons sygdom 3,4. I denne rapport præsenterer vi en protokol at mærke LRRK1 og LRRK2 proteiner i celler med 32P orthophosphat, hvilket giver et middel til at måle de overordnede phosphoryle niveauer af disse 2 proteiner i cellerne. I korte træk affinitetsmærkede LRRK proteiner udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et partimers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Via affinitetsmærke (3xflag) de LRRK proteiner isoleres fra andre cellulære komponenter ved immunopræcipitation. Immunpræcipitater separeres derefter via SDS-PAGE, blottet til PVDF-membraner og analyse af de inkorporerede fosfater udføres ved autoradiografi (32P signal) og western detektion (protein signal) af proteinerne på blottene. Protokollen kan let tilpasses til at overvåge phosphorylering af ethvert andet protein, der kan udtrykkes i celler og isoleres ved immunopræcipitation.

Introduction

Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er Multidomain paraloger, der deler en lignende domæne organisation. Begge proteiner koder for et GTPase-sekvens beslægtet med Ras familien af GTPaser (Ras af komplekse proteiner eller ROC) samt en C-terminal ROC domæne (COR), effektivt klassificering begge proteiner til ROCO-proteinfamilien 5,6. N-terminalen af ROC-COR domæne tandem, begge proteiner koder en leucin-rige repeat-domænet samt en ankyrin-lignende domæne, mens kun LRRK2 koder for et ekstra bæltedyr Domein 6-8. C-terminalen af ROC-COR, begge proteiner deler en serin-threonin kinase domæne mens kun LRRK2 koder for et WD40 domæne i C-terminal området 8. De præcise cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er endnu ikke klarlagt, men LRRK1 har været impliceret i tyrosinkinasereceptor signalering 1,2, mens den genetiske beviser peger på en rolle for LRRK2 i patogenesen af Parkinsons sygdom 3,4.

9-11. Selvom LRRK1 cellulære phosphoryleringssites er endnu ikke kortlagt, dokumentation fra undersøgelser ved hjælp phosphoprotein farvning af blots af immunoprecipiteret LRRK1 protein fra COS7-celler tyder på, at LRRK1 protein phosphoryleres i celler 12.

Dette papir giver en grundlæggende protokol for analyse generel fosforylering niveau LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer hjælp metabolisk mærkning med 32P-orthophosphat. Den overordnede strategi er ligetil. Affinitetsmærkede LRRK proteins udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et par timers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Affinitetsmærket (3xflag) anvendes derefter til at isolere LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunopræcipitation. Immunpræcipitater separeres derefter via SDS-PAGE, blottet til PVDF-membraner og analyse af de inkorporerede fosfater udføres ved autoradiografi (32P signal) og western detektion (protein signal) af proteinerne på blottene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuværende protokol anvender radioaktivt 32P-mærket orthophosphat at følge cellulær phosphorylering af LRRK2. Det er vigtigt at huske på, at alle operationer med radioaktive reagenser skal udføres ved hjælp af passende beskyttelsesforanstaltninger for at minimere eksponering af radioaktiv stråling til operatøren og miljøet. Forbindelser, der indeholder isotoper, der udsender ioniserende stråling kan være skadelige for menneskers sundhed og strenge krav om tilladelse og regler på institutionelt og nationalt niveau kontrol deres anvendelse. Eksperimenterne i denne protokol blev udført efter træning i åben brug source stråling ved Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven), og efter retningslinjerne for god laboratoriepraksis af sundhed, sikkerhed og miljø afdeling på universitetet. Flere trin i vores protokol er udbredte, såsom cellekultur, SDS-PAGE, Western blotting og givet her er detaljer i protokollen, som anvendes i vores laboratorium. Det erhould bemærkes, at præcise eksperimentelle betingelser varierer fra laboratorium til laboratorium bør tilpasses derfor specifikke foranstaltninger for at sikre en korrekt håndtering af radioaktivt materiale til hvert nyt laboratorium indstilling.

Brug af open source-stråling er underlagt forudgående myndighedsgodkendelse og det ansvarlige tilsynsorgan for open source-stråling i laboratorieundersøgelser varierer fra land til land. Brugere bør rådføre sig med deres institutionelle strålingssikkerhed officer for at sikre, at procedure i overensstemmelse med de lokale regler og forordninger. Oplysninger om tilsynsmyndigheder kan findes: i Belgien, Forbundsrepublikken agentur for nuklear Kontrol ( http://www.fanc.fgov.be , hjemmeside på fransk eller hollandsk), i Det Forenede Kongerige, Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / stråling / ioniserende / index.htm ), i De Forenede Stater NucLear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), i Canada den canadiske Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), og i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Sikkerhedsforanstaltninger er relevante for denne protokol er blevet bemærket i teksten, fremhævet med det radioaktive kløverblad symbol ( Rad Symbol ).

1.. Metabolisk mærkning af celler

  1. Forbered celler til mærkning.
    1. Kultur HEK293T cellelinier ifølge standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2) i DMEM med 8% føtalt kalveserum og gentamycin.
    2. Expand celler tilstrækkeligt til atopnå mindst 1 x 10 6 celler pr prøve at teste.
    3. Trypsinisér celler og plade ud i 6 brønde (mm diameter 35) ved 10 6 celler / brønd.
    4. 24 timer efter udpladning celler udtrykker 3xflag-LRRK2 protein via transfektion eller lentivirusvektor medieret transduktion.
      1. For transfektion blandes per prøve 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmid 13-15 eller pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmid 15) og 8 pi lineær polyethylenimin (lineær PEI, 1 mg / ml) i 80 pi DMEM (uden tilsætninger ). Lad det komplekse for 15-30 min derefter tilføje kompleks til celler ved at blande godt ind i medium til stede.
      2. For lentivirusvektor medieret transduktion, fortyndes lentivirusvektor kodning 3xflag-LRRK1 eller -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, som en tommelfingerregel, transducere med dobbelt så mange transducerende enheder, dvs antallet af funktionelle vektor partikler, af lentivector som der er celler) i dyrkningsmediet. En beskrivelse af produktet ion LV-3xflag-LRRK1 / 2 er tidligere blevet beskrevet 15.
    5. Når celler er 80-100% sammenflydende (ca. 48 timer efter transfektion eller transduktion), skylles cellerne med forvarmet (37 ° C) DMEM uden fosfater.
  2. Label-celler med 32P-orthophosphat.
    1. Huske på generelle principper for sikkerhed, når du arbejder med stråling.
      1. Rad Symbol Udfør alle operationer med 32 P i et bestemt stråling område.
      2. Rad Symbol Egnede personlige værnemidler bør bæres - under standardprocedure i vores laboratorium disse omfatter kittel, dobbelt handsker og beskyttelsesbriller.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alt arbejde med 32 P skal være afskærmet fra brugere med 6 mm plexiglas skærme for at minimere eksponering.
      4. Rad Symbol Personlig overvågningsudstyr bør altid anvendes - inden KUL alle certificerede open source stråling brugeren bærer en film badge knyttet til brystlommen af ​​kittel til at overvåge stråling under forsøg.
      5. Rad Symbol Alle eksperimentelle overflader bedømmes for radioaktivitet før og efter brug med en geigertæller.
      6. Rad Symbol Alle potentielt forurenede hjælpematerialer skal bortskaffes i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for rabortskaffelse dioactive affald.
    2. Under en laminar strømning, udarbejde et Falcon-rør med 2,1 ml DMEM uden phosphater (forvarmet til 37 ° C) per plade med 6 brønde af celler til etiketten.
      1. For eksempel at mærke cellerne i alle brønde i en 6-brønds plade, forberede 12,6 ml medium (= 6 x 2,1). Dette er for at give 2 ml medium, der skal bruges per 6-brønds plade godt af celler med en 5% overskud i volumen.
    3. Rad Symbol Forbered bænk, hvor forsøgene med ioniserende stråling vil blive udført. Arbejdsgruppen rum er dækket af et udslip måtten, hvorpå en beskyttende foring af absorberende materiale er placeret. Hvis du bruger en liner med en vandtæt overflade, læg den med den absorberende side op.
    4. Rad Symbol Også give mulighed foren plexiglas krukke på arbejdsområdet, og læg slangen af ​​fosfat frit medium i det.
    5. Rad Symbol Tage føringen foret beholder med hætteglasset med 32P mærket orthophosphat ud af køleskabet og bringe det til radioaktiviteten bænken. Overvåg beholderen til ekstern radioaktiv forurening ved hjælp af en geigertæller.
    6. Rad Symbol Fortynd 32P-mærket orthophosphat i røret DMEM uden fosfater i en koncentration på 24 uCi / ml.
      1. Bemærk: ved 2 ml per 6-brønds plade og celler, svarer dette til 5 uCi 32P-mærket orthophosphat / cm 2 af dyrkede celler.
      2. Rad Symbol Holdrøret i Perspex krukken.
    7. Rad Symbol Beholderen lukkes med den resterende del af 32P-mærket orthophosphat og erstatte i køleskabet.
    8. Rad Symbol Fjern de 6-brønds plader med celler, der skal mærkes fra rugemaskinen og sted på radioaktiviteten bænken.
    9. Rad Symbol Fjern mediumsupernatanten og kasseres. Tilsæt 2 ml phosphat-frit medium indeholdende 32P-mærket orthophosphat / brønd.
    10. Rad Symbol Placer dyrkningspladerne i en plexiglas kasse derefter overvåge beholderen for ekstern radioaktiv forurening ved hjælp af en geigertæller.
    11. Rad Symbol Overfør Perspex boks med celler til en eukaryot celle inkubator dedikeret til isotopisk metabolisk mærkning.
    12. Rad Symbol Der inkuberes i 1-20 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
      1. I almindelighed er en inkorporering på cirka 3 timer eller mere anbefales. Den optimale inkubationstid kan vurderes gennem tiden kursus forsøg for hver specifikt protein som ønsket.
    13. Rad Symbol Valgfrit: behandle cellerne med sammensatte.
      1. I forsøg med behandling med forbindelsen (såsom en kinase inhibitor), er trin a behandling med forbindelsen medtaget efter en istartdisplayet inkubationstid uden forbindelse for at tillade mærkning. Efter at den ønskede inkubationstid er det plexiglas kasse indeholdende dyrkningspladerne fjernet fra rugemaskinen, og bragt til radioaktiviteten bænken.
      2. Rad Symbol Mærkning medium fjernet og erstattet af forvarmet phosphat medium, hvori forbindelsen er fortyndet i den ønskede koncentration. Kassér medium i et 50 ml rør til affaldsindsamling, som er anbragt i Perspex krukken.
      3. Rad Symbol Celler udskiftet i Perspex box og anbringes i cellen inkubator for den ønskede kontakttid.
  3. Rad Symbol Saml lysater af Labeledede celler.
    1. Rad Symbol Fjern mediet fra celler og kassér i affaldsindsamling rør, som er anbragt i Perspex krukken.
    2. Rad Symbol Skyl celler 2x med iskold TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / skyl), idet skylning opløsning i en affaldsindsamling rør placeret i plexiglas krukken.
    3. Rad Symbol Tilsæt 0,5 ml iskold immunoprecipitation (IP) lysebuffer til hver brønd og indsamle lysat ved pipettering lysat op og ned for at løsne alle lyserede celler.
      1. Forbered den nødvendige mængde IP lysisbuffer (0,5 ml / prøve plus 5% overskud) i god tid, tilføjer proteasehæmmer cocktail og fosfataseinhibitor cocktail frisk lige før brug.
      2. Sammensætningen af ​​lyseringsbuffer er Tris 20 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glycerol 10%, protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor cocktail.
    4. Rad Symbol Overfør lysatet til et mikrocentrifugerør og inkuber på is i mindst 10 min.
    5. Rad Symbol Centrifuger lysaterne i en mikrocentrifuge ved> 5.000 xg i 10 min.
    6. Rad Symbol Bortskaffelse af radioaktivt affald i dedikerede skraldespande, som er gemt bag plexiglas skjolde.

2. Analyser Mærkning af proteiner af interesse

  1. Rad Symbol Isoler protein af interesse ved immunrensning (IP).
    1. Rad Symbol Overfør mikrocentrifugerør med centrifugerede lysater tilbage til isen og pipettere supernatanten i et mikrocentrifugerør indeholdende 10 pi bed volumen i ligevægt flag-M2 agarosekugler.
      1. Forbered rørene med i ligevægt flag-M2 agarosekugler før tid.
      2. For dette, afpipetteres en mængde flag-M2 agarose gylle svarende til 10 pi bed-volumen per prøve plus en 5% i overskud.
        1. Generelt, 10 pi lejevolumen af ​​perler svarer til 20 pi opslæmning. Der henvises til produktets datablad for flere detaljer.
      3. Ækvilibrer perlerne ved at skylle 3x i 10 bind (i forhold til seng volumen) af IP-lysis buffer.
      4. Fordel ækvilibrerede perler jævnt ved 10 gl seng volumen / rør i lige så mange rør, som der er prøver. Mærk rørene med en identifikator for hver prøve.
    2. Rad Symbol Overfør mikrocentrifugerør til 50 ml rør (ca. 6 mikrocentrifuge tubes/50 ml tube) mærket med et radioaktivt kløverblad symbol og holde på is.
    3. Rad Symbol Overfør prøver til en roterende anordning bag en plexiglas skjold i det udpegede område af et koldt rum til ende over ende blanding ved 4 ° C i 1-20 timer.
    4. Rad Symbol Overfør prøverne til en udpeget arbejde plads på is.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin ned proteinbundet flag-M2 agarosekugler i en mikrocentrifuge (1.000 xg, 1 min) og supernatanten i en affaldsindsamling rør.
    6. Rad Symbol Vask proteinbundne flag-M2 agarosekugler ved opblandes i 1 ml IP vaskebuffer.
      1. Sammensætning IP vaskepuffer: Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 400 mM, Triton 1%. Det anbefales også at omfatte protease og phosphataseinhibitorer i vaskebuffer for proteiner følsomme for nedbrydning af co-rensende proteaser eller dephosphorylation ved co-rensende fosfataser.
      2. Rad Symbol Spin ned proteinbundne flag-M2 agarose perler i en mikrocentrifuge (1.000 xg, 1 min) og supernatanten i et spild indsamtion røret.
      3. Rad Symbol Gentag vasketrinet 3x.
    7. Rad Symbol Efter vask, resuspenderes perlerne i 1 ml IP skyllepuffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, dithiothreitol (DTT) 2 mM Triton 0,02% beta-glycerophosphat 5 mM Na 3 VO 4 0,1 mM).
    8. Rad Symbol Spin ned proteinbundet flag-M2 agarose perler i en mikrocentrifuge (1.000 xg, 1 min) og supernatanten i en affaldsindsamling rør. Fjern al overskydende buffer.
    9. Rad Symbol Resuspender perler ind 40 & mu, l IP prøve SDS loading buffer (Tris-HCI 160 mM pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, glycerol 40%, bromphenol blå 2 mg / ml).
      1. Prøverne kan analyseres straks eller opbevares i en -20 ° C fryser i skjulte analyse.
        1. Rad Symbol Til opbevaring af prøver ved -20 ° C, placere prøver i rør indehavere eller bokse i en plexiglas kasse i et radioaktivt kløverblad symbol mærket fryser dedikeret til opbevaring af radioaktive prøver.
    10. Rad Symbol Bortskaffelse af radioaktivt affald i dedikerede skraldespande, som er gemt bag plexiglas skjolde.
  2. Rad Symbol Løse IP prøver via SDS-PAGE og blot til PVDF-membran.
    1. Rad Symbol Heat prøver i loadingpuffer til 95 ° C i 2 minutter og centrifugeres i 1 minut ved> 1000 xg for at pelletere kuglerne.
    2. Rad Symbol Forbered protein gelelektroforese modul på radioaktivitet bænken bag en plexiglas skærm.
    3. Rad Symbol Load prøver på en 3-8% trisacetatelektroforese SDS-PAGE-geler.
      1. Denne type af gel er velegnet til at løse høj molekylvægt (HMW)-proteiner. Andre gel typer kan også være egnet, såsom en 4-20% Bis-Tricine gel eller Tris-glycin 4-20%-geler.
      2. Omfatter en molekylvægt markør, der er egnet til at skelne størrelser af HMW proteiner.
    4. <li> Rad Symbol Udføre elektroforese ved 150 V i 1 time.
    5. Rad Symbol Efter elektroforese fjerne gelen fra dens plast og overføre gelen til en beholder med Western blotting overføringsbuffer.
      1. Sammensætning af Western blotting transfer buffer: Tris 50 mM, Glycine 40 mM, SDS 0,04%, Methanol 20%.
      2. Rad Symbol Skær de dele af gelen, der stikker ud, såsom såvel separatorer og nederste del af gelen, der stikker ud.
    6. Forbered en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran pr gel ved at dyppe i methanol i 1 min, og derefter placere i overførselsbuffer.
      1. Membraner er skåret til s ame størrelse som gelen plus en margen på 3 mm.
    7. Placer en halvtør blotting modul på radioaktivitet bænken og fjern dækslet og øvre elektrode plade.
    8. Rad Symbol Forbered blotting sandwich på overfladen af ​​den semi-tør blotting modulet.
      1. Fugt en ekstra tyk (2,5 mm tyk, 7,5 x 10 cm store) blotting filter i transfer buffer og sted på bundplade blotting modulet.
      2. Rad Symbol Placer pre-wet PVDF-membran på blotting filteret.
      3. Rad Symbol Placer forsigtigt gel på PVDF membranen og fjerne eventuelle luftbobler.
      4. Fjern al luft 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Gennemfør skamplet sandwich ved fugtning en ekstra tyk blotting filter i transfer buffer og sted på den nederste plade af blotting modulet. bobler kan være til stede i blotting sandwich.
        Bemærk at beskrivelsen her er kompatibelt med BioRad trans-skamplet SD system, hvor elektroderne er sådan, at proteinerne vandrer nedad på membranen. Andre blotting systemer er også kompatible med disse trin med mindre tilpasninger, såsom dem i sidste ende behov for at tage hensyn til en anden blotting retning eller, i tilfælde af tanken blotting, ekstra flydende affald, der skal bortskaffes på samme måde som elektroforese buffer ovenfor.
    9. Rad Symbol Fjern al overskydende buffer med et absorberende væv og placere den øverste plade og låget på semi-d Ry blotting modul.
    10. Rad Symbol Overfør proteiner ved 15 V i 1-2 timer.
    11. Rad Symbol I løbet af denne tid, rense elektroforese modulet.
      1. Rad Symbol Bortskaffelse af radioaktivt affald i dedikerede skraldespande, som er gemt bag plexiglas skjolde.
      2. Rad Symbol Skyl elektroforese modul med destilleret vand (AD) og kassér skyllevandet radioaktiv væske affaldsbeholder.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Efter overførsel, fjernes PVDF membran med blottede proteiner fra blotting modulet.
    13. Rad Symbol Valgfrit: udføre en Ponceau S farvning af duppet proteiner at visualisere proteiner.
      1. Rad Symbol Overfør blot til en lavvandet blot inkubationsbeholderen indeholdende Ponceau S opløsning, og der inkuberes i 5 min.
      2. Rad Symbol Skyl 2x hurtigt i AD.
    14. Rad Symbol Tør membranen.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Udfør autoradiografi.
    1. Rad Symbol Udsætte membranen til en phosphorescens plade for 1-5 dage.
    2. Rad Symbol Læs 32P off af den udsatte fosforescens pladen ved hjælp af en Storm 840 morild scanner eller tilsvarende, og gemme billedet som en høj opløsning TIFF.
  4. Rad Symbol Detect protein niveauer via immunpåvisning.
    1. Rad Symbol Rehydrere membranerne ved at dyppe dem kort i methanol, derefter overføre til en lavvandet skamplet inkubationsbeholderen med PBS. Rad Symbol Blokere membranerne i PBS-T (PBS med 0,1% Triton) indeholdende 5% mælk.
    2. Rad Symbol Inkubér klatterne med anti-LRRK2 antistof 13,16 eller anti flag antistof og proces videre med passende vasketrin og sekundært antistof inkubation.
    3. Rad Symbol Udfør kemiluminescensdetektion at bekræfte de relative proteinniveauer af LRRK2.
  5. Kvantificere inkorporering af 32P i LRRK2.
    1. Udføre densitometrisk analyse af de bands på blottet autoradiogrammerne og immunoreaktivitet bruger passende software såsom ImageJ software, et freeware program til rådighed på det nationale Institter Sundhedsstyrelsens hjemmeside ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Beregn fosfatniveauet inkorporering som forholdet mellem det autoradiografiske signal over immunoreaktiviteten plan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at sammenligne de overordnede phosphoryle niveauer af LRRK1 og LRRK2 i celler, 3xflag tagged LRRK1 og LRRK2 blev udtrykt i HEK293T celler 15. Celler blev dyrket i 6-brønds plader og mærket med 32P og analyseret som beskrevet ovenfor i protokollen tekst. Figur 1 viser repræsentative resultater af metabolisk mærkning af LRRK1 og LRRK2 i HEK293T celler. Observeres radioaktivt phosphat inkorporering for både LRRK1 og LRRK2. Ved kvantificering af de 32P niveauer normaliseret til protein niveauer, som målt ved densitometrisk analyse af immunodetektion med anti-flag antistoffet, blev det konstateret, at LRRK1 havde en gennemsnitlig phosphorylering niveau, som er lavere end LRRK2 under de testede betingelser, selv om statistiske signifikans ikke nået (P> 0,05).

1.jpg "/>
Figur 1.. Metabolisk mærkning af LRRK1 og LRRK2. A. LRRK1 og LRRK2 udtrykt i HEK293T celler blev metabolisk mærket med 32p som beskrevet i protokollen og resultater sektioner. Afbildet her er repræsentative autoradiogrammer (øverste panel) af 32P indarbejdelse samt repræsentative Western blots (nederste panel) af LRRK1 og LRRK2 opdagelse via deres 3xflag tags. B. Kvantificering af den sammenlignende metabolisk mærkning af LRRK1 og LRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir giver en grundlæggende protokol for analyse generel fosforylering niveau LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer hjælp metabolisk mærkning med 32P-orthophosphat. Den overordnede strategi er ligetil. Affinitetsmærkede LRRK proteiner udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et par timers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Affinitetsmærket (3xflag) anvendes derefter til at isolere LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunopræcipitation. Immunpræcipitater separeres derefter via SDS-PAGE, blottet til PVDF-membraner og analyse af de inkorporerede fosfater udføres ved autoradiografi (32P signal) og Western detektion (protein signal) af proteinerne på blottene. Denne protokol skal skelnes fra den protokol, til at måle LRRK2 autophosphorylation 17 i, at mærkningen af LRRK1 eller LRRK2 udføres i cellekultur frem for i en in vitro phosphorylering reaktion med oprensede proteiner.

Det skal bemærkes, at den detaljerede protokol præsenteret her, kan justeres til at passe til flere variationer afhængig af eksperimentelle behov. For eksempel mærkning er effektiv i de fleste almindelige forsøgsdyr cellelinier denne protokol ikke er begrænset til anvendelsen af ​​HEK293T cellelinie. Desuden kan andre affinitetsmærker kan anvendes som et alternativ til 3xflag, såsom HA, myc, V5, GFP eller andre mærker 18 som flere tags kan bruges til effektivt immunopræcipitatet LRRK1 eller LRRK2. I tilfælde af et protein-specifikt antistof er til rådighed for det protein, der er velegnet til immunopræcipitation, som det er tilfældet for LRRK2 11, kan dette gennemføres så godt. Med en immunopræcipitation kvalitet protein-specifikt antistof, er det også muligt at udføre metabolisk mærkning af LRRKproteiner endogent udtrykt i cellelinier. I tilfælde af LRRK2 har flere monoklonale antistoffer er blevet beskrevet, som kan immunfældning af endogent LRRK2 19. Endelig kan metabolisk mærkning protokollen, der er beskrevet her for LRRK1 og LRRK2 også tilpasses til ethvert andet protein, der kan immunopræcipiteret fra cellelinjer ved hjælp af den generelle strategi, der er beskrevet ovenfor.

En vigtig overvejelse, før du udfører metabolisk mærkning af proteiner i cellekultur er, hvordan denne teknik kan sammenlignes med andre metoder til rådighed til at bestemme cellulær proteinphosphorylering. For eksempel kan phosphorylering på specifikke steder overvåges ved immunoblotting under anvendelse af et phospho-specifikt antistof. Denne fremgangsmåde følger lignende skridt til de her beskrevne, bortset isotop mærkning trin, og af denne grund er denne teknik ofte favoriseret over metabolisk mærkning med 32P-orthophosphat, når det er tilgængeligt. Metabolisk mærkning med 32 P-ortofosfat giver et signal, som er repræsentativt for den samlede phosphoryleringstilstanden af ​​proteinet, kan derfor ikke give oplysninger om phosphorylering af specifikke sites. For proteiner med flere phosphoryleringssteder, som det er tilfældet for LRRK2 10,11, den metaboliske mærkning teknik giver en et-trins vurdering af den samlede phosphorylering, hvilket kan fastslås med phospho-specifikke antistoffer kun verserende flere immunodetektions trin. For eksempel LRRK2 er yderst phosphoryleres i sin ANK-LRR interdomain region, dvs S910/S935/S955/S973 11,20 sites samt i andre regioner 10 herunder den nyligt karakteriseret S1292 stedet 21. For at dissekere ud roller enkelte phosphosites, anbefales det at foretrække eksperimenter med phosphosite specifikke antistoffer. For eksempel phosphosite specifikke antistoffer har lov til at udlede, at de S910/S935/S955/S973 phosphosites er dephosphorylererd i flere patogene mutanter såsom R1441C / G, Y1699C, I2020T, men ikke i de G2019S 11,22, mens LRRK2 sygdom mutant former viser generelt højere fosfor S1292 niveauer 21. Men metabolisk mærkning er anvendelige til en række andre studier af cellulær phosphorylering. Metabolisk mærkning er altid en anvendelig teknik for eksempel i tilfælde af ukendte phosphoryleringssites, eller når fosfor antistoffer er ikke tilgængelige eller lav følsomhed. Endelig metabolisk mærkning tillader sammenligning overordnede phosphoryle niveauer af forskellige proteiner (som vist her sammenligne cellulære phosphoryle niveauer af LRRK1 og LRRK2, figur 1), en sammenligning, som er udfordrende at gøre med phosphosite-specifikke antistoffer viste forskelle i følsomhed fra et antistof til et andet .

Konklusionen er, at denne protokol giver mulighed for en effektiv vurdering af de samlede phosphoryle niveauer af LRRK proteiner i cellerne. Protokollen kan let tilpasses til at overvågephosphorylering af ethvert andet protein, som kan udtrykkes i celler og isoleres ved immunopræcipitation. Brug af denne protokol anbefales, når phosphosite-specifikke antistoffer er ikke tilgængelige for proteinet i studiet eller som et skridt i deres validering. Denne protokol er især nyttig, når den eksperimentelle mål er at sammenligne den samlede phosphorylering af 2 eller flere forskellige proteiner som sådanne sammenligninger via metabolisk mærkning ikke er forspændt af forskelle i følsomhed ved påvisning af phosphorylering fra ét protein til et andet. Specifikt for LRRK1 og LRRK2 kan denne teknik bruges til forholdsvis overvåge aktiviteten afhængige ændringer i fosforylering af LRRK1 og LRRK2, givet, at sådanne ændringer er begyndt at blive beskrevet for LRRK2 11,13,23, mens LRRK1 fosforylering regulering er dårligt forstået.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi er også taknemmelig for, at Michael J. Fox Foundation støtter denne undersøgelse. Vi takker Research Foundation - Flandern FWO (FWO projekt G.0666.09, seniorforsker stipendium til JMT) IWT SBO/80020 projektet Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A og IOF-KP/07 / 001) for deres støtte. Denne forskning blev også delvist understøttet af fondens Druwé-Eerdekens forvaltes af Kong Baudouin Foundation til JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430, (910), 405-413 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics